全 文 ：图 2 壳聚糖射线衍射图
A. 蜣螂壳聚糖 B. 市售虾壳聚糖
图 1 中 3100 cm －1 ～ 3400 cm －1的吸收峰是形成
氢键缔合的-OH伸缩振动吸收峰与-NH的伸缩振动
吸收峰重叠而增宽的多重吸收峰，2920 cm －1 ～ 2873
cm －1为 C-H 两个伸缩振动吸收峰，1650 cm －1左右
为酰胺 I吸收峰。由图可知市售虾壳聚糖较蜣螂壳
聚糖有较大的吸收峰，说明蜣螂壳聚糖分子中作用
力较弱，脱乙酰度较高，溶解性也会随之改善。
由图 2 可知，市售壳聚糖与蜣螂壳聚糖在 10°
和 20°显示出较强的衍射峰，而在其他位置未见明
显的衍射峰，且在 20°时，蜣螂壳聚糖的衍射峰强度
显著低于市售虾壳聚糖的，表明蜣螂壳聚糖的非结
晶性较强，溶解性可能更好。
3 讨论
本研究以蜣螂提取多肽后的药渣为原料，采用
正交试验法优选了壳聚糖的制备工艺，经验证该工
艺稳定可行，并通过 IR和 XRD等表征，初步表明蜣
螂壳聚糖在脱乙酰度、黏度、溶解性等方面优于市售
虾壳聚糖，为优质壳聚糖的来源增加了更多的选择，
达到了综合利用昆虫类中药的目的。后期将在此基
础上开展蜣螂壳聚糖药用辅料的适宜性研究，并对
壳聚糖制备过程中产生的废酸液、废碱液、废渣进行
循环利用，以制备高附加值的黑色素、氨基酸螯合钙
等产物，从而全面实现昆虫类中药的综合利用，促进
中药的可持续发展。
参 考 文 献
［1］ Pillai CKS，Paul W，Chandra P，et al. Chitin and chitosan
polymers:Chemistry，solubility and fiber formation ［J］.
Prog Polym Sci，2009，34(7) :641-678.
［2］ Dash M，Chiellini F，Octenbrite RM，et al. Chitosan-A ver-
satile semi-synthetic polymer in biomedical applications
［J］. Prog Polym Sci，2011，36(8) :981-1014.
［3］唐义宝，谢晶 . 虾壳、虾头中甲壳素和壳聚糖的制备与
应用［J］.山西农业科学，2010，38(10) :55-59.
［4］王稳航，刘安军，黄 巍，等 . 卤蝇蛆壳甲壳素的提取及
壳聚糖的制备工艺［J］.食品与发酵工业，2003，29(6) :
18-22.
［5］王 敦，胡景江，刘铭汤 . 从臭蜣螂中提取甲壳素 /壳聚
糖的研究［J］.林业科学，2004，40(5) :180-185.
［6］詹永乐，黄春芳，陈复生 . 家蚕蛹皮制取壳聚糖的最佳
工艺条件［J］.化学通报，2001，11(7) :450-453.
［7］马家骅，谭承佳，衣文娇，等 . 基于有效组分检测与理化
表征相结合的蜣螂有效部位制备工艺研究［J］. 中国中
药杂志，2010，35(9) :1123-1126.
［8］白秀峰 . 生物药物分析［M］. 北京:中国医药科技出版
社，2002:285-286.
收稿日期:2012-04-10
基金项目:北京中医药大学自主课题资助(522 /0100601058)
作者简介:刘颖(1979-) ，女，在读博士研究生，讲师，研究方向:分子生药学;Tel:010-84738646，E-mail:liuyliwd@ vip. sina. com。
* 通讯作者:白根本，Tel:010-84738646，E-mail:baigb@ 263. net。
·资源·
HQT基因在忍冬不同器官中的相对表达量研究
刘 颖，彭小小，朱莎莎，白根本*
(北京中医药大学中药学院，北京 100102)
摘要 目的:对忍冬不同器官，即花蕾、叶和茎中 HQT(hydroxycinnamoyl CoA quinate hydroxycinnamoyl transfer-
ase)基因的相对表达量进行研究，以揭示 HQT基因与忍冬绿原酸生物合成之间的相关性。方法:利用半定量 RT-
PCR方法对忍冬不同器官中的内参 Actin 基因以及 HQT 基因进行测定，通过琼脂糖凝胶电泳对 PCR 结果进行分
析。结果:忍冬不同器官中 Actin基因条带亮度比较接近，而 HQT基因条带亮度差异较大，花蕾中 HQT基因条带最
亮，叶中次之，而茎中 HQT 基因条带非常微弱。此结果与绿原酸在忍冬不同器官中的含量相一致。结论:忍冬
HQT基因的表达与绿原酸的合成之间可能存在有必然的联系。
关键词 忍冬;金银花;HQT;RT-PCR;绿原酸
中图分类号:R282. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2012)07-1032-05
·2301· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 35 卷第 7 期 2012 年 7 月
DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2012.07.005
Researches on the Relative Expression of HQT Gene
in Different Organs of Lonicera japonica
LIU Ying，PENG Xiao-xiao，ZHU Sha-sha，BAI Gen-ben
(School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China)
Abstract Objective:To reveal the correlation between HQT gene and the biosynthesis of chlorogenic acid in Lonicera
japonica. Methods:RT-PCR was used to measure the relative expression of HQT gene and reference gene Actin，and agarose gel electro-
phoresis was used to analyse the PCR results. Results:The brightness of Actin gene strips of different organs was properly similar to
each other，but the brightness of HQT gene strips was significantly different. HQT gene strips of alabastrum were the brightest，the
brightness of HQT gene strip of leaves took the second place，and the brightness of HQT gene strips of stems was very faint. This result
was in accordance with the content of chlorogenic acid in different organs of Lonicera japonica. Conclusion:The expression of HQT gene
with the biosynthesis of chlorogenicacid has necessary relation with Lonicera japonica.
Key words Lonicera japonica Thunb;Lonicerae Japonicae Flos;HQT;RT-PCR;Chlorogenic acid
常用中药材金银花为忍冬科植物忍冬 Lonicera
japonica Thunb. 的干燥花蕾或带初开的花，具有清
热解毒、凉散风热、广谱抗菌及抗病毒等功效，得到
了广泛的应用〔1〕。有机酸类被认为是金银花清热
解毒的药理基础，而目前又常以绿原酸(chlorogenic
acid，CGA)作为金银花的质量控制指标。
据报道〔2-4〕，绿原酸的可能合成途径有 3 条，其
中通过 HQT (hydroxycinnamoyl CoA quinate hydroxy-
cinnamoyl transferase)合成绿原酸的途径为其主要
的合成途径。研究发现，在多种植物体内 HQT 表达
量的增减往往伴随着绿原酸含量的升降〔5，6〕。
然而在中药材金银花中，绿原酸生物合成方面
的研究却鲜有报道。本论文在前期工作的基础
上〔7，8〕，进一步对忍冬绿原酸合成的关键酶基因
HQT进行了深入研究，测定了忍冬不同器官中 HQT
基因的相对表达量，为忍冬中绿原酸代谢途径的明
确以及金银花药材质量的提高提供了必要的理论依
据。
1 材料与仪器
1. 1 材料 本实验室于 － 80 ℃条件下保存的忍
冬花蕾、叶和茎的 cDNA。
1. 2 仪器 Thermo Cell 恒温金属浴(BIOER 公
司) ;SIGMA3K-15 低温高速离心机(德国 SIGMA 有
限公司) ;JS-680B 全自动凝胶成像分析仪(上海培
清科技有限公司) ;Anke TGL-16G离心机;水平电泳
槽(北京六一仪器厂) ;SANYO-80 ℃超低温冰箱;
TECHNE TC-3000 PCR 扩增仪;Bio-Rad 电泳仪;
QILINBEIER TS-1 脱色摇床;GRANT 制冰机，超纯
水制备系统。
1. 3 试剂 除菌超纯水;50 × TAE(242g Tris，
57. 1 mL 冰醋酸，200 mL 0. 5M EDTA (pH8. 0) ) ;
0. 5 μg /mL EB染液;6 × Loading buffer (Takara) ;电
泳级琼脂糖 (西班牙) ;Takara Taq。DNA 胶回收试
剂盒、小型质粒提取试剂盒、核酸分子量标准样购于
北京博迈德科技发展有限公司;LB 培养基所需试
剂 Trytone，Yeast Extract，NaCl及 X-gal，IPTG和氨苄
青霉素，均为 BBI 公司产品，购于上海生工生物工
程公司;异丙醇、氯仿、乙醇等试剂均为分析纯，购于
北京汇海科仪有限公司。
2 方法
2. 1 RT-PCR中内参 Actin基因扩增引物的设计及
PCR扩增 由于忍冬科植物未见 Actin 基因序列报
道，所以在 GenBank中搜索与忍冬亲缘关系相对较
近植物的 Actin序列，根据序列比对，设计出简并引
物 Actin-S:TTTGCYGGWGATGATGCTCC 和 Actin-
A:TCCATRTCATCCCAGTTGCT，引物顺序为 5-3，
扩增的目的片段长度为 189 bp。PCR 扩增的体系
为:50 μL 的反应体系中，含 rTaq (5 U /μL)0. 25
μL;10 × buffer5 μL;dNTP (2. 5 mM each)4 μL;
MgCl2(25 mM)5 μL;模板 cDNA1 μL;Actin-S (10
μM)1. 5 μL;Actin-A (10 μM)1. 5 μL;无菌水 31. 75
μL。PCR反应条件为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变
性 30 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共进行 35
个循环;72 ℃延伸 7 min。
2. 2 RT-PCR 中 HQT 扩增引物的设计及 PCR 扩
增 根据获得的金银花 HQT cDNA 序列，设计一对
特异引物 HQT-RT-F:ACCACCCTCAAGGCGAAAG
(5-3)和 HQT-RT-R:CAAAATCCGCATCGTGAACT
(5-3)来进行半定量 RT-PCR，扩增的目的片段长
度为 439 bp。PCR 扩增体系为:50 μL 的反应体系
中，含 rTaq (5 U /μL)0. 25 μL;10 × buffer5 μL;
dNTP (2. 5 mM each)4 μL;MgCl2(25 mM)5 μL;模
板 cDNA1 μL;HQT-RT-F(10 μM)1. 5 μL;HQT-RT-
R(10 μM)1. 5 μL;无菌水 31. 75 μL。PCR 反应条
件为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 30 s，53 ℃退火
30 s，72 ℃延伸 30 s，共进行 35 个循环;72℃延伸
·3301·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 35 卷第 7 期 2012 年 7 月
7min;
2. 3 基因片段的回收、与载体连接、转化及测序
上述“2. 1”及“2. 2”项中的 PCR 扩增产物经琼脂糖
凝胶电泳检测后，用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进
行回收，然后连入 pEASY-T1 载体中进行 TA 克隆，
获得重组质粒，转化 E. coli DH5α感受态细胞，在含
有氨苄青霉素的 LB平板上筛选阳性克隆。PCR 检
测为阳性的菌液取至少 3 个直接送样，测序由上海
生工生物工程有限公司完成，同时留 500 μL菌液加
等体积 30%的甘油，－ 80 ℃长期保存。
2. 4 Actin 扩增平台期循环条件优化 半定量 RT-
PCR的扩增循环数必须在对数范围内，这样才能保
证扩增条带的亮度与模板起始量成正相关性。以不
同循环数(23，26，29，32，35)进行 Actin 片段扩增，
扩增体系和条件同上;琼脂糖凝胶电泳分析;利用
Gel-Pro Analyzer version 4. 0 对条带进行光密度值分
析。
2. 5 HQT 扩增平台期循环条件优化 HQT 扩增
循环数设计为(26，29，32，35，38) ;琼脂糖凝胶电泳
分析;利用 Gel-Pro Analyzer version 4. 0. 对条带进行
光密度值分析。
2. 6 Actin 与 HQT 同管扩增实验 PCR 引物同
“2. 1”及“2. 2”项中 Actin 与 HQT 引物。PCR 扩增
体系为:50 μL 的反应体系中，含 rTaq (5 U /μL)
0. 25 μL;10 × buffer5 μL;dNTP (2. 5 mM each)4
μL;MgCl2(25 mM)5 μL;模板 cDNA1 μL;HQT-RT-
F(10 μM)1. 5 μL;HQT-RT-R(10 μM)1. 5 μL;Ac-
tin-S (10 μM)1. 5 μL;Actin-A (10 μM)1. 5 μL;无
菌水 28. 75 μL。PCR 反应条件为:94 ℃预变性 5
min;94 ℃变性 30 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30
s，共进行 35 个循环;72 ℃延伸 7 min。
2. 7 忍冬不同器官中 HQT基因的半定量 RT-PCR
根据上述实验结果，采取同批异管扩增，Actin 采
用 29 个循环，HQT则采用 32 个循环，每个器官 4 个
重复。PCR引物及 PCR扩增体系同“2. 1”及“2. 2”
项。PCR反应条件为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变
性 30 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共进行 29
(Actin)或 32(HQT)个循环;72 ℃延伸 7 min。
3 结果
3. 1 内参 Actin 片段的扩增 利用设计的简并引
物 Actin-S和 Actin-A进行 PCR，获得了接近 200 bp
大小的片段，与预计大小相吻合，见图 1。将所得片
段进行测序，序列翻译成氨基酸序列，在 NCBI 上进
行 BLAST同源搜索，所得的同源序列均为其他物种
的 Actin序列，确定了所扩增到的片段为 Actin片段。
图 1 内参 Actin基因琼脂糖凝胶电泳结果
3. 2 HQT片段的扩增 利用设计的引物 HQT-RT-
F和 HQT-RT-R进行 PCR，获得了接近 400 bp ～ 500
bp大小的片段，与预计大小相吻合，见图 2。将所得
片段进行测序，序列与已经获得的 HQT 序列相同，
确定了所扩增到的片段为 HQT片段。
图 2 HQT基因琼脂糖凝胶电泳结果
3. 3 Actin扩增平台期循环数的确定 Actin 片段
在不同的扩增循环数后合成的产量明显不同，在 23
个循环时，产物很难被检测到，随着循环数增加，产
量逐渐增大，在 26 ～ 32 个循环之间，产物呈指数增
长，当循环数大于 32 时，产物产量增加不明显，见图
3 及图 4。
图 3 不同循环数 Actin片段 PCR结果
3. 4 HQT 扩增平台期循环数的确定 HQT 片段
在不同的扩增循环数后合成的产量明显不同，在 26
·4301· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 35 卷第 7 期 2012 年 7 月
个循环时，产物很难被检测到，随着循环数增加，产
量逐渐增大，在 26 ～ 35 个循环之间，产物呈指数增
长，当循环数大于 35 时，产物产量不再增加，见图 5
及图 6。
图 4 Actin循环数与 PCR产物光密度值的关系图
图 5 HQT不同循环数 PCR产物电泳图
图 6 HQT循环数与 PCR产物光密度值的关系图
3. 5 Actin 与 HQT 同管扩增实验 当 Actin 与
HQT进行同管扩增时，HQT的扩增效率相对于单独
扩增大大降低，而 Actin 的扩增效率变化不大，见图
7。根据此结果，本实验采取 Actin与 HQT同批异管
扩增的方法。
图 7 同管扩增和异管扩增的比较
3. 6 忍冬不同器官 HQT基因的半定量 RT-PCR
图 8 和图 9 中可清晰看到，忍冬不同器官的 Actin条
带亮度比较接近，而 HQT 基因亮度差异较大，花蕾
中 HQT条带最亮，叶中次之，而茎中 HQT条带非常
微弱。此结果表明 HQT基因在花蕾中表达量最高，
叶中次之，而在茎中表达量非常低，且 4 个重复实验
结果一致。
图 8 忍冬不同器官 HQT基因的半定量 RT-PCR电泳图
注:以 Actin为内参，F代表花蕾，L代表叶，S代表茎
图 9 忍冬不同器官 HQT基因的相对表达量
注:F代表花蕾，L代表叶，S代表茎
4 小结
根据 NCBI上报道的其他物种的 Actin 序列，设
计了扩增忍冬 Actin 片段的简并引物，成功获得并
首次报道了忍冬 Actin 的片段序列，大小接近 200
bp。利用已获得的 HQT 基因 cDNA 序列设计了一
对用于 RT-PCR 的特异引物，产物长度 400 ～ 500
bp，是进行 RT-PCR分析的适合长度。由于 Actin为
管家基因，其在不同的组织中稳定高效表达，所以选
择其作为 RT-PCR 内参。根据循环条件优化，选择
29 个循环作为 Actin的扩增循环数，选择 32 个循环
作为 HQT的扩增循环数。由于 HQT在同管扩增时
其效率大大低于单独扩增的效率，因此本实验最终
选择同批异管扩增的实验方法。
最终的实验结果表明，在 Actin 条带趋于一致
的情况下，花蕾来源的样品 HQT 条带最亮，叶来源
的次之，而茎来源样品 HQT 条带很弱，表明了 HQT
基因在花蕾中表达量最高，而在茎中表达量非常低。
Chen ZH〔9〕的研究结果表明，绿原酸在花蕾中含量
最高，达到 1. 923%;叶中次之，为 0. 861%;而茎中
绿原酸含量很低，仅为 0. 069%。这与本实验所得的
HQT基因的表达分布相吻合，说明了忍冬 HQT 基因
的表达与绿原酸的合成之间可能存在有必然的联系。
参 考 文 献
［1］国家药典委员会 . 中华人民共和国药典［S］. 一部 . 北
京:中国医药科技出版社，2010:205-206.
［2］ Niggeweg R，Michael AJ，Martin C. Engineering plants with
increased levels of the antioxidant chlorogenic acid［J］.
Nat Biotechnol，2004，22:746.
·5301·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 35 卷第 7 期 2012 年 7 月
［3］ Comino C，Lanteri S，Portis E，et al. Isolation and function-
al characterization of a cDNA coding a hydroxycinnamoyl-
transferase involved in phenylpropanoid biosynthesis in Cy-
nara cardunculus L. ［J］. BMC Plant Biol，2007，7:14.
［4］ Levy CC，Zucker M. Cinnamyl and pcoumaryl esters as in-
termediates in the biosynthesis of chlorogenic acid［J］. J
Biol Chem，1960，235:2418.
［5］ Rommens CM，Richael CM，Yan H，et al. Engineered n-
ative pathways for high kaempferol and caffeoylquinate pro-
duction in potato［J］. Plant Biotechnol J，2008，6:870.
［6］ Cle C，Hill LM，Niggeweg R，et al. Modulation of chloro-
genic acid biosynthesis in Solanum lycopersicum;conse-
quences for phenolic accumulation and UV-tolerance［J］.
Phytochemistry，2008，69:2149.
［7］ Xiaoxiao Peng，Weidong Li，Wenquan Wang，et al. Identifi-
cation of Lonicera japonica by PCR-RFLP and Allele-Spe-
cific Diagnostic PCR Based on Sequences of Internal Tran-
scribed Spacer Regions［J］. Planta Med，2010，76:497.
［8］ Xiaoxiao Peng，Weidong Li，Wenquan Wang，et al. Cloning
and characterization of a cDNA coding a hydroxycinnamoyl-
CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase involved in chlo-
rogenic acid biosynthesis in Lonicera japonica［J］. Planta
Med，2010，76:1921.
［9］ Chen ZH. Analysis of the Chlorogenic acid content in flow-
er buds，stems and leaves of Lonicera japonica［J］. Chinese
Clinical New Medicine，2006，6:354.
湖北恩施产厚朴叶形变化与药材质量的关系初探
杨红兵，石 磊，余捷婧，李明明
(湖北中医药大学药学院，湖北 武汉 430065)
摘要 目的:探索湖北恩施产厚朴叶形变化与药材质量的关系。方法:采用高效液相色谱法测定厚朴酚、和厚
朴酚含量，流动相为甲醇-水(78∶ 22) ，检测波长为 294 nm。结果:叶先端凸尖者、叶片短小者，厚朴叶的酚含量通常
较高;在一定年限之内，树皮较厚者，厚朴皮的酚含量较高。结论:湖北恩施产厚朴叶形变化与叶自身酚含量的高
低直接相关，与药材质量关联性不强。
关键词 厚朴;厚朴酚;和厚朴酚;含量
中图分类号:R284. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2012)07-1036-04
The Relationship between the Quality and the Leaf Shape of
Magnolia officinalis Produced in Hubei Enshi
YANG Hong-bing，SHI Lei，YU Jie-jing，Li Ming-ming
(School of Pharmacy，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，China)
Abstract Objective:To reveal the relationship between the quality and the leaf shape of Magnolia officinalis produced in Hubei
Enshi. Methods:Determined the content of magnolol and honokiol by HPLC with methanol-water (78∶ 22)and the detective wavelength
was 294 nm. Results:The content of magnolol and honokiol in the leaf of Magnolia officinalis was usually higher if the leaf apex was
convex and the leaves were short. In certain years，the content of magnolol and honokiol in Cortex Magnoliae officinalis was positively
correlated with the bark thickness. Conclusion:The leaf shape of Magnolia officinalis produced in Hubei Enshi is directly related to the
phenolic content of leaf itself. But it has nothing to do with the content of magnolol and honokiol in Cortex Magnoliae officinalis.
Key words Magnolia officinalis Rehd. et Wils;Magnolol;Honokiol;Content
收稿日期:2011-10-18
作者简介:杨红兵(1963-) ，男，副教授，研究方向:中药品种、质量与资源研究;Tel:15335896488，E-mail:yanghb321@ 126. com。
中药厚朴来源于木兰科植物厚朴(Magnolia of-
ficinalis Rehd. et Wils. )及其变种凹叶厚朴(M. offi-
cinalis Rehd. et Wils. var. biloba Rehd. et Wils. )的
树皮。前者为传统道地药材，道地产区为湖北、四川
等地;后者分布在湖南、江西等地。厚朴与凹叶厚朴
原植物的区别在于前者叶先端具短急尖、微凸或圆
钝，后者凹缺成 2 个钝圆的浅裂片。近年来，湖北恩
施产厚朴部分树叶先端凹凸共存，出现所谓“中间
型”〔1〕的情况。为研究叶形变化对道地厚朴药材的
生产的影响，该文在分析恩施产厚朴叶与厚朴皮的
酚含量情况的基础上，对恩施产厚朴的叶形(叶先
端形状、叶片大小等)变化与其药材质量的关系进
行了初步考察，结果报告如下。
1 仪器与试药
·6301· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 35 卷第 7 期 2012 年 7 月