全 文 ：兰花种子的原球茎诱导及其生长分化研究
古碧珠 ,刘柏涛 ,何嘉碧 ,梁红＊ (仲恺农业工程学院生命科学学院 ,广东广州 510225)
摘要 [目的]从培养基方面优化兰花快速繁殖的技术体系。[方法] 将石斛兰和秋花独蒜兰的干种子培养于MS 、B5、KC液体培养基上 ,
诱导原球茎形成 ,再将原球茎培养于MS、KC及B5固体培养基中 ,研究原球茎分化苗在不同培养基上的生长发育情况。[结果]石斛兰和
秋花独蒜兰种子在B5液体培养基中诱导产生的原球茎最多 ,萌发率分别为 3.1%、7.3%。秋花独蒜兰原球茎在KC固体培养基上的成
活率最高 ,为 71.9%,且幼苗生长发育状况最好 , 原球茎直径为(5.8±0.3)mm;石斛兰原球茎在 B5 固体培养基上的成活率最高 ,为
65.0%,在KC固体培养基上的生长发育状况最好 ,原球茎直径为(3.8±0.6)mm。[结论] 根据不同的组培快繁目标 ,可在兰花的不同生
长发育阶段选用合适的培养基。
关键词 石斛兰;秋花独蒜兰;原球茎;培养基
中图分类号 S 682.31 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)31-13511-03
Study on Induction of Protocorms from Cymbidium Seeds and Its Growth and Differentiation
GU Bi-zhu et al (College of Life Sciences , Zhongkai University of Agriculture and Engineering , Guangzhou , Guangdong 510225)
Abstract [Objective] The aim was to optimize the technical system for the rapid propagation of cymbidium from aspect of the medium.[Method] The
dry seeds of Dendrobium nobile and Pleionemaculata were cultured on MS , B5 and KC liquid media for inducing protocorms , and the protocorms were
subcultured on MS , KC and B5 solid media to study the growth of protocorm differentiation seedlings in the different medium.[ Result] The protocorms of
D.nobile and P.maculata seeds induced in the B5 liquid medium were most and their germination rate were 3.1% and 7.3%, resp.The survival rate
of P.maculate protocormwas highest in the KC solid medium , being 71.9%, and their seedling growth was best and the diameter of the protocorm was
(5.8±0.3)mm.The survival rate ofD.nobile protocormwas highest in the B5 solid medium, being 65.0%, and their seedling growth was best in the
KC solid medium and the diameter of the protocorm was(3.8±0.6)mm.[Conclusion] The suitable medium could be selected in the different develop-
mental stages of cymbidium according to the different goals of tissue culture and rapid propagation.
Key words Dendrobium nobile;Pleione maculate;Protocorm;Medium
作者简介 古碧珠(1983-),女 ,广东梅州人 ,本科生 ,专业:农业生物
技术。 ＊通讯作者。
收稿日期 2008-08-19
兰花的快速繁殖是 L.Knudson(1946)和G.Morel(1960)
等建立和完善起来的[ 1] 。大部分兰花的种子 ,可以通过处
理 ,以无菌萌发的方式进行萌发建立无性繁殖系[ 2-6] 。但是
对于许多我国原产特别是我国特有的野生兰花来说 ,通过无
菌萌发建立无性繁殖系还存在着一定的困难 ,特别是组培繁
殖的速度太慢 ,不能满足商业化生产的要求。为此我们进行
石斛兰[ 7]和秋花独蒜兰[ 8-9] 种子无菌萌发和不同生长发育
观察 ,以期从培养基及培养条件选择方面为优化其快速繁殖
的技术体系提供依据 。
1 材料与方法
1.1 材料 石斛兰和秋花独蒜兰的干种子来自美国夏威夷
大学Dr.Sagawa实验室 ,已置培养皿中在室内常温存放 1年
以上。MS 、B5、KC培养基系根据标准配方自行配制 。
1.2 方法 以MS 、B5、KC 3种基本培养基(固体和液体)分
别进行干种子无菌萌发 。培养方式分为液体摇瓶培养(150
r/min)和固体培养。培养条件为黑暗 ,温度(26±2)℃,培养
45 d后调查种胚萌发率。
接种时取 25 ml 的针筒 ,将种子轻轻倒入针筒里 ,抽取
0.6%的次氯酸钠溶液 10 ml ,来回抽压至所有的种子沉浸入
液体中。放置 10 min后排出次氯酸钠溶液 ,再吸液体培养基
5 ml浸洗种子 1 min后排出培养液。然后吸液体培养基 1ml
悬浮种子 ,再注入固体培养基表面涂布均匀;或注入液体培
养基中摇瓶培养。45 d后从培养产生的原球茎中挑选出大小
均一 、颜色嫩绿色 、未分化的原球茎 ,在无菌条件下接种到 3
种固体培养基上 ,每瓶接种 8个原球茎 , 每个处理重复 4次。
接种后置于培养室培养 ,温度(25±1)℃, 光强 2 000 lx , 每
天光照 12 h(8:00～ 20:00)。原球茎培养 7～ 14 d ,培养基会逐
渐变褐 ,这时应在无菌条件下将其转移到相同的新培养基。
原球茎经过 60 d左右培养 ,将有 2～ 3片叶 ,高度大于 1.5 cm
的幼苗再转移到同种培养基 ,继续在培养室里培养 。培养 60
d后 ,统计原球茎的成活率 ,记录原球茎分化苗的叶数 、茎高 、
叶长 、根长和株高。
2 结果与分析
2.1 不同基本培养基对原球茎成活的影响 2种兰花的干
种子接种液体培养基中摇瓶培养 10～ 14 d后开始膨大 ,5 ～ 6
周后种子变绿 ,发育成原球茎(图 1)。其具体变化过程是先
吸水膨胀 ,体积变大 ,然后种胚细胞分裂 ,透过种皮可以看到
增大的胚。随着种胚胀大 ,胚表层的细胞形状不规则 ,外壁
加厚 ,种胚胎从合点端将种皮纵向胀破 ,成为早期原球茎 。
根据试验观察 ,干种子从接种到形成直径 0 ～ 40 mm 的原球
茎需要经过 40 d左右。
图1 石斛兰不同发育时期的原球茎
Fig.1 Protocorms of Dendroblium nobile in different growth periods
由表 1可知 , 不同培养基对秋花独蒜兰成熟干种子原
球茎诱导的效果表现出很大的差异。B5液体培养基中种子
萌发率达 7.3%,KC为 3.4%,而MS只有 1.1%。可见 ,B5培
养基更适合秋花独蒜兰无菌种子的萌发。但总体上的萌发
率偏低 ,可能是由于种子存放太久的缘故。石斛兰干种子在
B5培养基中的萌发率为 3.1%,在MS培养基上未见原球茎
产生 ,而在KC培养基上只见个别的原球茎出现。
2.2 不同培养基对原球茎生长的影响 原球茎接种在固体
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2008 , 36(31):13511-13513 责任编辑 庆 责任校对 张士敏
培养基之后 ,前期生长缓慢 ,有些在培养过程中逐步褐化死
亡。不同培养基对秋花独蒜兰原球茎成活的影响见表 2。培
养 35 d后 ,原球茎在KC培养基上的成活率为 71.9%,MS培
养基上为 25.0%,而 B5培养基上仅为 21.9%。由表 3可知 ,
在KC培养基上培养 20 d 后原球茎大小从 2.5 mm 增加到
(5.8±0.3)mm ,在MS 培养基上原球茎大小增加至(3.5±
0.6)mm ,而在B5培养基上只有(2.6±0.5)mm 。由此可见 ,
在 3种培养基中KC培养基最为适合秋花独蒜兰原球茎的早
期培养 ,其次为MS培养基 ,最后为 B5培养基。同时发现在
培养的过程中 ,KC培养基中的原球茎颜色为深绿色 ,生长旺
盛 ,质量最好。
表 1 秋花独蒜兰及石斛兰干种子在不同培养基中萌发情况
Table 1 Germination of the dryseeds of Pleione maculata andDendroblium
nobile in different media
培养基
Media
培养种子∥粒
Number of
cultured seeds
萌发数∥粒
Number of germinated seeds
秋花独蒜兰
P.maculata 石斛兰D.nobile
萌发率∥%
Germination rate
秋花独蒜兰
P.maculata 石斛兰D.nobile
MS 2 000 22 0 1.1 0
B5 2 000 145 62 7.3 3.1
KC 2 000 67 6 3.4 0.3
表2 3种培养基对秋花独蒜兰原球茎成活率的影响
Table 2 Effects of 3 kinds of media on the survival rate of P.maculata
protocorm
培养基
Media
原球茎∥个
Protocorm number
成活∥个
Number of viable protocorm
成活率∥%
Survival rate
MS 32 8 25.0
B5 32 7 21.9
KC 32 23 71.9
表 3 秋花独蒜兰原球茎生长状况的比较
Table 3 Growth situation comparison of P.maculata protocorm
处理
Treatment
培养基
Media
原球茎直径∥mm
Protocorm diameter
显著性检验
Significance test
培养前 Before culture 无 2.5±0.3
培养 20 d 20 d after culture MS 3.5±0.6 P<0.5
B5 2.6±0.5 0.10
由表 4可知 ,原球茎在MS培养基上的成活率最低 ,经过
3个多月的培养 ,其最后的成活率仅为 17.5%;KC培养基次
之 ,为 45%;而 B5培养基最高 ,达 65%。但在叶色方面 ,KC
上的幼苗为深绿色 ,MS和 B5上的幼苗为浅绿色。MS 培养
基上的原球茎直径为(5.0±0.5)mm ,但苗分化较迟;B5培养
基上的原球茎直径为(3.4±0.4)mm ,原球茎分化成苗最快;
KC培养基上原球茎直径为(3.8±0.6)mm ,分化速度居中 。
2.3 幼苗在不同培养基上的生长状况 培养 60 d后 ,发现
在 3种不同培养基中石斛兰原球茎的生长状况明显不同(表
5)。试验结果表明 ,KC 培养基中培养的幼苗生长最快 、最
好 ,叶色鲜绿 ,幼苗较粗壮;MS培养基上的长势较差 ,叶色有
些淡黄;B5培养基上的幼苗长得相对矮小(图 2)。继续培养
30 d后观察其生根状况 ,发现生长在 KC培养基上的幼苗根
短小 、根数少;B5培养基上生长的幼苗根最粗 、最长;而在MS
培养基上生长的幼苗根的数目是最多的(表 5、图 3)。秋花
独蒜兰的生长状况与石斛兰大体相似。
表 4 石斛兰原球茎继代培养不同时期的成活状况
Table 4 Survival situation of D.nobile protocorm in different growth pe-
riods of subculture
观察日期
Investigation date
培养基
Media
原球茎∥个
Protocorm
成活率∥%
Survival rate
01-18 MS 40 100.0
KC 40 100.0
B5 40 100.0
02-07 MS 29 72.5
KC 37 92.5
B5 40 100.0
02-28 MS 9 22.5
KC 26 65.0
B5 35 87.5
04-30 MS 7 17.5
KC 18 45.0
B5 26 65.0
表 5 石斛兰原球茎在不同培养基的生长状况
Table 5 Growth situation of D.nobile protocorms on differentmedia
培养基
Media
株高∥cm
Plant height
叶片∥片
Leaf number
根∥个
Root number
根长∥cm
Root length
MS 1.65 3.2 2.3 0.28
B5 1.63 3.5 1.3 0.43
KC 2.83 4.3 0.7 0.18
图 2 不同培养基的石斛兰幼苗
Fig.2 D.nobile seedlings on differentmedia
图 3 不同培养基的石斛兰生根
Fig.3 Rooting situation of D.nobile seedlings on different media
2.4 玻璃苗及培养物的褐化 试验后期MS培养基上出现
13512 安徽农业科学 2008年
了 4棵玻璃苗 ,占总数的 50%(图 4)。玻璃苗的出现说明MS
培养基不太适合秋花独蒜兰幼苗的生长。考虑到玻璃化发
生是“生长因子不平衡的产物”而不能很好地适应不宜培养
基和培养环境的结果 ,在培养后期应更换合适的培养基。试
验中KC和B5培养基上均未发现玻璃苗。
图4 MS培养基上的石斛兰玻璃苗
Fig.4 Vitrified plantlets of D.nobile on MSmedium
KC培养基一般接种 1周左右 ,在石斛兰幼苗插入位置
及其附近的培养基开始变褐 、变黑(图 5);MS培养基一般接
种 2周左右才开始变褐 、变黑;而B5培养基 1个月内培养基
都不变色。如果不更换新的培养基 ,幼苗从接触培养基的基
端开始褐化 ,继而向邻近部位扩展。适时切除培养物中的褐
化部分或及时更换新培养基 ,可使幼苗继续健康生长 。秋花
独蒜兰的培养未发现褐化现象。
图 5 石斛兰的褐化现象
Fig.5 Browning phenomenon of D.nobile
3 讨论
(1)试验用石斛兰和秋花独蒜兰的干种子为材料 ,培养
于MS 、B5、KC液体培养基上 ,诱导原球茎形成。但不同培养
基的培养效果有较大的差异 ,而且 2种兰花的培养也表现出
较大的差异 。总体上 ,秋花独蒜兰的培养效果优于石斛兰。
(2)利用组培技术对兰花胚 、花梗 、幼叶 、茎尖 、根尖和种
子等外植体进行组培研究已有文献报道[ 10-12] 。目前用于石
斛类植物组织培养的培养基有MS ,Nitch ,Knudson C(KC),N6 ,
B5 ,C17 ,SH ,KN ,VacinWent(VW),Winber(W), 1/2 B5 , 1/2 N6 ,
1/2 C17 ,1/2 SH ,1/2MS ,1/2 ZW等 ,但使用最多的是MS。试
验比较了MS、KC和 B5 3种基本培养基对石斛兰从干种子到
幼苗的发育过程的影响 。研究发现不同培养基对石斛兰的
不同发育阶段有促进或抑制作用 ,即石斛兰在不同的发育阶
段需要不同的培养基:MS培养基对原球茎的诱导不利 ,但对
于原球茎体积增大和生根有利;B5培养基有利于原球茎的
诱导和分化;KC 培养能基促进幼苗的健壮生长。说明石斛
兰在不同的发育阶段需要的养分是不同的。因此 ,在兰花的
工厂化育苗中 ,应根据幼苗生长发育的不同阶段 ,采用不同
的培养基配方 ,促使幼苗的快速生长和健苗壮苗。
试验过程中 ,幼苗出现了玻璃苗和褐化现象。玻璃苗是
因为培养管内空间相对湿度提高产生的或者试管苗瓶口密
封较严 ,瓶内外气体交换困难时出现的。而褐化是因为受伤
细胞分泌多酚氧化酶将酚类物质氧化成醌 ,扩散到培养基
中 ,叶片在叶缘部位渗出褐化物 ,并逐渐扩散造成的[ 13-14] 。
试管苗的褐化现象是植物组织培养中的独有现象。这与组
培的培养过程和环境条件有一定的联系。
(3)种子无菌培养过程中使用不同的基本培养基类型对
秋花独蒜兰原球茎的分化及生长状况有着较大的影响 。试
验结果表明 ,B5培养基有利于原球茎的诱导但不利于原球
茎生长的分化;MS培养基不利于原球茎诱导 ,但可用于原球
茎的继代培养;在KC 培养基中培养的原球茎生长最快 、最
好 ,原球茎直径由培养前的 2～ 3 mm增大到 5 ～ 6mm ,净增大
了 1倍 ,因此 ,KC培养基是最有利于原球茎膨大生长的培养
基。KC培养基盐类含量低 ,微量元素只有锰盐 ,不含维生
素 ,而且 pH值较小。由此可知 ,低盐 、pH值小有助于原球茎
的生长。培养 90 d后 ,原球茎在KC培养基上的成活率是最
高的 ,且幼苗长得壮 、旺盛 , 说明在 3种培养基中 ,KC培养基
是最适合秋花独蒜兰原球茎分化成幼苗及生长的 ,这可能与
其营养元素含量及蔗糖含量 、pH 值有密切联系的。另外 ,B5
培养基中的幼苗的根长得最壮 ,说明根的良好生长应选择含
量较高的硝态氮 、硝酸钾的培养基。
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1351336卷31期 古碧珠等 兰花种子的原球茎诱导及其生长分化研究