全 文 ：黄花石蒜 LycorisaureaHerb为石蒜科石蒜属多年
生草本植物,其鳞茎中含有多种生物碱成分,是国际上紧
俏药物——加兰他敏(Galantamine)的资源植物。由于黄
花石蒜为自然分球繁殖植物,繁殖系数很低,且植物中加
兰他敏含量又极低,提取成本很高[1],故无法满足市场需
要。通过离体培养不定根生产次生代谢产物具有广阔的
前景,目前国际上已实现了人参不定根的工业化[2,3]。我
们在黄花石蒜组织培养研究中发现[4],该植物鳞茎外植
体较易产生不定根,且不定根具有很强的增殖能力,通
过薄层鉴别,不定根中含有加兰他敏成分。因此,我们对
黄花石蒜不定根的诱导和扩大培养做了进一步的研究,
以期建立黄花石蒜不定根的体外培养体系,为加兰他敏
的获取提供新的途径。
1材料与方法
1.1 材料
植物材料采自湖南衡山,经作者鉴定为黄花石蒜
(LycorisaureaHerb),取鳞茎备用。
加兰他敏对照品由南京苏朗医药科技开发有限公
司提供,批号20061214,纯度99%。
〔收稿日期〕2007-10-30
〔基金项目〕湖南省卫生厅中医药科研基金项目(2006067)。
〔作者简介〕彭 菲(1963-),女,湖南长沙人,教授,主要从事中药生物技术的教学与研究。
黄花石蒜不定根的离体诱导与培养研究
彭 菲,钟湘云,谭朝阳,雷思琦,李云耀
(湖南中医药大学药学院,湖南 长沙 410208)
〔摘要〕目的 摸索黄花石蒜不定根的离体诱导与培养条件,并对其有效成分加兰他敏进行初步检测。方法
以黄花石蒜双鳞片为外植体,接种于不同培养基上,观察长根情况;以离体培养的不定根为材料,检测其是否含有
有效成分加兰他敏。结果 双鳞片在MS+2,4-D2mg/L培养基中能诱导出愈伤组织;愈伤组织在MS+IBA1mg/L+BA
0.1mg/L中诱导生根最佳;薄层色谱显示黄花石蒜不定根的培养品中含加兰他敏。结论 离体培养黄花石蒜的不
定根,可能成为加兰他敏的一个新来源。
〔关键词〕黄花石蒜不定根;离体培养;加兰他敏
〔中图分类号〕R282.2 〔文献标识码〕A 〔文章编号〕1674-070X(2008)01-0044-02
StudyofLycorisaureaoninductionandculture
ofadventitiousrootinvitro
PENGFei,ZHONGXiang-yun,TANZhao-yang,LEISi-qi,LIYun-yao
(TCMUniversityofHunan,Changsha,Hunan410208,China)
〔Abstract〕ObjectiveToinvestigatetheinductionandculturingconditionofadventitious
rootofLycorisaureainvitro,anddetectitsactiveprinciplegalanthamine.MethodsThetwin-
squamasofLycorisaureawastookasexplanttobeculturedindiferentmediums.Theactive
galanthaminewasdetectedintheadventitiousroots.ResultsThecaluscouldinducedirectly
fromtwin-squamasinMS+2,4-D2.0mg/L;thecalusinmediumofIBA1mg/L+BA0.1mg/
Lwasthebestconditiontoinducerooting;andtheactivity-galanthaminedetectedwithTLC
wascontainedintheroots.ConclusionsTheadventitiousrootwilbeanewresourcetoobtain
thegalanthaminefromculturingLycorisaureainvitro.
〔Keywords〕Lycorisaurea;invitroculture;adventitiousroot;galanthamine
2008年2月第28卷第1期
Feb.2008Vol.28No.1
湖 南 中 医 药 大 学 学 报
JournalofTCM Univ.ofHunan44
表2生长调节物质对黄花石蒜不定根生长速度的影响
培养基编号
④
⑤
⑥
⑦
⑧
接种量(g)
1.28±0.07
1.25±0.14
1.38±0.15
1.54±0.09
1.95±0.11
收获量(g)
11.30±0.12
2.50±0.02
1.40±0.02
9.09±0.12
6.66±0.10
增 重(g)
10.02±0.03
1.25±0.12
0.02±0.01
7.55±0.16
4.71±0.05
增重倍数
7.83±0.6
1.00±0.5
0.01±0.01
4.90±0.15
2.42±0.12
注:表中数据为培养60d后的统计结果。
1.2 诱导与培养方法
1.2.1 愈伤组织的诱导 将黄花石蒜鳞茎用自来水洗
净,剥去外层黑色鳞片,切去根部,切留鳞茎下半部分
(约1/3),并将其切成4块。用洗涤剂液浸泡 10min,用
自来水冲洗干净,放于超净工作台中,用 70%乙醇灭菌
40s,无菌水冲洗2～3次,再用0.1%升汞灭菌12min,无
菌水冲洗4～6次。将鳞茎切成双鳞片,接种到MS添加不
同激素的培养基中:①MS+2,4-D2mg/L;②MS+2,4-D4
mg/L;③MS+2,4-D6mg/L。于(24±1)℃下进行培养。
1.2.2 不定根的诱导与培养 将增殖后的愈伤组织切
成合适大小,分别接种到下列培养基中:④MS+IBA1
mg/L+BA0.1mg/L;⑤MS+2,4-D0.5mg/L;⑥MS;⑦MS+
2,4-D0.1mg/L+IBA0.5mg/L;⑧MS+IBA1.0mg/L。培
养条件同上。
1.3 培养物中加兰他敏检测
1.3.1 供试品溶液的制备[5] 取离体培养的不定根干品
粉末5.0239g(含水量5.01%),加95%乙醇50mL,回流
1h,2次过滤,滤液水浴挥干,残渣加25mL0.1mol/L
盐酸溶解,过滤,滤液加氨水调 pH值到 10,加氯仿萃取
3次,每次25mL,合并氯仿液,水浴挥干,残渣加甲醇溶
解,定容至10mL。
1.3.2 加兰他敏对照品溶液的配制 精取对照品 4.68
mg,用甲醇溶解定容到 50mL容量瓶中,配制成浓度为
0.0936mg/mL。
1.3.3 薄层色谱 薄层板:0.5%CMC-Na饱和的硅胶 G
板;展开剂:三氯甲烷-甲醇-氨水(100∶10∶0.5);显色剂:
稀碘化铋钾试液。
2结果
2.1 愈伤组织诱导
接种到①号培养基上的外植体诱导效果最为明显,
双鳞片自培养起 4d后开始张开,鳞茎片翘起向内弯
曲,10~13d后外植体开始膨胀,表面凹凸不平,在双鳞
片夹角处出现黄白色颗粒状的愈伤组织,30d后愈伤组
织不断扩大,双鳞片被撑开,诱导率为55.0%。接种到②、
③号培养基上的外植体诱导愈伤组织时间长,1个月后
才出现黄白色颗粒状愈伤组织,且诱导率偏低,分别为
23.5%、28.6%。
实验表明,①号培养基对外植体的诱导率明显高于
②、③号培养基,而①号培养基所含激素 2,4-D的浓度
低于②、③号培养基。由此推断,激素浓度过高会抑制愈
伤组织的诱导,适当浓度则有助于诱导率的提高。
2.2 不定根的诱导与增殖培养
接种到④、⑦、⑧号培养基上的愈伤组织 15d后开
始发根,随后发出的根有明显的生长并不断有新的根扎
入培养基中;40d后生长的根很密集,数量多达几十条,
并出现多条根连体生长呈现片状的现象,颜色以白色为
主且带有淡黄色根尖,根长约 6~8cm(图 1),根诱导率
高。接种到⑤号培养基中的愈伤组织约2个月后才开始
发根,根数量少,短小粗壮,根诱导率低。接种到⑥号培
养基中的愈伤组织发根更加困难,仅有几条根发出,且
随着时间延长逐渐褐化死亡(表1)。对不同培养基配方
中不定根的生长速度进行观察比较,结果见表2。
实验结果表明,激素 IBA促进了根的诱导,从⑥号
无激素培养基的培养情况看,添加外源激素对于不定根
的生长与增殖是必需的。结合不定根增重情况来看,④
号培养基是不定根诱导与增殖的最佳培养基。
2.3 不定根的液体培养
液体培养体系的建立是不定根体外大规模培养的
技术关键。我们在实验中发现,从固体培养转入液体培
养时,接种材料的切割方式很关键:切下单根进行培养,
根可以伸长生长约一倍左右,但不产生侧根,最终死亡;
而切割时带一部分母体愈伤组织,或不切割直接进入液
体培养,不定根的生长均较好,能不断产生侧根,其增殖
速度比固体培养快,继代培养周期短。
2.4 不定根培养物中加兰他敏的TLC检测
结果表明,二者Rf值相近,不定根供
表1生长调节物质对黄花石蒜不定根诱导率的影响
培养基
编号
④
⑤
⑥
⑦
⑧
接种
块数
30
30
20
32
35
生根
块数
28
14
2
30
33
根诱导率(%)
93.6
46.5
10.0
93.8
94.3
生根量/块
+++
++
+
+++
+++
根的形态
细长,白色带淡
黄色根尖
短小粗壮,白色
带淡黄色根尖
短小细长,逐渐
褐化死亡
细长,白色带淡
黄色根尖
细长,白色带淡
黄色根尖
注:每块生根量10条以下,+;10～20条,++;20条以上,+++。
彭 菲,等 黄花石蒜不定根的离体诱导与培养研究第1期
(下转第48页)
45
图1黄花石蒜的不定根
试品在与对照品同一水平位置上的斑点
相同,颜色一致(图2)。说明离体培养的不定根中含有有
效活性成分加兰他敏。
3结论
作者首次对黄花石蒜进行了不定根的诱导与培养
研究。本实验探索了黄花石蒜不定根的诱导和离体培养
的培养条件,并检测出不定根的培养品中含有活性成分
加兰他敏,为探索通过离体培养黄花石蒜不定根来生产
加兰他敏的可行性奠定了基础。
目前我们已初步建立了不定根的液体培养体系,关
于如何进一步提高不定根的增殖速度、提高加兰他敏的
含量,正在进行系统研究。
参考文献:
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应用[J].南京林业大学学报(自然科学版),2004,28(4):79-83.
①不定根的培养品;
②对照品
图 2不定根培养物中
加兰他敏TLC检测图
(本文编辑 徐爱良)
① ②
(上接第45页)
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
干颗粒含水量
3 4 5 6 7
休止角 3.49 3.44 3.37 3.20 3.23
粘冲情况 5.00 5.00 3.00 2.00 2.00
片面情况 5.00 5.00 5.00 3.00 3.00
片质量差异 3.13 3.31 2.64 3.37 2.46
硬度 4.91 7.22 7.37 5.08 4.49
崩解度 4.17 6.25 4.17 4.54 5.00
x±s 4.28±0.825.04±1.53 4.26±1.75 3.52±1.10 3.36±1.16
3讨论
本研究通过对片剂成型影响较大的 3因素:黏合剂、
润滑剂、干颗粒含水量进行优选,得出疏肝理脾片的最佳
成型工艺为:以 5% PVPK3080%乙醇液作为黏合剂,以硬
脂酸镁/滑石粉(0.3%/2%)作为润滑剂,干颗粒含水量应控
制在4%左右。以筛选出的成型工艺条件制成的疏肝理脾
片,成品得率高,符合《中国药典》中片剂的质量标准。
本试验系统地考察了片质量、崩解度、硬度、休止角
等因素对疏肝理脾片成型的影响。结果显示 PVPK30黏合
力强,可增加粒子间的内聚力,促进片剂的成型,片剂的
硬度增大,也有利于片剂崩解、溶出,加入硬脂酸镁/滑石
粉后,可使制得颗粒流动性好。采用上述几种辅料制成的
片剂完整,片面光洁,硬度较高,崩解度符合质量要求。片
剂成型是非常复杂的过程,除本文所考察的因素外,压片
机压力、转速等也明显影响片剂成型性。在本文所选出的
工艺条件基础之上,还可通过调整以上几因素的不同水
平来进一步改善片剂成型性能和质量。
参考文献:
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[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京:化学工业出版
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[3]赵晓宏,陈迪华,斯建勇,等.中药新药片剂成型研究的思路与方
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表5干颗粒含水量对片剂成型的影响 (%)
测定指标
(本文编辑 徐爱良)
湖南中医药大学学报 2008年第28卷48