全 文 ：[ 收稿日期] 2007-12-20
[ 基金项目] 国家科技部攻关项目(2004BA721A24)
[ 作者简介] 王婷(1983-),女 ,山东济南人 ,山东中医药大学中
药学专业硕士研究生。
[ 通讯作者] 周凤琴(1951-),女 ,山东临沂人 , 教授 ,博士研究
生导师 , Tel:13553190263 , E-mail:zfqsdzy@yahoo.com.cn
　　·中药研究·
忍冬叶片基因组 DNA的提取与分析
王　婷1 ,李爱贤2 ,郭庆梅1 ,李　佳1 ,韩琳娜1 ,周凤琴1
(1.山东中医药大学 , 山东 济南 250355;2.山东省农业科学院 作物所 ,山东 济南 250100)
　　[ 摘要] 目的:获取高质量的忍冬基因组 DNA 。方法:采用改良 CTAB 法从忍冬叶片中提取 DNA , 通过琼脂糖
凝胶电泳 、紫外分光光度法 、酶切检测其质量 , 并与常规 CTAB 法比较。结果:改良 CTAB 法所得 DNA 优于常规
CTAB 法 ,电泳条带清晰 ,完整性好 , 纯度高 ,能被完全酶切。结论:改良 CTAB法适合忍冬基因组 DNA 的提取。
[ 关键词] 忍冬;基因组 DNA;改良 CTAB 法
[ 中图分类号] R284.2　　　　[ 文献标识码] A　　　　[ 文章编号] 1007-659X(2008)03-0247-03
Extraaction and analysis of genomic DNA from leaves of Lonicera japonica Thunb.WANG Ting1 , L I Ai-xian2 , GUO
Qing-mei1 , L I Jia1 , HAN Lin-na1 , ZHOU Feng-qin1(1.Shandong University o f TCM , Jinan 250355 , China;2.Crop Sci-
ence Research Institute of Shandong , Jinan 250100 , China)
[ Abstract] Objective:To obtain high quality genomic DNA of Lonicera japonica Thunb..Method:Tw o different meth-
ods , conventional CTAB method and modified CTAB method , were applied to ex tract genomic DNA from leaves of
Lonicera japonica Thunb..The DNA obtained w as analyzed by the means of agarose gel electrophoresis , ultraviolet spec-
tropho tometric method and enzymatic digestion.Result:Higher purity DNA was obtained by modified CTAB me thod and
it can be digested by restriction enzyme completely.Conclusion:The modified CTAB method was favourable for the ex-
traction o f g enomic DNA from Lonicera japonica Thunb..
[ Key words] Lonicera japonica Thunb.;genomic DNA;modified CTAB method
　　金银花是山东重要的道地药材 ,其原植物为忍
冬科植物忍冬 Lonicera japonica Thunb.,已有 300
余年的栽培历史。长期的自然进化与人工选择 ,使
忍冬的种质发生了明显的变异与分化 ,形成了很多
农家品种或品系。为了综合评价忍冬的种质资源 ,
有必要在分子水平上对其遗传多样性进行分析 ,而
基因组 DNA的成功提取是进行分子生物学研究的
前提 。有关忍冬分子生物学方面的研究已有报
道[ 1 ～ 3] , 但如何提取高质量的 DNA , 以及进行
AFLP 等要求较高的实验研究尚未见报道。植物细
胞富含多糖 、多酚等次生代谢产物 , 这些物质与
DNA的不可逆结合会严重影响下游操作 ,而目前尚
无通用的植物 DNA 提取方法 ,需视材料情况进行
探索 。作者尝试改良 CTAB 法从忍冬叶片中抽提
DNA ,并与常规 CTAB法比较 ,获得了成功 ,为后续
分子生物学的研究奠定了良好的基础 。
1　仪器与试剂
1.1　仪器
高速冷冻离心机(德国 KENDRO);UV-2102
PC型紫外可见分光光度计(美国 UN ICO);DYY-12
型电脑三恒多用电泳仪(北京市六一仪器厂);SYN-
GENE紫外凝胶成像仪(英国 SYNGENE);PCR扩
增仪(德国 Eppendorf)。
1.2　试剂
琼脂糖(Biowest);CTAB(Sangon);EDTA 、Tris
(BBI);EcoRⅠ 、M se Ⅰ(NEB);DNA M arker DL2000
(TaKaRa);其余试剂均为国产分析纯 。
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第 32 卷　第 3 期
2008 年 5 月 　　　　　　　　　
山东中医药大学学报
JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY OF TCM
　 　　　　　　　　Vol.32 , No.3
May.2008
DOI :10.16294/j.cnki.1007-659x.2008.03.029
2　材料与方法
2.1　材料
于 2006年 10月取自山东平邑 ,经山东中医药
大学周凤琴教授鉴定为忍冬科植物忍冬 Lonicera
japonica Thunb.。取枝条扦插后萌发的幼叶 ,分别
用 70%乙醇 、蒸馏水清洗后吸水纸吸干备用。
2.2　方法
2.2.1　常规 CTAB法　参考文献[ 4]方法 。
2.2.2　改良 CTAB法　参考文献[ 5]方法并作适当
修改。取幼叶0.2 g于预冷研钵中 ,加入少量 PVP
粉末 ,液氮保护下研成细粉后立即加入1 ml S TE
[ 100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),50 mmol/L EDTA
(pH 8.0), 700 mmol/ L NaCl]核分离缓冲液 ,迅速
研磨成 匀浆 , 小 心转 入 2 ml 离心 管 中。 4℃
4 000 r/min离心10 min ,弃上清。加入65 ℃预热的
2×CTAB[ 2%(W/V)CTAB , 100 mmol/ L Tris-HCl
(pH 8.0), 20 mmol/ L EDTA(pH 8.0), 1.4 mol/L
NaCl ,5% PVP(W/V), 2%β-巯基乙醇(V/V)] 提
取缓冲液600 ml混匀 , 65 ℃水浴1 h ,期间轻缓摇动
数次 。水浴后冷却至室温 ,加入600 μl氯仿∶异戊醇
(24∶1), 轻轻颠倒混匀 , 12 000 r/min室温离心
10 min。取上清液至另一管中 ,加入 1/10体积预热
的 CTAB/NaCl[ 10%(W/V)CTAB , 0.7 mol/L Na-
Cl] ,混匀 ,再加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1),轻轻
颠倒混匀 ,12 000 r/min室温离心10 min 。重复抽提
1 ～ 2 次 , 取上清 , 加入 1/10 体积3 mol/L NaAC
(pH 5.2)混匀 ,再加入1 ml预冷的无水乙醇 ,可见白
色丝絮状沉淀析出。用灭菌枪头将沉淀物挑入一新
离心管中 ,用1 μl 70%乙醇清洗两次 ,室温干燥后溶
于 600μl TE [ 10 mmol/ L Tris-HCl (pH 8.0),
1 mmol/ L EDTA(pH 8.0)] 中 , 加入 1 μl RNase
(10 mg/ml)酶液37℃消化1 h。加入等体积的氯仿∶
异戊醇(24∶1)轻轻颠倒混匀 , 室温放置10 min ,
12 000 r/min室温离心10 min 。取上清 ,加入 1/10
体积3 mol/L NaAC(pH 5.2)混匀 ,再加入 2倍体积
预冷的无水乙醇 , -20℃放置30 min。10 000 r/min
室温离心10 min ,弃上清 ,沉淀用1 ml 70%乙醇洗
两次 ,室温干燥后溶于适量 TE 中 , -20℃保存备
用 。
2.3　DNA质量鉴定
2.3.1　纯度检测　取3 μl DNA样品稀释1 000倍 ,
在紫外分光光度计上测定260 nm , 280 nm处的吸光
度 ,根据 A260 nm/A280 nm的比值判断 DNA纯度 。
2.3.2　电泳检测　取5 μl DNA 样品在 1.0%琼脂
糖凝胶(含 EB)上电泳 ,在 SYNGENE 型凝胶成像
系统下观察 、拍照 。
2.3.3 　酶切检测 　20μl反应体系中 , 模板
DNA 400 ng ,限制性内切酶 EcoRⅠ 、M se Ⅰ各5 U ,
10×NEB buffer 2 μl ,100×BSA 0.2 μl ,以双蒸水补
足 。PCR 仪中37℃保温6 h , 72℃ 20 min灭酶活 ,
1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果 。
3　结果与分析
3.1　纯度检测
改良 CTAB法能有效去除细胞内杂质 ,防止多
酚氧化 ,得到的 DNA 沉淀为白色 ,干燥后无色透
明;而常规 CTAB 法所得 DNA 呈黄白色至棕黄色
胶状 , TE较难溶解 。
改良 CTAB 法提取的 DNA A260 nm/A280 nm在
1.8～ 2.0之间 ,产率为100 mg/g(鲜叶片)左右 ,说
明 DNA 纯度较高 , 蛋白质等杂质污染少;而常规
CTAB法所得 DNA A260 nm/A280 nm小于1.8 ,产率由
于多糖等杂质的污染无法精确计算。见表 1 。
表 1　不同提取方法所得 DNA纯度和产量
方法 编号 A260 nm A 280 nm A260 nm/A28 0 nm DNA 产量(m/μg·g-1) 颜色
常规 CTAB 法
1 0.107 0.061 1.75 - 棕黄色
2 0.091 0.053 1.72 - 黄白色
3 0.094 0.057 1.65 - 黄白色
改良 CTAB 法
1 0.024 0.013 1.85 120.0 白色
2 0.018 0.010 1.80 90.0 白色
3 0.021 0.011 1.91 105.0 白色
3.2　电泳检测
从基因组 DNA 的电泳结果来看 ,改良 CTAB
法提取的 DNA(图 1)条带清晰明亮 ,无拖尾或弥散
现象 ,点样孔周围也无明显荧光 ,说明所提 DNA 纯
度和完整性较好。而常规 CTAB法提取的 DNA(图
2)点样孔附近有强烈荧光 , DNA与多糖等杂质形成
复合物滞留在点样孔中 ,无完整的 DNA 条带。
3.3　酶切检测
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图 3为改良 CTAB 法提取的 DNA经 EcoRⅠ 、
M seⅠ双酶切的图谱 。从图上可以看出 ,改良 CTAB
法所得 DNA 能够被 2种限制性内切酶彻底消化 ,
在凝胶上呈现出均匀的弥散带 ,与 DNA Marker
DL2 000对照 ,酶切片段大小在 800 ～ 100 bp范围内
分布 ,说明所提 DNA纯度较好 ,能够用于酶切等对
DNA质量要求较高的实验 。
图 1　改良 CTAB 法提取的基因组 DNA 电泳图谱
M:DNA Marker DL 2 000;1～ 8:基因组 DNA(5μl)
图 2　常规 CTAB 法提取的基因组 DNA 电泳图谱
1～ 3:基因组 DNA(5 μl)
图 3　改良 CTAB 法提取的基因组 DNA 酶切图谱
M:DNA Marker DL 2 000;1:酶切前的基因
组 DNA(1 μl);2～ 4:酶切后片段
4　讨论
4.1　CTAB法的改进
CTAB法既能裂解细胞 ,又能沉淀多糖 ,是最常
用的植物 DNA 提取方法 。由于忍冬叶富含多糖 、
多酚等 ,我们对 CTAB法进行了改进 。
4.1.1　根据细胞区室化原理 ,用 S TE核分离缓冲
液对样品进行预处理 ,可有效地将细胞核(在沉淀
中)与上清液中的多糖及多酚等次生物质分开。
4.1.2　在 CTAB 提取缓冲液中增加酚类络合剂
PVP 和抗氧化剂 β-巯基乙醇的用量 ,以防止多酚类
氧化。
4.1.3　氯仿/异戊醇抽提时 ,中间加入 10%CTAB
除多糖。研究表明 ,虽然增加抽提次数有利于蛋白
质等杂质的去除 ,但过多地抽提对 DNA 质量并无
明显提高反而会降低得率 ,通常抽提 1 ～ 2次至两相
界面无明显蛋白沉淀即可。
4.1.4　用高浓度钠盐(1/10体积3 mol/L NaAC)和
-20℃冷藏的无水乙醇沉淀 DNA ,用灭菌枪头将粗
提沉淀物挑出 , 避免直接离心时带入杂质和 DNA
沉淀过分压紧而极难重新溶解等问题[ 6] 。此外 ,沉
淀时间不宜过长 , 以免杂质与 DNA 共沉淀影响
DNA纯度 。
4.2　DNA质量的检测方法
由于某些杂质在UV 260 nm处也有吸收 ,因此
仅通过紫外吸收进行 DNA 的定量偏差较大[ 7] ,我
们结合电泳和酶切结果等进行了 DNA 纯度的综合
分析 。实验结果显示 ,改良 CTAB法所得 DNA 电
泳条带清晰 、纯度高 、完整性好 ,能被限制性内切酶
完全酶切 ,在进行 AFLP 等对模板 DNA 质量要求
较高的实验时 ,可作为提取忍冬基因组 DNA 的一
种有效方法 。
[参考文献]
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2008 年 5 月　 　　　　　　　　　　王婷等:忍冬叶片基因组 DNA的提取与分析　　　　　　　　　　　　第 32卷第 3期