全 文 ：第 32卷　第 9期 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) Vol. 32 No. 9
2004年 9月 Jour. of No rthw est Sci-Tech Univ . o f Agri. a nd Fo r. ( Na t. Sci. Ed. ) Sep. 2004
石斑鱼生长激素基因的合成及其
在拟南芥中的表达
肖生科 1, 2 ,王　磊 1 ,胡治球1 ,陈毓荃 2
( 1中国农业科学院生物技术研究所 ,北京 100081;
2西北农林科技大学生命科学学院 ,陕西杨凌 712100)
　　 [摘　要 ]　为了使石斑鱼生长激素基因适合在植物中表达 ,重新合成了石斑鱼生长激素基因 ,对其密码子进
行了优化 ,把合成的基因构建于植物表达载体 pBI 121上并转化模式植物拟南芥 ,获得了 30个转基因抗性植株。对
24株 PC R阳性苗进行 Nor thern blo tting分析 ,结果表明 ,鱼类生长激素基因可以在转基因植物中表达 ,其表达在不
同的转基因植株中存在明显差异 ,表达最强的植株与最弱的植株相比 ,二者表达量差异达到 43倍。
[关键词 ]　石斑鱼 ;鱼生长激素 ;转基因 ;拟南芥
[中图分类号 ]　 Q786　　　　 [文献标识码 ]　 A [文章编号 ]　 1671-9387( 2004) 09-0057-04
　　生长激素 ( GH)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分
泌的一种单一肽链的蛋白质激素 ,分子质量一般为
22 ku。 它是一种具有广泛生理功能的生长调节素 ,
能影响几乎所有的组织类型和细胞 ,甚至包括免疫
组织、脑组织及造血系统 ,主要作用是刺激骨、软骨
细胞的生长和分化 ,调节蛋白质、糖及脂肪的代
谢 [1 ]。
鱼类生长激素能够促进鱼体生长 ,加速蛋白质
合成和脂类降解 ,促进鲑科鱼类和罗非鱼等多种鱼
类的低渗调控和海水适应过程 ,参与多种促合成代
谢作用 ,如在鱼、虾人工饲料中常常加入虾头粉以促
进其生长 ,虾头粉中含有脑垂体产生的生长激素。直
接应用生长激素养殖鱼、虾的试验证明 [2 ] ,体外添加
生长激素也能促进鱼、虾的生长 ,并能提高饵料的转
化效率。鉴于 GH在鱼类养殖领域所具有的巨大应
用前景 ,鱼生长激素在水产养殖中的应用研究已经
广泛展开。
目前 ,鱼类生长激素基因工程研究主要集中在
GH基因的克隆及其在大肠杆菌和酵母中的高效表
达方面 ,通过外源生长激素在工程菌内的大量表达 ,
纯化之后可以得到大量的生长激素 ,将表达的生长
激素浸渍或加入饲料中喂食鱼虾。研究表明 [3, 4 ] ,用
基因工程方法生产的重组鱼生长激素具有生物学活
性 ,能够通过口服经肠道被鱼体吸收 ,具有很强的促
生长作用。本研究把石斑鱼生长激素转入拟南芥 ,尝
试利用植物来生产鱼类生长激素的新途径。
1　材料与方法
1. 1　材　料
1. 1. 1　植物材料　用于基因转化的拟南芥由本实
验室保存。
1. 1. 2　菌　株　大肠杆菌 E. col i JM 109,农杆菌菌
种 GV 3101由本实验室保存。
1. 1. 3　石斑鱼生长激素基因及载体　石斑鱼生长
激素基因原序列由中山大学林浩然院士提供 ( Gen-
Bank登录号 AY038606) ,序列与张为民等 [5 ]报道的
一致 ; pBluescriptⅡ SK( - )及 pBI 121载体由本实
验室保存。
1. 1. 4　试剂盒　质粒 DNA提取用 Promega公司的
Wizard
TM
Minipreps DN A Puri fica tion System,回收
DNA用鼎国公司的 DNA片段快速纯化 /回收试剂
盒。
1. 1. 5　酶与化学试剂　各种限制性内切酶和修饰
酶分别购自 Promega公司、 New England Bio lab公
司和 Gibco公司 , EB和 Aga ro se购自 Sigma公司 ,其
他化学药品均为国产分析纯。
[收稿日期 ]　 2004-03-18
[基金项目 ]　中国农业科学院科研项目
[作者简介 ]　肖生科 ( 1973- ) ,男 ,甘肃景泰人 ,在读硕士 ,主要从事生物化学与分子生物学研究。
[通讯作者 ]　陈毓荃 ( 1943- ) ,男 ,河北坝州人 ,教授 ,主要从事植物蛋白质研究。
DOI : 10. 13207 /j . cnki . jnwaf u. 2004. 09. 013
1. 1. 6　引物合成与测序　引物合成由北京奥科公
司完成 ,测序由上海博亚生物技术有限公司完成。
1. 2　方　法
1. 2. 1　石斑鱼生长激素基因的合成　共设计合成
26个寡核苷酸片段 (平均每段为 50 nt) ,合成片段磷
酸化 ,体系如下: 基因片段 3μL ( 10μmol /L ) , T4
PNK 1μL, T4 PN K Buf fer ( 10× ) 1μL, 10 mmol /L
A TP 1μL,灭菌水 9. 5μL,将此体系置于 37℃合成
反应 40 min。
退火: 分别取 0. 5μL经磷酸化处理的片段 , T4
PNK Buffer( 5× ) 6μL,加灭菌水至 30μL,然后依
次按 90℃ 2 min, 65℃ 10 min, 37℃ 10 min, 25℃
5 min处理 ,最后于 - 20℃保存备用。
连接:取退火体系 3μL, T4 ligase 1μL, T4 lig ase
Buffer( 10× ) 1μL (约 80 ng ) ,处理好 pBluescript
Ⅱ SK( - )载体 ( EcoR V , SacⅠ 酶切后纯化 ) 5μL
(约 20 ng ) ,置于 16℃培养 20 h。电击法转化 E. col i
JM 109,涂平皿培养。 挑单菌 ,过夜培养后少量提取
质粒 ,酶切鉴定获得所需的阳性克隆后测序。
1. 2. 2　植物表达载体构建及农杆菌转化　 ( 1)载体
构建。将测序正确的克隆用 EcoRⅤ和 SacⅠ 酶切 ,纯
化约为 630 bp的 GH基因片段 ;植物表达载体 pBI
121用 SmaⅠ和 SacⅠ酶切 ,回收约 11 kb的载体。连
接时取 3μL GH基因片断 (约 20 ng ) , pBI 121载体 5
μL(约 40 ng ) , T4 lig ase 1μL, T4 ligase Buffer( 10× )
1μL,置于 16℃培养 20 h。 电击法转化 E. col i
JM 109,挑出阳性克隆。
( 2)农杆菌转化。取20μL GV 3101感受态细胞 ,
加入 1μL测序正确的 pBI GH质粒 ,电击转化后 , 28
℃ 250 r /min恢复培养 3 h。取 200μL涂布到 YEB
抗性平板上 ( Kan 50 mg /L , Ref 50 mg /L) , 28℃培
养 2～ 3 d。从转化的平板上挑取 2个单菌落 ,提取质
粒 , PCR检测。
1. 2. 3　拟南芥转化　挑取 1个检测正确的农杆菌
单菌落接到 YEB液体培养基中过夜培养 ,按体积比
1∶ 400转接到 200 mL新鲜的 YEB液体培养基中生
长至 OD600= 1. 8～ 2. 0,离心收集菌体 ,用 400 mL 1 /
2 M S悬起 ,加入体积分数 0. 05% Silw et L-77,把拟
南芥的花蕾浸入农杆菌渗透液中 ,抽真空 ( 0. 85 Pa,
保持 5 min)。转化完毕后 ,花盆外套上塑料袋 ,水平
放置 ,使其在低光强度下生长 24～ 48 h后 ,即可正
常培养。
1. 2. 4　转基因阳性苗筛选　称 25～ 30 mg种子放
入 1. 5 mL离心管 ,加 1 mL体积分数 75%的乙醇
(含体积分数 0. 05% Tween 20) ,于摇床上摇 10 min
( 300 r /min) ,离心 ,去上清液 ;加 1 mL体积分数
95%的乙醇洗 1次 ,离心 ,去上清液 ;重复洗 1次 ;在
超净台中向洗过的种子加 0. 3 mL体积分数 100%乙
醇 ,移到无菌滤纸上 ,吹干。将吹干的种子撒到 1 /2
M S平板 ( Kan50 mg / L )上 , 4℃放 2 d后 ,于 22℃ , 16 h
光照培养。 将阳性植株 ( T1代 )移栽到盆中培养 ,收
集种子进行 T2代筛选。同样的方法筛选 T3和 T4代
转基因苗 ,直到获得纯系的种子。
1. 2. 5　基因组 DNA的提取及 PCR检测　 ( 1)基因
组 DNA的提取。拟南芥基因组 DNA的提取方法参
照十六烷基三甲基溴化铵 ( C TAB)法。 在液氮中研
磨 0. 1～ 0. 2 g拟南芥叶片 ,转移至 1. 5 mL离心管
中 ,加入 0. 7 mL CTAB ( 100 mmo l /L Tris, 1. 4
mo l /L NaCl, 20 mmol /L EDT A, 2% CTAB,体积
分数 0. 1%巯基乙醇 ) , 60℃静置 30 min,加 0. 7 mL
体积比为 1∶ 1的酚∶氯仿 ,颠倒几次 , 10 000 r /min
离心 5 min;转移上清液至一新的离心管 ,加等体积
的氯仿∶异戊醇 ( 24∶ 1) ,混匀 , 10 000 r /min离心 5
min,转移上清液至一新的离心管 ,加等体积的异丙
醇 ,颠倒混匀 , 10 000 r /min离心 10 min,除去上清
液 ,用体积分数 70%乙醇洗 1次 ,抽干 ,溶于 50μL的
无菌水中。
( 2)转基因植株的 PCR检测。上游引物为 35S启
动 子 引 物 ( 5′-TCTGCCGACAG TGG TCCCAA-
3′) ,下游引物为 GH引物 ( 5′-T TAGAGGGT ACA-
GTT AGCT TC-3′) ; 反应体系: 转基因植株 DNA
1μL( 20～ 50 ng ) , 10× buffer 2μL; M gCl2 ( 2. 5
mmol /L ) 2 μL, Taq 酶 0. 2 μL, dN TP ( 2. 5
mmol /L) 2μL,引物各加 1μL( 10μmo l /L) ;加无菌
水至 20μL。反应条件: 94℃ 5 min, 94℃ 45 s, 60℃
45 s, 72℃ 2 min; 35个循环 ; 72℃延伸 5 min。
1. 2. 6　 Northern blo t ting　用 PCR检测阳性的拟
南芥提取总 RNA。 按 Promega公司的 RNAgents
To tal RN A Isola tion System ki t进行 ,提取总 RNA
约 50μg, TBE胶电泳检测其是否有降解 ,然后用于
Northern blo t ting ,方法参照植物分子生物学及生
物技术的实用方法 [6 ]。
2　结果与分析
2. 1　石斑鱼生长激素的改造
　　将合成的寡核苷酸磷酸化后退火 ,直接克隆到
pBluescript Ⅱ SK( - )载体上 ,提取质粒后酶切出
约 660 bp的条带 (图 1) ,挑选酶切正确的克隆进行
58 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 32卷
测序 ,结果表明 ,合成的 GH片段与原石斑鱼生长激
素基因的蛋白序列完全一致。 将 GH连接到植物表
达载体 pBI 121上 ,获得 pBIGH质粒 ,酶切及测序结
果表明 , GH已正确插入到 pBI 121载体上 (图 2)。为
了使来源于石斑鱼的生长激素在植物体内得到有效
表达 ,在不改变氨基酸的情况下 ,根据 Frederick
等 [7 ]报道的原则对 GH基因进行了改造 ,把在植物
中使用频率很低的密码子改变为植物优化密码子 ,
使之适应在植物中高效翻译的要求 , GC比例由原
来的 55. 5%下降到 45. 7% ,符合大多数植物外显子
46% ～ 49%的比例 ;考虑到真核生物起始密码子附
近的序列会影响翻译起始的效率 ,因此 ,合成基因时
使其序列符合 Kozak序列 ( AACAATGG,其中+ 4
位的 G和 - 3位的 A对翻译的准确起始非常重要 ) ;
采用植物最常用的终止序列 CTAAA,同时注意防
止一些不稳定序列 ,如 AT TT A和 Poly ( A)加尾信
号序列及其他可能的不稳定序列的出现。
2. 2　转基因植株的获得及分析检测
采用真空渗透法转化 3株拟南芥 ,收获种子 ,经
卡那霉素筛选 ,共获得 30个抗卡那霉素的转基因植
株 ,转化率约为 1% 。对获得的转基因植株进行 PCR
检测 ,上游用 35S引物 ,距插入基因的多克隆位点
200 bp;下游用 GH基因末端引物对转基因植株进
行 PCR检测 ,可扩增出约 830 bp的 DNA片段 , PCR
检测结果表明 ,其中有 24株为阳性苗 ,阳性率为
80% (图 3)。
图 3　部分转基因植株的 PCR检测
M. 100 bp DNA分子质量标准 ; W T.未转基因的野生型拟南芥 ; 1～ 9.转 GH基因拟南芥的不同植株
Fig. 3　 PCR detection o f pa r tial transgenic plant
M. 100 bp DNA Ladder; WT. Non-t ransgenic widetype A rabidop sis; 1- 9. Di fferen t t rans genic plants
　　为了进一步分析外源基因 GH在转基因植株中
的表达情况 ,提取总 RNA进行 Nor thern blo t ting分
析。由图 4可以看出 ,在不同转基因植株中 GH的表
达情况存在明显差异 ,其中 5和 7号植株表达最强 ,
2, 4, 6号植株次之 , 3号植株最弱。 经扫描分析表达
最强的 7号植株与最弱的 3号植株相比 ,二者表达量
差异达到 43倍 (图 5)。
59第 9期 肖生科等:石斑鱼生长激素基因的合成及其在拟南芥中的表达
3　讨　论
由于位置效应、拷贝数的不同及基因沉默等原
因 ,外源基因在不同转基因植株之间的表达量存在
明显差异 ,而且外源基因在不同植株之间的表达稳
定性也不相同 [8 ] ,因此 ,需要对获得较多的转基因植
株分别进行分析 ,才能最终筛选出理想的株系。在不
同转基因植株之间 ,引起石斑鱼生长激素表达量差
异明显及其表达稳定性的原因 ,还有待于进一步的
研究分析。
利用微生物基因工程技术大量合成或表达鱼生
长激素作为鱼饲料添加剂 ,是目前利用生长激素的
主要途径。在细菌中表达的鱼生长激素往往以包涵
体的形式存在 ,需要纯化和复性 [3 ] ,程序复杂 ,成本
高 ;利用酵母作为表达体系具有更多的优越性 ,如有
利于蛋白糖基化 ,保持外源蛋白的结构、可溶性及生
物活性等。尽管利用基因工程菌表达鱼类 GH均已
获得成功 ,其表达水平也有很大提高 [9 ] ,但由于需要
经过发酵生产 ,其生产成本仍然比较高。而植物生物
反应器具有植物培养条件简单 ,植物种植不需要特
殊技术和生产设备 ,可进行大规模廉价生产等许多
潜在的优势 ,因而是最经济有效的生产系统 ;此外植
物在生产过程中不会对环境产生任何污染 ,并且还
有绿化、美化环境的作用。
利用转基因植物表达鱼生长激素的研究还未见
报道 ,本研究重新合成石斑鱼生长激素基因 ,并将其
成功转化到模式植物拟南芥中 , No rthern blot ting
分析表明 ,石斑鱼生长激素基因在拟南芥中得到明
显表达 ,但它是否具有天然 GH的生物活性 ,对鱼类
的生长是否具有促进作用还有待于进一步的研究。
一旦利用转基因植物获得具有生物活性的石斑鱼生
长激素的高效表达 ,就可直接作为饲料使用 ,不需要
对 GH进行分离纯化 ,可大大降低生产成本。
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(下转第 65页 )
60 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 32卷
g lobe conjunctiv a ) w ere no t observ ed, which could be used for limbal stem cells t ransplants; At the same
time, the w hole corneal limbal epi thelium lamella w ere excised and the center corneal epitheliums w ere
erased wi th a sw ab soaked in physiolo gical saline, there w ere 2 rabbi ts co rneal surface presented corneal ep-
ithelium pheno type, and the other 3 presented conjunctiva epi thelium pheno type. The results a re unsure fo r
experimental use; The rabbits cor nea s that were removed w ith upper-ha lf of co rneal limbal epi thelium
lamella and erased the center co rnea l epi theliums w ere t ransparent wi th intact cor neal epi thelium; In the
appro ach, the co rneal and limbal epi theliums w ere burned w ith a cot ton sw ab socked in 1 mol /L NaOH,
there were 4 rabbi tscor neal stroma happened perforation or ulcer and symblepha ron, and the o ther one
presented corneal epi thelium pheno type. This is an applicable method to create the patho logical model of
corneal limbal stem cell total deficiency.
Key words: co rnea; corneal limbal stem cell tota l deficiency; patholog ical model; rabbits
　　 (上接第 60页 )
Synthesis of Ep inephelus coioides grow th h ormone gene and
its expression in Arabidopsis thaliana
XIAO Sheng-ke1, 2 , WANG Lei1 ,HU Zhi-qiu1 , CHEN Yu-quan2
( 1 Biotechnology Research Inst itute ,Chinese Academy of Agricul tural Sciences,Beijing 100081,China;
2 Col lege of L if e Sciences,N orthwest Sci-Tech Universit y of Agriculture and Forest ry , Y angl ing , Shaanxi 712100,China)
Abstract: In o rder to enhance the expression of Epinephelus coioides g row th ho rmone gene in Arabidop-
sis thaliana, the gene w as fully modified by optimizing the codons according to the preferential codon usage
in plants. The synthesized DN A fragment w as cloned into plant expression vecto r pBI121 and transformed
into Arabidopsis thaliana by f loral dipping. The t ransgenic plants obtained w ere analy zed by PCR and sub-
sequently by No rthern blot ting , and the results show ed that the modified gene w as expressed in all the
t ransgenic plants checked w ith di fferent expression lev els. The biggest di fference in gene expression lev el
betw een two of the indiv idual transgenic plants reached as much as 43 folds.
Key words: Epinephelus coioides; fi sh g row th hormone; transgenic; Arabidopsis thaliana
65第 9期 屈　雷等:家兔角膜缘干细胞缺失病理模型的制作