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收稿日期: 2012-12-20
基金项目: 国家自然科学基金项目（31070636）和安徽省高校木材科学与技术重点实验室经费共同资助。
作者简介: 余 敏，男，博士研究生。E-mail：yuminwood@163.com
* 通信作者: 刘盛全，男，博士，教授，博士生导师。E-mail：liusq@ahau.edu.cn
安徽农业大学学报, 2013, 40(4): 603-607
Journal of Anhui Agricultural University
网络出版时间：2013-7-12 10:25:55
[URL] http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20130712.1025.001.html
降香黄檀木材 DNA 提取方法的研究
余 敏 1，张 浩 1，周 亮 1，刘盛全 1*，钱良存 1，金 青 2，李大周 3
(1. 安徽农业大学林学与园林学院，合肥 230036；2. 安徽农业大学生命科学学院，合肥 230036；
3. 海南省林业科学研究所，海口 571100)
摘 要：DNA 分析是一种有效地鉴别木材的方法，但它要求要从木材中得到足够质量和数量的 DNA。因此，
本试验以降香黄檀气干材为原料，采用改良的 CTAB 法、QIAGEN 试剂盒法和 PTB 法分别提取降香黄檀心材和边
材部位的 DNA，比较从不同部位木材组织中提取 DNA 的质量差异，以期为从心材和边材组织中提取 DNA 探寻合
适的方法。结果表明，3 种方法从边材和心材部位提取 DNA 浓度范围分别为：75.95～937.38 ng·µL-1，4.46～806.56
ng·µL-1，其中 PTB 法从边材和心材部位提取的 DNA 浓度都是最高的，试剂盒法提取的 DNA 浓度都是最低的。3
种方法提取的边材部位DNA经纯化处理后能够满足PCR扩增目的片段的要求；只有PTB法提取的心材部位的DNA
经纯化处理后能够满足 PCR 扩增目的片段的要求。3 种方法都能够从边材组织中提取出 DNA，PTB 法更适合从心
材组织中提取 DNA。
关键词：降香黄檀；气干木材；DNA 提取；PTB；PCR
中图分类号：S781 文献标识码：A 文章编号：1672352X (2013)04060305
DNA extraction from wood tissue of Dalbergia odorifera T. Chen
YU Min1, ZHANG Hao1, ZHOU Liang1, LIU Sheng-quan1, QIAN Liang-cun1, JIN Qing2, LI Da-zhou3
(1. School of Forestry and Landscape Architecture, Anhui Agricultural University, Hefei 230036;
2. School of Life Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230036;
3. Hainan Institute of Forestry, Haikou 571100)
Abstract: DNA analysis is an effective method for wood identification. Obtaining sufficient quantity and
quality DNA is the prerequisite. In this paper, Dalbergia odorifera T. Chen of Leguminosae sp. family was se-
lected as material. Three methods, i.e., modified CTAB, DNeasy Plant Mini kit (QIAGEN) and PTB
(N-phenacylthiazolium bromide) were employed to extract the DNA in sapwood and heartwood. The quality and
quantity of the DNA extractions in the two zones were compared to explore the proper methods for extracting
DNA in different parts of wood. The results showed that the concentration of DNA in sapwood and in heartwood
isolated by the three methods ranged from 75.95-937.38 ng·µL-1, 4.46-806.56 ng·µL-1, respectively. The maximum
value of DNA concentration was reached by the PTB method in sapwood and heartwood, meanwhile, the mini-
mum value was reached by the kit method. The target sequence of DNA in sapwood isolated by the three methods
was amplified successfully after being purified, while the DNA in heartwood isolated by the PTB method were
subjected to polymerase chain reaction after being purified. The DNA in sapwood can be extracted by the three
methods, but the DNA in heartwood can be extracted more suitably by the PTB method.
Key words: Dalbergia odorifera T.Chen; air-dried wood tissue; DNA extraction; N-phenacylthiazolium
bromide；polymerase chain reaction
降香黄檀（Dalbergia odorifera T. Chen），俗称
海南黄花梨，是海南特有濒危树种，为国家二级保
护植物。海南黄花梨其木纹如行云流水、质地坚韧
缜密如玉，木色瑰丽动人，其木屑泡水饮用具有降
DOI:10.13610/j.cnki.1672-352x.2013.04.023
604 安 徽 农 业 大 学 学 报 2013 年
血压、血脂的神奇药用功效，从明代开始就是我国
高档传统家具的主要用材，民间素有“紫檀木中之
王、黄花梨木中之后”的称誉[1]。近年来, 市场上出
现了一种在气味、颜色、纹理、结构等方面与海南
黄花梨极为相似的木材, 主要来源于越南, 故称之
为越南黄花梨，学名多裂黄檀(Dalbergia rimosa
Roxb)。因其与海南黄花梨从木材粗视构造上很难区
分开来，市场上常有人用这种越南黄花梨冒充海南
黄花梨, 一般不是长期与黄花梨打交道的人很难分
辨[2]。越南黄花梨在市场上以次充好的现象出现，
极大地扰乱了市场秩序，给消费者带来了巨大的经
济损失。
准确、正确地识别木材材种对于按质论价、合
理经营、识别假冒伪劣产品、科学合理地利用木材
资源具有重要的意义，传统的木材识别方法要求识
别者具有丰富的木材构造特征方面的专业知识，且
传统的木材识别方法很难鉴别木材到种[3]。随着分
子遗传标记的发展，使其作为一项重要的法医学工
具被广泛地应用到亲子鉴定和犯罪案件的侦破过程
之中，特别是这项技术在考古学研究领域的成功应
用[4]，为运用这项技术准确地识别木材提供了借鉴
和依据。
运用 DNA 分子遗传标记技术识别和鉴定木材
的前提是从木材组织中提取到足够质量和数量的
DNA 来满足 PCR 扩增反应的需求[5]。因此，作者
尝试从豆科常见显心材树种国槐生材中提取和扩增
DNA 并获得成功（另文发表）。在此基础上，以降
香黄檀气干心材和边材为研究对象，利用 3 种不同
的方法提取降香黄檀木材中的基因组 DNA，探索一
种适合降香黄檀心材和边材基因组 DNA 的提取方
法，为深入开展在分子水平上对降香黄檀等名贵木
材进行分子标记识别打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验所使用的降香黄檀的边材和心材部分均
为气干材，取自海南省海口市霸王岭。所有的木材
试样在使用前用 75%的乙醇对木材表面进行彻底的
消毒，经无菌水冲洗并用已灭菌的滤纸擦干，用无
菌的刀片切除试样表面部分以避免其他植物组织的
污染，将样品切成小块，使用植物组织切片机将木
块切削成碎片，随后放入预冷研钵中加入液氮和适
量石英砂研磨成粉末备用。
试验所需试剂有 3% CTAB 提取缓冲液[100
mmol·L-1 Tris-HCl（pH8.0），20 mmol·L-1 EDTA
（pH8.0），1.4 mol·L-1 NaCl，3% CTAB，1% PVP-40，
20 µL β-巯基乙醇 (用时加入)]，CTAB 洗涤缓冲液
（76%乙醇，10 mmol·L-1 醋酸铵），氯仿:异戊醇
（24:1），异丙醇，TE 缓冲液（pH8.0）（10 mmol·L-1
Tris-HCl，1 mmol·L-1 EDTA），0.5 mol·L-1 EDTA
（pH8.0），3 mg·mL-1 蛋白酶 K，0.1 mol·L-1 PTB，
酚:氯仿（1:1），7.5 mol·L-1 醋酸铵。
1.2 DNA 的提取方法
边材和心材的基因组 DNA 分别用改良的
CTAB(3%)法、QIAGEN 试剂盒法和 PTB（N-
phenacylthiazolium bromide）法进行提取。
1.2.1 改良的CTAB法 取 0.5 g 木材粉末转移至 15
mL 离心管中并加入 4 mL 65℃预热的 3% CTAB 提
取缓冲液，混合均匀后 65℃水浴 2 h，期间不时颠
倒混匀；水浴结束后，混合物被等体积的氯仿:异戊
醇（24:1）抽提 2 次（5 000 r·min-1，离心 10 min）；
将上层水相转移至一新的 15 mL 离心管中，加入等
体积的预冷异丙醇并完全混匀后置于－20℃下过
夜；5 000 r·min-1，离心 20 min，倒去液体后用 1 mL
CTAB 洗涤缓冲液冲洗 2 次，室温下干燥；沉淀用
70%乙醇洗涤 2 次，并在室温下干燥；用 200 µL TE
溶解干燥后的沉淀，放入－20℃保存备用。
1.2.2 QIAGEN 试剂盒法 使用 QIAGEN 试剂盒法
提取心材和边材基因组 DNA 时需用 DNeasy Plant
Mini Kit（QIAGEN）和 DNeasy Plant Maxi Kit
（QIAGEN）中的 QIAshreder Maxi spin column。
相比较叶片和其他一些植物组织而言，使用
QIAGEN 试剂盒法提取木材 DNA 时需要对试剂盒
说明书中的前 2 个操作步骤进行改变，以利于提高
DNA 提取效率。将第 1 步改为：称取 1 g 木材粉末
放入到预冷研钵中并加入 4 mL Buffer AP1 浸泡 10
min；加入液氮和适量的石英砂到研钵中研磨湿的
木材粉末；用小勺转移样品到 50 mL 离心管中并用
1 mL Buffer AP1 冲洗小勺；加入 8 µL RNaseA，65
℃水浴 10 min，期间上下颠倒混匀 2～3 次；加入
1.625 mL Buffer AP2 到混合物中混匀，放置到冰上
5 min，12 000 r·min-1 离心 10 min。第 2 步骤改为：
慢慢倒出水相到 QIAshreder Maxi spin column 中，
离心后将浸湿的木材粉末用小勺加入到 QIAshreder
Maxi spin column 中继续离心，收集流出物。其他步
骤严格按照试剂盒说明书操作步骤进行。
1.2.3 PTB（N-phenacylthiazolium bromide）法 取
1 g 木材粉末转移至 50 mL 离心管中，加入 5 mL 0.5
mol·L-1 EDTA 使木材粉末完全浸没在 EDTA 中，室
温下放置 48 h 使其脱矿质；脱矿质结束后，加入 500
40 卷 4 期 余 敏等: 降香黄檀木材 DNA 提取方法的研究 605
µL 蛋白酶 K（MERCK）和 1 mL 0.1 mol·L-1 PTB
(Prime Organics)，使各组分混合均匀后 65℃水浴 12
h；水浴结束后加入等体积的酚:氯仿抽提，12 000
r·min-1 离心 10 min 后将上清液移至新离心管中；向
上清液中加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1），12 000
r·min-1 离心 10 min 将上清移至新 50 mL 离心管中，
重复此步骤；加入 2 倍体积冷无水乙醇和 500 µL 7.5
mol·L-1 醋酸铵，－20℃下存储 12 h 沉淀 DNA；结
束后 12 000 r·min-1 离心 20 min 倒去液体，沉淀用
80%乙醇洗涤 2 次并在 80%乙醇中静置过夜；12 000
r·min-1 离心 20 min 后室温下干燥，加入 200 µL TE
溶解沉淀后放入－20℃保存备用。
1.3 DNA 纯度和浓度的检测
3种方法提取的心材和边材基因组用NanoDrop
ND-1000 分光光度计检测样品的 A260 和 A280 的吸收
值，计算 A260/280 的比值，并用 1.0%琼脂糖凝胶电
泳检测 DNA 样品的完整性和降解程度。
1.4 基因组 DNA 的纯化
通过预实验结果发现，直接以 3 种方法提取的
基因组为模板扩增目的片段，扩增反应都是失败的，
这是由于未纯化的 DNA 原液中存在 PCR 反应的阻
抑物。故 3 种方法提取的心材和边材基因组在进行
PCR 反应之前都需要用 High Pure PCR Template
Preparation Kit (Roche)对其进行纯化处理。
1.5 PCR 扩增反应
选择扩增 rDNA ITS2（internal transcribed spacer
2）序列，根据 ITS2 两侧的保守序列 5.8S 和 26S 设
计引物，引物由上海 invitrogen 公司合成。
F(5-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3)
R(5-GACGCTTCTCCAGACTACAAT -3)
25 µL 的反应体系包括 TaKaRa LA Tap（5 U·µL-1）
0.3 µL，10×LA BufferⅡ2.5 µL，dNTP Mixture 1 µL，
上下游引物各 1 µL，纯化后的基因组模板 1 µL，其
余用灭菌的 ddH2O 补足 25 µL。扩增程序：94℃预
变性 5 min，94℃变性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延
伸 45 s，进行 40 个循环后 72℃延伸 10 min。以灭
菌的 ddH2O 代替模板 DNA 作空白对照。扩增产物
经 1.2%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
2 结果与分析
2.1 紫外分光光度计检测 DNA 质量
使用 NanoDrop ND-1000 分光光度计检测经
High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche)纯化
前和纯化后基因组的 A260、A280 并计算 A260/280 和
DNA 浓度。结果见表 1。
表 1 3 种 DNA 提取方法提取不同部位的 DNA 的质量和浓度
Table 1 Quality and concentration of DNA extraction in different zones by the three methods
纯化前 Before purification 纯化后 After purification 材料
Material
DNA 提取方法
DNA extraction method A260/280
浓度/ng·µL-1
Concentration A260/280
浓度/ng·µL-1
Concentration
边材
Sapwood
改良的 CTAB 法
Modified CTAB method 1.75 499.45 1.91 126.80
试剂盒法 Kit method 1.60 75.95 1.82 26.40
PTB 法 PTB method 1.83 937.38 1.92 62.94
心材
Heartwood
改良的 CTAB 法
Modified CTAB method 1.17 5.82 1.80 2.27
试剂盒法 Kit method 1.34 4.46 1.82 0.04
PTB 法 PTB method 1.16 806.56 1.88 18.80
通过试验数据可以看出，3 种方法从边材和心
材部位提取 DNA 浓度范围分别为：75.95～937.38
ng·µL-1，4.46～806.56 ng·µL-1，3 种方法提取的心材
和边材基因组除了 PTB 法提取的边材基因组纯度
较好外，其他各组样品均存在不同程度的蛋白质、
多糖和酚类污染，通过纯化操作后 3 种方法提取的
心材和边材基因组的纯度均得到提高，蛋白质、多
糖和酚类物质去除明显。使用 PTB 法提取的心材和
边材基因组浓度明显高于其他 2 种方法，经纯化操
作后由于降解成小片段的 DNA 在纯化过程中被洗
脱下了，造成各组样品浓度均有较大损失。3 种方
法提取的边材基因组经纯化后的浓度均能满足后续
的 PCR 反应要求，而只有 PTB 法提取的心材基因
组经纯化后的浓度能够满足后续的 PCR 反应要求。
木材中的 DNA 是否被成功提取出来是通过
PCR 反应是否成功扩增出目的片段来判断的，而不
是单纯地以紫外分光光度计检测样品中的 A260、A280
比值为指标来判断的。因为从木材中提取的 DNA
含有蛋白质、芳香族化合物、酚类和多糖等物质，
这些物质的存在会使紫外分光光度计不能准确的测
606 安 徽 农 业 大 学 学 报 2013 年
量出 DNA 的含量，而且由于木材存放环境的影响
多造成木材中常有内生细菌的污染，这些内生细菌
基因组的存在也会造成木材 DNA 含量不能准确被
紫外分光光度计准确的测量出来[6]。
2.2 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量
取 5 µL DNA提取液，用 1.0%琼脂糖凝胶在 100
V 电压条件下电泳 30 min，经 UVP 凝胶图像分析系
统检测，结果见图 1。
1～3 为边材分别用改良的 CTAB 法、试剂盒法和 PTB
法提取 DNA 琼脂糖检测条带; 4～6 为心材分别用 PTB 法、
改良的 CTAB 法和试剂盒法提取 DNA 琼脂糖检测条带
Lanes of 1-3 represent detection results of extracted DNA
from sapwood with modified CTAB method, kit method and
PTB method, respectively. Lanes of 4-6 represent detection
results of extracted DNA from heartwood with PTB method,
modified CTAB method and kit method, respectively
图 1 3 种方法提取木材不同部位基因组 DNA 电泳
Figure 1 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA from
wood in different zones by the three methods
通过基因组 DNA 凝胶电泳图可以看出，3 种方
法提取心材和边材基因组均呈现出不同程度的降
解。3 种方法提取的边材基因组降解的片段范围大
小从 100 bp 到 15 000 bp，其中改良的 CTAB 法提
取的基因组片段在 1 000 bp 以下更为集中。3 种方
法提取的心材基因组只有 PTB 法提取的基因组能
被检测出来并且都降解成为 2 000 bp 以下的片段。
改良的 CTAB 法和试剂盒法从心材中提取的
DNA 丰度低，且以这 2 种方法提取的 DNA 为模板
进行 PCR 扩增反应都是失败的。这 2 种方法提取的
DNA 浓度低，无法为 PCR 反应提供足够的模板。
这是由于在心材 DNA 提取过程中存在 Maillard 产
物和多糖类 PCR 抑制物质[7]。Maillard 反应的副产
物正是造成DNA氧化从而降低DNA质量和丰度的
原因。PTB 法能够成功的从心材中提取出 DNA，是
由于 PTB 能够切断 Maillard 反应中还原性糖和蛋白
质之间的交联键，帮助 DNA 从中释放出来[8]。
1～3 分别为改良的 CTAB 法、试剂盒法、PTB 法提取
边材基因组扩增 rDNA ITS2 序列；4 为 PTB 法提取的心材
基因组扩增 rDNA ITS2 序列；CK：空白对照
Lanes of 1-3 represent amplified rDNA ITS2 band using
extracted DNA from sapwood with modified CTAB method, kit
method and PTB method, respectively; lane 4 represents ampli-
fied rDNA ITS2 band using extracted DNA from heartwood
with PTB method; CK，blank control
图 2 PCR 扩增 rDNA ITS2 序列凝胶电泳
Figure 2 Agarose gel electrophoresis pattern of PCR products
of amplificated rDNA ITS2
2.3 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物
以纯化过的 3 种方法提取的边材基因组和 PTB
法提取的心材基因组为模板，在 BIO-RAD C1000
PCR 仪上扩增 rDNA ITS2 序列，扩增结束后取 5 µL
PCR 产物，用 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测（见图 2）。
通过图 2 可以看出，各泳道的 PCR 目的条带特
异性好、丰度高。由于木材中存在许多如多糖、单
宁、木质素和蛋白质等化合物，这些化合物的存在
会严重干扰和抑制 PCR 扩增反应的顺利进行[9]。如
果直接以未纯化的基因组为模板来扩增目的条带，
结果都是无法扩增出来的，我们通过对提取的 DNA
进行纯化操作以后，PCR 反应都能够顺利进行。说
明经纯化操作之后得到的基因组 DNA 能够符合分
子生物学操作要求。
3 小结与讨论
早在 20 世纪 70 年代，对木质部管状分子（TE）
分化的细胞学以及DNA含量的变化就有许多研究，
许多研究都已证明 TE 的分化是一种典型的细胞编
程性死亡[10]（PCD）。具有一定功能的边材细胞向
心材转变的过程发生在木质部细胞 PCD 过程的降
解清除阶段。TE 逐渐失去其原生质体，各种细胞器
和细胞核开始降解，DNA 片段化产生 DNA led-
der[11]，最终细胞器消失，片段化的 DNA 附着在细
40 卷 4 期 余 敏等: 降香黄檀木材 DNA 提取方法的研究 607
胞壁上，直至心材中所有细胞死亡。
相比较那些新鲜、幼嫩且具有分生能力的植物
组织而言，从木材组织中提取和扩增 DNA 要困难
的多。主要体现在以下几个方面：（1）木材组织中
存在的 DNA 数量和质量都较低，且都降解成小片
段[12]。（2）木材组织中存在有厚壁的管状分子，导
致在研磨处理这些坚硬的组织时更易产生高温，从
而进一步损伤 DNA 分子。（3）木材中存在一些如
蛋白质、酚类、多糖、单宁和色素等物质，这些物
质往往会影响 DNA 聚合酶的活性，干扰引物与模
板的结合，从而导致 PCR 扩增的失败[6]。（4）木材
存储环境的影响，如潮湿环境下极易造成木材腐朽
和真菌污染，导致 DNA 的进一步降解和污染[13]。
本试验通过 3 种方法分别对降香黄檀气干木材
的心材和边材进行基因组 DNA 提取、纯化并进行
PCR 扩增 rDNA-ITS2 序列。通过试验结果可以看
出，3 种方法都能够从边材组织中提取出 DNA，PTB
法更适合从心材组织中提取 DNA，通过纯化处理
后，从心材和边材中提取的 DNA 都能够进行 PCR
扩增反应并扩增出目的条带，为实现以 rDNA 的
ITS 序列来标记识别木材奠定了基础。
参考文献：
[1] 邱治军, 周光益, 陈升华. 海南特有珍贵红木树种-降
香黄檀[J]. 林业实用技术, 2004(6): 41-42.
[2] 李桂兰, 徐峰, 罗建举, 等. 海南香枝木与越南香枝木
木材构造特征比较解剖研究[J]. 广西农业生物科学,
2008, 27(2): 154-157.
[3] 任洪娥, 高洁, 马岩. 我国木材材种识别技术的新进展
[J]. 木材加工机械, 2007(4): 38-41.
[4] Gugerli F, Parducci L, Petit R J. Ancient plant DNA: re-
view and prospects [J]. New Phytologist, 2005, 166(2):
409-418.
[5] Yoshida K, Kagawa A, Nishiguchi M. Extraction and de-
tection of DNA from wood for species identification [C]//
Proceedings of the international symposium on develop-
ment of improved methods to identify shorea species
wood and its origin. 2007(1): 27-34.
[6] Rachmayanti Y, Leinemann L, Gailing O, et al. DNA from
processed and unprocessed wood: factors influencing the
isolation success[J]. Forensic Science International Ge-
netics, 2009, 3(3): 185-192.
[7] Shepherd M, Cross M, Stokoe R L, et al. High-throughput
DNA extraction from forest trees [J]. Plant Molecular Bi-
ology Reporter, 2002, 20: 425a-425j.
[8] Asif M J, Cannon C H. DNA extraction from processed
wood: a case study for the identification of an endangered
timber species (Gonystylus bancanus)[J]. Plant Molecular
Biology Reporter, 2005, 23: 185-192.
[9] Pandey R N, Adams R P, Flournoy L E. Inhibition of ran-
dom amplified polymorphic DNAs (RAPDs) by plant
polysaccharides[J]. Plant Molecular Biology Reporter,
1996, 14(1): 17-22.
[10] Fukuda H. Programmed cell death of tracheary elements
as a paradigm in plants [J]. Plant Molecular Biology, 2000,
44: 245-253.
[11] 崔克明. 植物发育生物学[M]. 北京: 北京大学出版社,
2007: 183-189.
[12] Reynolds M M, Williams C G. Extracting DNA from
submerged pine wood [J]. Genome, 2004, 47(5): 994-997.
[13] Finkeldey R, Leinemann L, Gailing O. Molecular genetic
tools to infer the origin of forest plants and wood[J]. Ap-
plied Microbiology and Biotechnology, 2010, 85(5):
1251-1258.