全 文 ： 论著 文章编号:1007 -8738(2006)01 - 0026 - 04
香加皮羽扇豆烷乙酸酯 (CPLA)对树突状细胞分化成熟的影响
张　静 1 , 单保恩 1* , 张　超 1 , 赵瑞撵 1 , 李启亮1 , 刘江惠 2 , 李巧敏 1 , 李润青 1
(1河北医科大学第四医院科研中心 , 2河北省肿瘤研究所 , 河北 石家庄 050011)
收稿日期:2005 - 08 -05;修回日期:2005 - 09 -05
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No. 3037153);河北省自然科
学基金资助项目(No. C2004000610 )
作者简介:张　静(1972 - ), 女 , 河北正定人 , 主治医师 , 博士生.
*Correspond ing au thor, Emai l:baoensh an@ yahoo. com. cn
Tel:(0311)86033941-290
The effect on the differentiation and
maturation of dendrit ic cells by lupane
acetate of cortex periplocae
ZHANG J ing
1 , SHAN Bao-en1* , ZHANG Chao1 , ZHAO
Rui-nian1 , LI Q i-liang1 , LIU J iang-hui2 , LI Q iao-
m in
1 , LI Run-qing1
1Research Center, the Fourth Hospita l of Hebei Medica l Unive rsity;
2Hebei P rovincial C ancer Institu te, Shijiazhuang 050011, Ch ina
[ Abstrac t] 　AIM:To investiga te the e ffec t o f lupane ac-
e tate o f co rtex pe rip locae (CPLA) on the d iffe ren tia tion,
matu ration and mi m une ac tiv ity o f human periphe ra l b lood
m ononuc lea r ce ll(PBMC)-de rived dend ritic ce lls (DCs) in
v itro. METHOD S:PBMC iso la ted from human per iphe ra l
b lood was cu ltu red w ith GM-CSF, IL-4 fo r 5 d and stmi u la-
ted w ith TNF-α(as pos itive contro l) o r CPLA to induce
DCs. The m orpho log ica l cha racte ristics of DC were ob-
served unde r inve rted m icroscope and transm isson e lectron
m icroscope. The exp ress ions o f CD1a, CD83, CD80 and
CD86 were ana lyzed by flow cytome try. IL-12, IFN-γ pro-
duction in the cu lture superna tan t o f DCs was de tected by
EL ISA. MTTm ethodw as used to de term ine the p ro life ration
o f T ce lls stmi u la ted by DCs. RESULTS:A fte r 10-days cu l-
ture w ith cytok ines and CPLA, PBMC deve loped in tom atu re
DCs w ith typ ica lm orpho log ica l charac te ristics and h igh ex-
p ressions o f CD1a, CD83, CD80 and CD86 on the ce llu lar
sur face (P <0. 05). CPLA enhanced IL-12 and IFN-γ pro-
duction by DCs (P <0. 05). CPLA-trea ted DC s marked ly
stmi u la ted p ro lifera tion o f T ce lls (P <0. 05). CONCLU-
SION:CPLA may induce the d iffe ren tia tion and m atu ration
o f DC, up-regu la te cytok ines p roduction and increase the
mi m une ac tiv ity o f DC.
[ Keywords] lupane aceta te o f co rtex pe rip locae (CPLA);
dend r itic ce ll; induce;mi mune activ ity
[摘 要 ] 　目的:探讨香加皮羽扇豆烷乙酸酯 (CPLA)对人外
周血单个核细胞(PBMC)来源的树突状细胞(DC)在体外分化
成熟及免疫活性的影响。方法:从人外周血分离单个核细胞 ,
与细胞因子 GM-CSF、 IL-4共培养 , 于第 5天加入 DC的促成
熟刺激剂 TNF-α(阳性对照组)或 CPLA。倒置显微镜和透射
电镜下观察 DC的形态;应用流式细胞术检测成熟 DC的表面
标志 CD1a、 CD83、 CD80和 CD86的表达情况;用 ELISA检测
DC培养上清中 IL-12和 IFN-γ的含量;用 MTT法测定 DC刺
激 T细胞增殖的能力。结果:培养 10 d后 , 经 CPLA刺激的
PBMC呈现出典型 DC的形态学特征;成熟 DC的特征性表面
分子 CD1a、 CD83、 CD80和 CD86表达水平均明显上调(P <
0. 05);细胞培养上清中 IL-12和 IFN-γ含量明显增高 (P <
0. 05);刺激 T细胞增殖的能力明显增强 (P <0. 05)。结论:
CPLA可诱导 PBM C来源的 DC分化成熟 , 并可促进其细胞因
子的分泌 , 增强 DC的免疫调节活性。
[关键词 ] 香加皮羽扇豆烷乙酸酯(CPLA);树突状细胞;诱
导;免疫活性
[中图分类号 ] R285. 5;R392. 12　　[文献标识码 ] A
　　树突状细胞 (dendritic ce ll, DC)是目前所知的机
体内功能最强的专职抗原提呈细胞 , 其最大特点是
能激活初始 T细胞 , 堪称机体免疫反应的始动者 [ 1] ,
而 DC成熟与否对其功能的发挥起关键作用 [ 2] 。人
体内 DC数量少且分布广泛 , 常无法满足实验研究和
临床应用的需要 , 因此 , 如何在体外通过刺激扩增获
得足够数量的成熟 DC , 以诱导特异性细胞免疫反
应 , 是对 DC研究的主要方向之一 。本课题组在分
离 、纯化中药香加皮 (Cortex Periplocae)有效成分过
程中 , 获得了数个单体成分 , 通过筛选实验发现 , 其
羽扇豆烷乙酸酯 ( lupane aceta te)成分具有刺激 DC分
化成熟的活性。在本实验中 , 就香加皮羽扇豆烷乙
酸酯 (lupane aceta te o f Cortex Perip locae, CPLA)对人
外周血单个核细胞(PBMC)来源的 DC分化成熟及功
能的影响作一研究。
1　材料和方法
1. 1　材料　健康人外周血购自河北省血液中心。香加皮羽
扇豆烷乙酸酯(CPLA)由本课题的合作单位华北制药集团新
26 ISSN1007 -8738细胞与分子免疫学杂志(Ch in J Ce llM ol Immuno l)2006, 22(1)
DOI牶牨牥牣牨牫牬牪牫牤j牣cnki牣cjcmi牣牥牥牫牳牨牱
药研究开发中心分离纯化。 GM-CSF、 IL-4及 TNF-α购自
R＆D公司。 F ITC标记的抗 CD80、 CD83抗体 , PE标记的抗
CD1a、 CD86抗体购自 B ioLegend公司。 RPM I1640为 G IBCO
公司产品。M TT为 S igm a公司产品。人 IL-12(p70) ELISA试
剂盒和人 IFN-γELISA试剂盒购自晶美生物工程有限公司。
丝裂霉素 C为浙江海正药业公司产品。 淋巴细胞分离液
(F ico ll)为上海生化试剂二厂产品。胎牛血清为杭州四季青
公司产品。
1. 2　方法
1. 2. 1　人外周血单个核细胞的获取　取健康人外周血 , 用淋
巴细胞分离液(F ico ll)密度梯度离心法分离 PBMC。用 PBS洗
去血小板 , 以含 100 mL /L胎牛血清的 RPM I1640培养基调整
细胞浓度为 3×109 /L, 加入 6孔板中 , 3 m L /孔 , 培养 2 h, 收
集非贴壁细胞 , 尼龙毛柱分离法分离 T细胞亚群 [ 3] 。贴壁细
胞每孔加入 3 mL RPM I1640完全培养基。
1. 2. 2　DC的体外诱导培养　于方法 1. 2. 1中得到的贴壁细
胞培养液中加入 GM-CSF(终浓度为 1×106 U /L)和 IL-4(终
浓度为 1. 5×104 ng /L), 分 3组进行 DC的诱导培养:阴性对
照组只加 GM-CSF和 IL-4培养 10 d;阳性对照组于培养 5 d
后加入 TNF-α(终浓度为 2. 0×104 ng /L)继续培养 5 d;药物
组于培养 5 d后加入 CPLA(终浓度为 5. 0×104 ng /L)继续培
养 5 d。各组均于 37℃、 50 m L /L CO2条件下培养 , 隔日半量
换液 , 倒置显微镜下每日观察其生长状态及形态变化。培养
10 d后收集悬浮细胞供鉴定和实验用 , 同时保留各组的培养
上清以检测 IL-12和 IFN-γ的含量。
1. 2. 3　透射电镜观察 DC的超微结构　收集诱导培养 10 d
的 DC(约 1×106个细胞 ), PBS洗涤 2次 , 用 25 g /L戊二醛
及 10 g /L的锇酸固定 , 经乙醇梯度脱水 , 超薄切片经铅铀染
色后置透射电镜下观察 、摄片。
1. 2. 4　DC的表型分析　收集培养 10 d的各组 DC , 调整细
胞浓度为 1×109 /L, PBS洗涤 2次 , 分别加入两两组合的标
记抗体 , 即 PE-抗 CD1a和 F ITC-抗 CD83、 F ITC-抗 CD80和
PE-抗 CD86, 于 4℃避光反应 30 m in, 流式细胞术检测 DC表
面成熟标志分子的表达。
1. 2. 5　T细胞增殖反应　将经鉴定后不同实验组的成熟 DC,
用丝裂霉素 C(25 m g /L)处理 45 m in去增殖活性后作为刺激
细胞 , 与方法 1. 2. 1中制备的 T细胞 , 按 1∶10、 1∶50及 1∶100
的效靶比例加入 96孔板 , 终体积为 200 μL /孔 , 每组设 3个
复孔 , 其中 T细胞为 2×105 /孔。于 37℃、 50 m L /L CO2条件
下培养 72 h, 每孔加入 M TT 20 μL(5 g /L)继续培养 4 h, 离
心 , 弃上清 , 加入 DM SO 150 μL /孔 , 震荡 10 m in, 用酶标仪
检测 A
570
值 , 结果用 3孔均值表示。
1. 2. 6　细胞因子的检测　取方法 1. 2. 2中所得的培养 10 d
的各组 DC培养上清 , 用 ELISA法测定 IL-12和 IFN-γ的含
量 , 按试剂盒操作说明书进行检测 , 每组设 3个复孔。
1. 2. 7　统计学分析　应用 SPSS10. 0软件包进行统计处理 ,
结果以 x±s表示 , 组间比较采用单因素方差分析 , P <0. 05
具有显著性差异。
2　结果
2. 1　DC的生长状态和形态观察　经 CPLA诱导 PBMC分化
为 DC的过程中 , 其形态发生动态变化。培养第 1天 , 可见细
胞体积较小而均匀散在分布;第 3天时细胞开始悬浮 , 聚集
成簇;随着培养时间的延长 , 悬浮细胞逐渐增多 , 形态不规
则 , 体积增大 , 呈簇状生长;培养至第 8天 , 成簇的细胞分
散 , 增大的胞体表面可见毛刺状突起。阴性对照组细胞胞膜
突起较少 , 而 CPLA和 TNF-α阳性对照组细胞呈典型树突状
细胞形态 , 此两组细胞形态未发现差异(图 1)。
图 1　DC形态的倒置显微镜观察结果
F ig 1　Them o rphology of DC s observed by inver ted m icroscope
1:Cu ltured for 5 d(×200);2:C u ltu red for 9 d (×400). A, B:Con trol
group;C, D:TNF-αgroup;E, F:CPLA group.
27ISSN1007 -8738细胞与分子免疫学杂志(Chin J Ce llM o l Immuno l)2006, 22(1)
2. 2　DC的超微结构观察　培养 10 d后 , 经 CPLA诱导的细
胞表现出成熟 DC 的超微结构变化 , 透射电镜下 CPLA 和
TNF-α刺激组 DC表面可见大量粗细不等的树枝状突起 , 细
胞核大而不规则 , 多偏于一侧 , 胞质中线粒体丰富 , 溶酶体
少见甚至没有;阴性对照组细胞则呈现少而粗糙的突起 , 胞
内可见大量溶酶体和空泡(图 2)。
图 2　透射电镜下 DC的超微结构观察
F ig 2　U ltrastructure of DC observed by transm isson e lectron m i-
c roscope
A:C on trol group;B:TNF-α group;C:CPLA group.
2. 3　CPLA对 DC表面标志分子表达的影响　与未用成熟刺
激因子作用的阴性对照组相比 , CPLA 刺激组中 DC表面
CD1a、 CD83、 CD80 和 CD86 的表达水平均显著增加 (P <
0. 05);以 CD86表达水平为最高(93. 35 ±6. 25)%。 这些表
面分子的表达水平 , 除 CD86外 , 稍低于 TNF-α刺激组 , 但差
异无统计学意义(P >0. 05, 图 3)。提示 CPLA可促进 DC的
分化成熟。
图 3　不同刺激剂对 DC表型的影响
F ig 3　Effec ts o f d iffe rent stimu la tors on the pheno types o f DCs
aP <0. 05 vs contro l group.
2. 4　CPLA对 DC刺激 T细胞增殖反应的影响　经 5. 0 ×
104 ng /L CPLA诱导的 DC可明显促进 T细胞的增殖 , 显著高
于阴性对照组(P <0. 05), 且随效靶比 (DC /T)的增加而增
强 , 与 TNF-α刺激组无明显差异(P >0. 05, 图 4)。
2. 5　CPLA对 DC分泌细胞因子的影响　CPLA与 TNF-α刺
激组 DC培养上清中 IL-12和 IFN-γ的含量均明显高于阴性对
照组(P <0. 05), 但 IFN-γ的分泌水平远不及 IL-12。而 CP-
LA刺激组的 DC培养上清中 IL-12及 IFN-γ含量与 TNF-α刺
激组相比 , 均无显著性差异(P >0. 05, 见表 1)。
图 4　不同刺激剂诱导的 DC对 T细胞增殖反应的影响
F ig 4　The effec t on the proliferation of T ce lls by DC s co-cul-
tured w ith differen t stim ula to rs
表 1　不同刺激剂对 DC分泌细胞因子的影响
Tab 1　 The e ffect on cy tok ines p roduction by DC s co-cultured
w ith differen t stim ula to rs (ng /L)
Group IL-12 IFN-γ
C on trol 20. 17±3. 51 6. 11±4. 52
TNF-α 246. 92±11. 52 34. 49±7. 61
CPLA 252. 68±17. 78a 30. 36±5. 86a
aP <0. 05 vs con trol group.
3　讨论
PBMC是 DC和巨噬细胞的共同前体 。大量研究
已证实 , 从 PBMC中可以诱导具有免疫活性的高纯
度成熟 DC , 且外周血取材简单方便 , 是体外获得 DC
的重要途径。在诱导 DC分化 、成熟的培养过程中 ,
GM-CSF、 IL-4可促进单个核细胞向 DC方向转化 [ 4] ,
同时抑制粒细胞 、巨噬细胞的产生 , 获得纯净的未成
熟 DC , 并维持 DC的强抗原提呈能力[ 5] ;TNF-α可
促进 DC的成熟 , 使 DC具有强的刺激 T细胞的活
性[ 6] 。非成熟 DC与成熟 DC的功能差异很大 , 只有
成熟 DC才能激活初始 T细胞增殖 , 诱导其产生特异
性 CTL效应。目前已发现可诱导 DC成熟的多种刺
激因子 , 如 TNF-α、 LPS、 CD40L和 MBL等 [ 7] , 但因
它们有一定的细胞毒性或作用尚未确定而限制了在
体内的应用。本研究中 , 以 PBMC为前体细胞 , 在
GM-CSF、 IL-4诱导分化出未成熟 DC的基础上 , 以
CPLA为诱导 DC成熟的刺激剂 , 结果获得了具有典
型形态 、表型及功能的成熟 DC。
本研究结果显示 , 经 CPLA刺激后的 DC具有典
型成熟 DC的形态学特征 , 表现为细胞体积较大 , 形
态不规则 , 表面有大量树突状或星形突起 , 胞质线粒
体丰富 , 溶酶体少见。通过表型分析发现 , CPLA刺
(下转 32页 )
28 ISSN1007 -8738细胞与分子免疫学杂志(Ch in J Ce llM ol Immuno l)2006, 22(1)
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(上接 28页)
激组 DC高表达 CD1a、 CD83分子和协同刺激分子
CD80、 CD86。有学者认为 [ 8] , CD1a是鉴定人外周血
DC的最好标记 , 目前主要采用 CD1a阳性细胞数的
多少来反映 DC的数量 。 Rouard等[ 9]发现 , CD83分
子是 DC成熟的相对特异性标志 , 表达 CD83分子的
DC激活 T细胞功能最强。另外 , 表面高表达协同刺
激分子 CD80、 CD86也是成熟 DC的重要特征 , 尽管
CD80与 CD86对促进 T细胞的活化都很重要 , 但后
者在 DC激活 T 细胞中居于主导地位 [ 10] , 故增强
CD86的表达可能是某些促成熟因子调控 T细胞应答
的一个重要机制 。本研究结果显示 , 经 CPLA刺激后
的 DC具有典型的表型特征 , 且其表面分子中 CD86
的表达最高 , 说明 CPLA能促进 DC的成熟 , 是很有
潜力的免疫调节剂。
本研究显示 , 经 CPLA刺激而获得的 DC具有很
强的刺激 T细胞增殖的能力 , 其作用强度与 TNF-α
相近 , 且随效靶比的增加而增强。 DC的这种作用可
能是通过分泌 IL-12来实现的 , 本实验结果也证实了
这一点。另外 , 在培养上清中检测到一定水平的
INF-γ。
中药香加皮为天然药物 , 其羽扇豆烷乙酸酯成
分具有毒副作用小 、价格低廉的优势 。本研究结果
提示 CPLA在体外可诱导 PBMC来源的 DC分化成
熟 , 并可增加 IL-12和 IFN-γ的分泌 , 增强 DC的免
疫活性 。该研究结果为香加皮的进一步开发利用提
供了实验依据。
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