全 文 ：180
宋家乐
(韩国釜山国立大学食品科学和营养学科，韩国釜山 609－735)
摘 要:探讨紫苏籽皮提取物(PSCE)的体外自由基清除能力及其抗癌活性。结果表明，以 DPPH 自由基和羟基自由
基清除实验检测自由基清除能力。MTT法和平板克隆形成实验分别检测体外抗癌活性。PSCE 具有较好的自由基清
除能力，对 DPPH 自由基和羟基自由基的半清除剂量(IC50)分别为 105.53μg /mL 和 269.65μg /mL。同时，PSCE 对
A375SM人黑色素瘤细胞的增殖抑制作用呈浓度和时间依赖关系。
关键词:紫苏籽皮，自由基清除力，抗癌活性
Free radical scavenging activity and
anticancer effect of extract from perilla seed capsule
SONG Jia－ le
(Department of Food Science and Nutrition，Pusan National University，Pusan 609－735，South Korea)
Abstract:To investigate the free radical scavenging activity and anticancer effect of extract from perilla seed
capsule(PSCE)in vitro，free radical scavenging activities were determined by DPPH free radical and hydroxyl free
radical scavenging assay.Anticancer effects of PSCE were determined by MTT test and colon formation assay，
respectively.PSCE had good free radical scavenging activity.The IC50 of against to DPPH free radical and hydroxyl
free radical was 105.53μg /mL and 269.65μg /mL，respectively. In addition，the cell proliferation inhibition activity of
PSCE on A375SM were increased by depending on the treatment times，and dose of PSCE.
Key words:perilla seed capsule;free radical scavenging activity;anticancer activity
中图分类号:TS201.1 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2012)02－0180－03
收稿日期:2011－02－28
作者简介:宋家乐(1983－) ，男，博士研究生，研究方向:分子营养学，
植物化学。
紫苏籽系唇形科(Labiate)一年生草本植物紫苏
(Perilla frutescens Britt var. japonica)的成熟果实。紫
苏籽富含 62%左右的亚麻酸和 10%～15%左右的亚
油酸［1－2］。亚油酸具有抗癌［3］、抗炎［4］、抗过敏［5］等保
健功效。在传统的紫苏油加工过程中，压榨之后所
得的紫苏籽皮常被视为废物丢弃，未能做到综合利
用，浪费巨大且造成了极大的环境污染。研究提示，
紫苏籽皮中存在有丰富的黄酮及多酚类化合物，且
具有很好的抗油脂过氧化作用［6－8］。因此开发紫苏
籽皮中的天然活性成分，探究其自由基清除能力及
其他生物学活性，将为其进一步开发利用提供参考。
本实验旨在考察紫苏籽皮提取物的体外自由基清除
能力和对 A375SM人黑色素瘤的体外增殖抑制效果。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
紫苏籽皮 韩国国立食粮科学院机能性作物部
提供，冷冻干燥后，待用;A375SM人黑色素瘤细胞
购自韩国首尔大学医学部韩国细胞株银行(KCLB) ;
1，1－二苯基 － 2 －三硝基苯肼(DPPH)、三氯乙酸
(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、脱氧核糖、过氧化氢
购自美国 Sigma 公司;DMEM 高糖型细胞培养液、
0.05% Trypsin － EDTA、胎牛血清、MTT 购自美国
Invitrogen公司;其他试剂 均为分析纯，购自韩国
SAMCHUN纯药工业株式会社。
R－114 旋转蒸发仪 瑞士 Buchi 公司;MCO96
二氧化碳细胞培养箱 日本三洋电机株式会社;
VS－15CFN冷冻离心机 韩国 Vision 科学株式会社;
SZ51 体视显微镜 日本奥林巴斯光学株式会社;
Bio－Rad 680 酶标仪 美国 Bio－Rad公司。
1.2 实验方法
1.2.1 紫苏籽皮甲醇提取物(PSCE)的制备 参考文
献［7］中的方法，取适量粉碎后的紫苏籽皮放入索氏
提取器中，200mL石油醚脱脂 6～10h。脱脂残渣按料
液比 1∶10 的比例，以甲醇室温下避光提取 24h。合
并提取液，50℃减压旋转蒸发制备得紫苏籽皮甲醇
提取物(PSCE)。
1.2.2 DPPH 自由基清除实验 96 孔板中加入不同
浓度的提取物 100μL 及浓度为 150μmol /L 的 DPPH
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.02.063
181
溶液 100μL，混匀后，室温下避光反应 30min，540nm
处测定吸光度值。DPPH自由基清除率依下式计算:
清除率(%)=［1－(A样品－A样品空白)/A空白］× 100%
1.2.3 羟基自由基清除实验 取 0.2mL 不同浓度的
样品置于试管中，依次加入 6mmol /L 的脱氧核糖，
3mmol /L 的过氧化氢，20mmol /L 的 PBS(pH 7.4) ，
400μmol /L的氯化铁溶液，400μmol /L 的 EDTA 以及
400μmol /L的抗坏血酸溶液各 0.2mL。37℃水浴培
养 1h，随后加入 1% TBA和 2.8% TCA溶液各 1mL，
90℃水浴中培养 20min。3000r /min 离心 5min 后，取
上清于 532nm处测定吸光度值。
清除率(%)=［(A空白－A样品)/A空白］× 100%
1.2.4 细胞培养及细胞增殖率测定 A375SM 细胞
接种于含 10%胎牛血清和 1%双抗(青－链霉素)的
DMEM高糖型细胞培养液中，每 3d 更换培养基一
次，待用。A375SM细胞按 1 × 104cells /mL 浓度，每
孔 100μL接种于 96 孔细胞培养板，37℃，5% CO2湿
化培养，待细胞完全贴壁后，不同浓度 PSCE 培养
48h，弃孔内培养基并加入 100μL 含 MTT(终浓度
0.5mg /mL)的培养基继续培养 4h。培养结束后弃上
清，每孔加入 100μL DMSO 避光振荡 30min。490nm
处以多孔酶标仪测定 OD值计算细胞增殖率。
细胞生长抑制率(%)= (1 － OD对照 /OD空白)
× 100%
1.2.5 平板集落形成实验 取对数期生长的
A375SM细胞制成 200 个细胞 /mL 的单细胞悬液，接
种于 6 孔细胞培养板中，24h 细胞完全贴壁后，换用
终浓度为 50、100、250、500μg /mL 的 PSCE 样品培养
液继续培养，对照组以不含 PSCE 的培养基培养。
2 周后终止培养，弃孔内培养基，PBS(pH7.4)冲洗
2 次，室温晾干甲醇固定 10min 后，Giemsa 染色
30min，流水冲去多余染液，晾干。解剖镜下计数集
落形成数，含 50 个细胞以上的细胞团计为一个
克隆。
集落形成率(%)=(1 －样品组集落数 /对照组
集落数)× 100%
2 结果与分析
2.1 PSCE对 DPPH自由基的清除能力
DPPH自由基是一种人工合成的性质较稳定的自
由基，其甲醇溶液显紫色。当外源性抗氧化剂存在时，
DPPH自由基的不成对电子对被结合，其原本的紫色
渐渐变成黄色。其颜色变化的程度可间接推测出外源
性抗氧化剂的自由基清除能力强弱。如图 1 所示，
PSCE对 DPPH自由基有较强的清除能力，随着提取物
浓度的增加，清除能力增强。在 PSCE 浓度为
500μg /mL时，对 DPPH 自由基的清除能力为 78.5%，
接近阳性对照组抗坏血酸(ascorbic acid，AA)在 50μg /
mL浓度时的自由基清除率(77.79%) ，但弱于同等浓
度下抗坏血酸的自由基清除能力。同时，PSCE 对
DPPH自由基的半清除剂量 IC50为 105.53μg /mL。
2.2 PSCE对羟基自由基的清除能力
羟基自由基是目前所知性质最为活泼的一类自
由基，可快速攻击生物体内诸如蛋白质、脂类和 DNA
图 1 PSCE对 DPPH自由基的清除能力
Fig.1 The DPPH free radical scavenging activity of PSCE
等生物大分子物质，对机体造成组织损伤，诱发疾
病［9］。如图 2 示，随着 PSCE 浓度的增加，对羟基自
由基的清除效果越强，且显示出剂量效应关系。在
PSCE浓度为 500μg /mL 时，对羟基自由基的清除能
力为 53.88%，接近合成抗氧化剂 BHA 在 100μg /mL
时的羟基自由基清除率(62.64%) ，且低于同等浓度
下 BHA的自由基清除率(76.36%)。PSCE对羟基自
由基的半清除剂量 IC50为 269.65μg /mL。
图 2 PSCE对羟基自由基的清除能力
Fig.2 The hydroxyl free radical scavenging activity of PSCE
2.3 PSCE对 A375SM细胞增殖的抑制作用
急性细胞毒 MTT实验提示 PSCE 能有效地抑制
A375SM癌细胞的生长。结果如图 3 所示，A375SM
癌细胞在经过 24h 处理后，较低浓度下(10μg /mL)
的 PSCE对 A375SM 癌细胞没有明显的细胞毒作用
(P ＞0.05) ，随着 PSCE浓度的增加，细胞毒效果增加明
显，且对癌细胞增殖半抑制浓度 IC50为 1834.62μg /mL。
此外，经较长时间(48h)处理后，结果提示，PSCE 对
A375SM细胞增殖抑制效果呈明显的浓度剂量关系，且
具有统计显著性(P ＜ 0.05)。PSCE 在最高浓度
500μg /mL时的最大抑制率为 64.64%。48h 处理后，
PSCE对 A375SM皮肤癌细胞的增殖半抑制浓度 IC50
为 135.92μg /mL。
2.4 PSCE对 A375SM细胞克隆形成能力的影响
平板克隆形成实验常用于检测抗癌药物对癌细
胞的长程杀伤作用［10］。如表 1 所示，PSCE 能有效地
降低 A375SM 细胞集落的形成。抑制效果在较低浓
度(50μg /mL)时，与对照组比较未显示出明显的抑
制作用(P ＞ 0.05) ;但随着 PSCE 浓度的增加，抑制效
果呈递增趋势，与对照组比较有显著差异(P ＜
0.05)。PSCE对 A375SM 细胞克隆形成半抑制浓度
IC50为 312.68μg /mL。
(下转第 223 页)
223
酸配比，得最佳抑制剂为 1.0%次氯酸钠、3.0%抗坏
血酸和 0.15% L －半胱氨酸配比，色素抑制率为
69.87%，蛋白提取率为 80.06%。
通过本实验得出结论，使用复合酶法提取米糠
蛋白的效果较好，提取出的蛋白颜色较浅，提取率
高，且在以 1.0%次氯酸钠、3.0%抗坏血酸和 0.15%
L－半胱氨酸为复配抑制剂的情况下，色素抑制率为
69.87%，米糠蛋白提取率为 80.06%。
参考文献
［1］陈义勇，王伟，沈宗根，等 .米糠与米糠蛋白深度开发现状
［J］.粮食加工，2006，31(5) :24－28.
［2］陈正行，姚惠源，周素梅 .米蛋白和米糠蛋白开发利用
［J］.粮食与油脂，2002(4) :6－9.
［3］Roberts P J，Simmond D H. Extraction of protein and solid
from wheat bran［J］.Journalof Science Food Agriculture，1985，36
(1) :5－10.
［4］冯磊 .酶法水解米糠纤维以制备保健食品的研究［J］.粮食
与饲料工业，1997(11) :37－39.
［5］葛娜 .酶法提取大米蛋白及其应用的研究［D］.无锡:江南
大学，2006.
［6］何斌，陈功，徐弛 .酶法提取米糠蛋白的研究［J］.四川食品
与发酵，2006，42:16－8.
［7］刘颖，田文娟，马永强 .非蛋白酶提取米糠蛋白的研究
［J］.农产品加工·学刊，2010(10) :20－23.
［8］蔡东联 .对米糠营养价值的再认识［J］.中国食物与营养，
2000(2) :31.
［9］Ravin Gnanasambandam.Protein concentrate from unstabilized
and stabilized rice bran:Reparation and properties［J］.Journal of
Food Science，1995，60(5) :1066－1069.
［10］韩秀丽，张如意，马晓建，等 .米糠的综合利用及其前景
［J］.农产品加工学刊，2007，106(7) :62－64.
［11］R Sengupta.Enzymatic of mustard seed and rice bran［J］.
Journal of American Oil Chemistry Society，1996，73 (6) :
檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾
687－692.
(上接第 181 页)
图 3 PSCE对 A375SM细胞增殖作用
Fig.3 The cell proliferation inhibition activity of
PSCE on A375SM
表 1 PSCE对 A375SM人黑色素瘤细胞克隆形成的影响
Table 1 Effect of PSCE on the colon formation of A375SM
组别
剂量
(μg /mL) 克隆形成数
克隆形成
抑制率(%)
对照组 147.67 ± 2.08 0
PSCE 50 133.00 ± 5.13 10
100 116.33 ± 5.51 21
250 74.33 ± 3.06 50
500 60.67 ± 8.08 59
3 结论
PSCE 具有较好的体外自由基清除能力，其对
DPPH自由基的 IC50为 105.53μg /mL，对羟基自由基
的 IC50为 269.65μg /mL。上述结果提示 PSCE是一种
较好的外源性天然抗氧化剂。此外，急性细胞毒及
慢性细胞毒实验结果都提示，PSCE 在体外对
A375SM人黑色素瘤细胞都具有明显的细胞毒杀伤
作用，且杀伤效果呈时间剂量效应关系。今后应进
一步分离纯化 PSCE 中的具有抗氧化活性的有效成
分，并对其可能存在的抑制黑色素瘤细胞增殖能力
展开分子机制层面的研究。
参考文献
［1］张卫明，石雪萍 .紫苏全草营养成分测定［J］.食品研究与
开发，2009，30(2) :132－134，165.
［2］韩丽，李福臣，刘洪富，等 .紫苏的综合开发利用［J］.食品
研究与开发，2004，25(6) :24－26.
［3］Fritsche K，Johnston P.Effect of Dietary {alpha}－ Linolenic
Acid on Growth，Metastasis，Fatty Acid Profile and Prostaglandin
Production of Two Murine Mammary Adenocarcinomas［J］.J Nutr，
1990，120(12) :1601.
［4］Kakisawa H. Effect of the dietary alphalinoleata / linoleata
balance on leukotricne production and histanmine relese in rats
［J］.Phytochem，1988，27:731.
［5］Horii T，Satouchi K，Kobayashi Y，et al.Effect of dietary alpha
－ linolenate on platelet － activating factor production in rat
peritoneal polymorphonuclear leukocytes［J］. J Immunol，1991，
147(5) :1607.
［6］王天元 .紫苏子种皮抗氧化能力研究［J］.食品科学，2002，
23(1) :131－133.
［7］王天元 .紫苏籽皮提取物中抗氧化性成分及作用研究
［J］.林产化学与工业，2002，22(1) :63－67.
［8］胡晓丹，张德权，杜为民，等 .紫苏提取物对紫苏油抗氧化
作用的研究［J］.食品工业科技，2007，28(8) :118－120.
［9］Spencer J，Jenner A，Aruoma O，et al. Intense oxidative DNA
damage promoted by L－DOPA and its metabolites implications
for neurodegenerative disease［J］. FEBS Letters，1994，353(3) :
246－250.
［10］韩为东，赵亚力，马学斌 .分子生物学基本实验技术
［M］.北京:清华大学出版社，2006.