全 文 ：499植物生理与分子生物学学报, Journal of Plant Physiology and Molecular Biology 2005, 31 (5): 499-506
2 0 0 5 -0 2 -2 8 收到，2 0 0 5 -0 7 -2 9 接受。
国家自然科学基金项目(No.301 2503 0)资助。
*通讯作者(E-mail: jshcao@zju.edu.cn; Tel: 0571-86971188)。
拟南芥激活标记突变体库的构建及突变体基因的克隆
李志邈 1,3，张海扩 2，曹家树 1*，何祖华 2
(1浙江大学蔬菜研究所，杭州 3 1 0 0 2 9；2 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所植物分子遗传国家重点实验室，上
海 2 0 0 0 3 2；3 浙江省农业科学院蔬菜研究所，杭州 3 1 0 0 2 1 )
摘要:：激活标记(activation tagging)技术是以功能获得突
变体为研究对象，在植物功能基因组学的研究中具有重
要的作用。文章以双子叶模式植物拟南芥(Arabidopsis
thaliana)野生生态型植株为实验材料，以含有激活标记
质粒pSKI015的农杆菌直接喷雾进行转化，并以抗除草
剂Basta为筛选标记，构建了拟南芥的激活标记突变体
库。结果共得到约20 000个独立转化株系(T1代)，其中
38个株系有明显的表型变化，约占转化植株总数的千
分之二。基因组DNA Southern杂交结果表明，大多数
转化植株为多拷贝T-DNA插入。通过质粒拯救(plasmid
rescue)和 TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced-PCR)
可获得T-DNA插入的基因组旁邻序列，为克隆突变体
的基因奠定基础。
关键词:：激活标记；功能获得；拟南芥；质粒拯救；
TAIL-PCR
中图分类号:：Q74
拟南芥(Arabidopsis thaliana)为十字花科
(Crucifereae)拟南芥属一年生草本植物。因其具有
生长周期短、种子繁殖系数高、易于遗传转化、
个体小、便于栽培管理等其它植物无可比拟的优
点，而被科学家当作模式植物，广泛地应用于植
物生物学的各个研究领域。拟南芥的基因组小，
约为 125 Mb，只是人类基因组的大约三十分之
一。更重要的是，其基因组的全序列物理图谱已
于 2000年 12月公布(The Arabidopsis Genome
Initiative 2000)，是第一个基因组被全部测序的植
物，这一里程碑式的工作必将对植物生物学的研
究和农业的发展产生重大而深远的影响。
功能基因组学是后基因组时代的重要研究内
容，主要研究生物体内各基因的生物学功能。构
建饱和的基因突变群体是分离、鉴定基因功能最
直接、最有效的方法。因此，突变体库的构建
是功能基因组学的基础。传统的方法是通过功能
缺失(loss-of-function)突变体来分离基因并研究其
功能，但是，对于存在着基因功能冗余(functional
redundancy)现象的基因家族或者对于那些植物生存
所必需的基因，功能缺失突变往往很难进行研
究。此外，对于由数量性状位点(quantitative trait
loci, QTL)控制的性状，无法用单基因的缺失来获
得突变体，在这种情况下，功能获得( ga i n-of -
function)突变就显得至关重要了。激活标记(activa-
tion tagging)技术因其特有的优势在功能获得突变体
的研究中独树一帜，与其它方法相比，激活标记
技术有以下优点：(1) 含有增强子(enhancer)的 T-
DNA可引起插入位点上游或下游基因的超表达，
从而得到功能获得突变体；(2) 由于这种突变体是
显性遗传的，所以在 T1代就可以通过表型变化筛
选到；(3) 利用质粒拯救或 TAIL-PCR的方法可以
很方便地克隆到相应基因；(4) 在强启动子控制下
将该基因在野生型中表达可以在下一代重现该突变
体的表型；(5)基因家族中某个基因超表达所引起
的突变不影响该家族中其它基因的功能。到目前
为止，已有许多成功的报告(Kardailsky等1999; Ito
和Meyerowitz 2000; Borevitz等 2000; Huang等 2001;
Nakazawa等 2001, 2003; Park等 2003)。此外，在
其它植物如矮牵牛(Petunia hybrida)、杨树(Populus)
和番茄(Lycopersicon esculentum)的基因功能研究
中，该技术也取得了重要进展(Zub ko等 200 2;
Busov等 2003; Mathews等 2003)。本文以野生型
拟南芥为实验材料，通过激活标记技术构建了功
能获得突变体库，并从中筛选感兴趣的突变体。
在此基础上，通过质粒拯救和 /或TAIL-PCR的方
法获得 T-DNA的旁邻序列，为进一步分离、鉴
定相关的基因并研究其功能打下基础。
1　材料与方法
1.1　植物材料
选用两种野生型拟南芥为实验材料，其生态
500 31卷 植物生理与分子生物学学报
型(ecotype)分别为 Columbia (Col-0)和 Shahdara
(Sha)。种子由中科院上海植物生理生态研究所植
物分子遗传国家重点实验室保存。
1.2　菌株和质粒
农杆菌菌株为GV3101，已转入激活标记载体
pSKI015 (图 1)，由德国马普学会(Max-Planck
Institute)的Detlef Weigel博士惠赠。
1.3　拟南芥的种植、转化及转化植株的筛选
将 Col-0或者 Sha的种子悬浮于 0.1%的琼脂
溶液中，4℃下层积 (stratification) 处理 3 d以使
发芽整齐。按体积比 6∶2∶1 将蛭石、草炭和
珍珠岩混合好，装入 600 mm×230 mm×60 mm的
黑色秧盘中，播种密度为 100~120株 /盘。当拟
南芥的主枝开始现蕾时(约 40 d生长期)，打顶，
以促进侧枝生长。农杆菌转化前 1 d去掉已结实的
种荚。培养室保持温度在 22~24℃，相对湿度为
80%，光源为荧光灯，光照强度为 85 µmol s-1 m-2，
光照时间为 16 h/d。
农杆菌菌株为GV3101(含质粒 pSKI015)，挑
单菌落于YEP液体培养基中(组成为酵母提取物10
g/L，蛋白胨 10 g/L，氯化钠 5 g/L，pH 7.0)，
28℃下振荡培养 2 d，加抗生素利福平、卡那霉
素和羧苄青霉素至终浓度各为 50 mg/L。按 1∶50
的比例在新鲜的含抗生素的YEP液体培养基中扩
大培养至指数生长中期 (菌液 O D 6 0 0≈ 1 . 5 )。
2 800×g离心 10 min，弃上清。将沉淀重新悬浮
于渗透培养基，组成为含 5%蔗糖和 0.05% Silwet
L-77 (表面活性剂)的1/2 MS液体培养基，调OD600
=0.8。用喷雾器将上述农杆菌菌液均匀地喷洒在
处于盛花期前的拟南芥植株表面，至叶片上有液
滴落下为宜。保鲜膜覆盖 1~2 d，保持相对湿度
大于 95%，以利农杆菌侵染转化。5 d后按上述方
法重复转化 1次。待种子成熟后(约 20 d)收获干燥。
筛选拟南芥的种植方法同上，但将播种密度
改为约 5 000株 /盘。待苗出齐后，喷施除草剂
Basta (商品名为 Fina le®，有效成份为 5 .78%
glufosinate-ammonium)，筛选对除草剂有抗性的转
化植株(transformants)。除草剂使用时按体积比 1︰
1 000用水稀释，每 7 d喷施 2次，连续 21 d。
将表型有明显变化的转化植株拍照，并单株采
收，其余的转化植株单株采收，或 2 0 株 1 池
(pool)，每池的植株分别混合采收。
1.4　转化植株基因组DNA Southern杂交分析
在20 000个独立转化株系中随机选取33个植
株，按李德葆等(1996)的方法提取基因组 DNA。
Southern杂交按萨姆布鲁克和拉赛尔 (2002)的方法
进行，用限制性内切酶EcoRI进行基因组DNA的
完全酶切，用放射性同位素[α-32P]dCTP标记探
针。探针来自 pSKI015载体上的 BAR序列，长度
为 444 bp且不含 EcoRI酶切位点，扩增探针所用
的一对引物为 BAR-1 5-CTGCACCATCGTCAA-
CCACTA-3; BAR-2 5-CTGAAGTCCAGCTGCCA-
GAAA-3。扩增条件为 94℃预变性 3 min；94℃
变性 1 min，62℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，
35个循环；72℃延伸 10 min。
1.5　通过拯救质粒获得T-DNA插入的基因组旁邻序列
pSKI015载体的左臂和右臂之间有几个特有的
酶切位点和源于克隆载体 pBstKS+的序列(具有氨
苄青霉素抗性)，可用于对质粒的拯救；其中
EcoRI、HindIII和 PstI可用于拯救载体右臂的基
因组旁邻序列，BamHI、SpeI和 NotI可用于拯救
图 1　激活标记载体 pSKI015示意图
Fig.1　Diagram of activation tagging vector pSKI015
Basta: Basta selection marker; pBstKS+: pBstKS+ sequence
including ampicillin selection marker for plasmid rescue; 4×35S:
four copies of the enhancer-containing CaMV 35S promoter. LB
and RB is the left and right border of T-DNA respectively (adapted
from Weigel et al. 2000).
501李志邈等: 拟南芥激活标记突变体库的构建及突变体基因的克隆5期
载体左臂的基因组旁邻序列。本实验选用 EcoRI
来拯救 del1突变体(Col-0背景，图 2A)载体右臂的
基因组 DNA旁邻序列。用 CTAB法提取基因组
DNA。取基因组 DNA 1 µg，10×酶切反应缓冲
液 5 µL，20 U EcoRI，加双蒸水至 50 µL，37℃
反应过夜。酶切反应结束后，用酚 /氯仿(体积比 1
︰ 1)进行抽提。沉淀的DNA吹干后溶于 40 µL双
蒸水中，加入 5 µL 10×连接反应缓冲液和 10 U T4
DNA连接酶，加水至 50 µL，16℃连接过夜。用
2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，将沉淀吹干后溶
于 40 µL双蒸水中。取 10 µL自连接好的DNA热
击转化感受态大肠杆菌 DH5α，转化结束后，将
菌落铺于含氨苄青霉素的LB (组成为酵母提取物5
g/L，蛋白胨 10 g/L，氯化钠 10 g/L，pH7.0)平
板上筛选重组子。挑单菌落，经 LB液体培养后，
碱裂解法抽提质粒DNA，用EcoRI和BamHI双酶
切鉴定。
1.6　通过TAIL-PCR扩增T-DNA插入的基因组旁
邻序列
TAIL-PCR是一种较为成熟的扩增 T-DNA插
入旁邻序列的技术(Liu等 1995)。本实验利用该技
术来扩增 sdt1突变体(Sha背景，图2B)载体左臂的
基因组 DNA旁邻序列。根据 pSKI015载体的序
列，TAIL-PCR反应的 3个特异性引物为 SKI1 5-
AATTGGTAATTACTCTTTCTTTTCCTCCATATTGA-
3; SKI2 5-ATATTGACCATCATACTCATTGCTGA-
TCCAT-3; SKI3 5-TGATCCATGTAGATTTCCC-
GGACATGAA-3，其中 SKI3离 T-DNA的左臂最
近，只有 15 bp，这 3个特异性引物的 Tm值较高，
均在 60℃以上。6个简并引物为AD1a 5- TGWG-
NAGSANCASAGA-3; AD1 5-NTCGASTWTSGW-
GTT-3; AD2 5-NGTCGASWGANAWGAA-3; AD2a
5-AGWGNAGWANCAWAGG-3; AD3 5-WGTGN-
AGWANCANAGA-3; AD5 5-STTGNTASTNCT-
NTGC-3，这 6个简并引物的 Tm值较低，均为
43℃左右。TAIL-PC R 的扩增条件为，第一轮
PCR：93℃ 1 min; 95℃ 1 min; (94℃ 30s; 62℃ 1
min; 72℃ 2.5 min) 5个循环；94℃ 30 s; 25℃ 3
min; 每秒升温 0.2℃，升至 72℃(约需 4 min);
72℃ 2.5 min; (94℃ 10 s; 68℃ 1 min; 72℃ 2.5 min;
94℃ 10 s; 68℃ 1 min; 72℃ 2.5 min; 94℃ 10 s; 44℃
1 min; 72℃ 2.5 min) 15个循环；72℃ 5 min。第
二轮PCR以第一轮的产物稀释50倍后取1 µL为模
板，扩增条件为(94℃ 10 s; 64℃ 1 min; 72℃ 2.5
min; 94℃ 10 s; 64℃ 1 min; 72℃ 2.5 min; 94℃ 10 s;
44℃ 1 min; 72℃ 2.5 min) 12个循环; 72℃ 5 min。
第三轮PCR以第二轮的产物稀释50倍后取1 µL为
模板，扩增条件为(94℃ 15 s; 44℃ 1 min; 72℃ 2.5
min) 20个循环; 72℃ 5 min。3轮 PCR的反应体系
均为 20 µL。
2　结果
2.1　拟南芥T1代转化植株
自 2002年 4月至 2003年 6月，按上述方法
分 5批转化野生型拟南芥，共得到约 20 000个独
立的 T1代转化株系，包括 Col-0生态型约 12 000
个株系，Sha生态型约8 000个株系，其中有3 000
个株系(Col-0生态型)为单株采收。受环境因素影
响，不同批次间的转化率有差别，最大为 1.58%，
最小为 0.62%，平均为 0.98%。在 T1代植株中，
共发现 38个株系有明显的表型变化，约占转化植
株总数的千分之二，主要是直观可见的植株形态
的改变，包括株型、株高、叶形以及植株的育
性等，部分结果见图 2。其中，大多数突变体(26
株)的表型仅在 T1代出现，T2代以后恢复为野生
型，占全部有表型变化株系的 68%，该现象在其
它的实验室中也有报告(Ichikawa等 2003); 有 5个
株系不育(如突变体 G 和 K，图 2)，需与野生型
回交后再作遗传分析；有 3个株系(如突变体 J和
H，图 2)仅观察到植株的营养生长，没有观察到
生殖生长；有 4个株系(如突变体A、B和 F)的突
变表型可稳定遗传。对其中一些稳定遗传的重要
突变体的功能基因正在分离研究之中。
2.2　转化植株 T-DNA的拷贝数
在20 000个独立转化株系中随机选取33个植
株，提取基因组DNA用 EcoRI完全酶切(图 3A)，
并用来自 pSKI015载体上的 BAR序列为探针进行
Southern杂交(图 3B)，以检测转化株系中 T-DNA
插入的拷贝数分布，结果多拷贝(3个拷贝以上)插
入的株系为 20个，占总数的 60.6%，其中最多的
拷贝数为 5个，分别为株系 12(上排)、1(下排)和
502 31卷 植物生理与分子生物学学报
图 2　部分 T1代转化植株的表型(标尺 =1 cm)
Fig.2　Different phenotypes of some T1 transformants (Bar=1 cm)
A: dwarf, epinastic rosette leaves 1 (del1); B: high-salinity and drought tolerant 1 (sdt1), no morphological phenotypic variation; C:
rosette-like cauline leaves 1; D: rosette-like cauline leaves 2; E: big rosette leaves, no dominant rachis; F: lesion mimic; G: abnormal
flower, sterility; H: narrow leaf; I: dwarf, lotus leaf; J: extremely dwarf, curled leaf; K: lotus leaves, hyponastic growth; L: dwarf, all
flowers.
503李志邈等: 拟南芥激活标记突变体库的构建及突变体基因的克隆5期
3(下排); 2拷贝插入的株系为8个，占总数的24.2%；
单拷贝插入的株系为 5个，占总数的 15.2%。
2.4　突变体候选基因的克隆
质粒拯救是克隆激活标记突变体候选基因的
有效方法，pSKI015载体的左臂和右臂之间有几
个T-DNA上特有的酶切位点，并具有氨苄青霉素
抗性，可用于进行质粒拯救。我们选用 EcoRI来
拯救 pSKI015载体右臂的 del1突变体基因组DNA
旁邻序列。其主要过程是：首先用 EcoRI完全酶
切 del1基因组 DNA，酶切产物自连后，转化感
受态大肠杆菌，然后在含氨苄青霉素的LB平板上
筛选阳性克隆，在酶切验证为正确后，对目的条
带测序，最后根据测序结果在NCBI上进行同源性
比对，以确定 DEL1候选基因。本实验室通过上
述方法拯救到一条 1.5 kb的目的条带(图 4A)，测
序结果表明该序列中有100 bp与拟南芥基因组4号
染色体上的一段序列具有100%的同源性(数据未显
示)，其它的部分与 pSKI015载体的序列完全相
同。经进一步的分析发现距 4×CaMV 35S增强子
的下游仅 800 bp有一个未报告过的新基因，而另
一个基因距 T-DNA的左臂有 8.4 kb。由于增强子
插入到该基因的 5调控区，且距转录起始位点不
到 1 kb，可以判断该基因(DEL1)超表达后造成了
图 3　T1代转化株系 Southern杂交结果　
Fig.3　Southern blot analysis of T1 transformants
A: Complete EcoRI digestion of transformants genomic DNA; B:
Southern blot analysis with the probe of BAR. Line 1 (upper
row) is Col-0 as negative control; Lines 2−17 (upper row) and lines
1−17 (lower row) are 33 randomly taken Basta resistant
transformants.
图 4　激活标记突变体旁邻基因组序列的获得
Fig.4　Acquisition of flanking genomic sequence of the activation-tagged mutants
A: Double enzyme digestion to verify the positive plamid from del1 plamid rescue. 1.5 kb is the length of the rescued band including
flanking genomic DNA. M is GeneRulerTM 1 kb DNA ladder (MBI Fermentas); Lane 1 is EcoRI digestion; Lane 2 is EcoRI and BamHI
double digestion. B: Electrophoresis analysis of the secondary and tertiary TAIL-PCR products from sdt1 mutant. M is GeneRulerTM
1 kb DNA ladder (MBI Fermentas); Lanes 1 and 2 are the secondary and tertiary PCR products amplified by AD1a and SKI2, SKI3,
respectively; Lanes 3 and 4 are the secondary and tertiary PCR products amplified by AD2 and SKI2, SKI3, respectively.
504 31卷 植物生理与分子生物学学报
突变体的表型，随后的转基因实验证实了这一点
(结果未发表)。
除此之外，本实验室用 TAIL-PCR的方法克
隆了 sdt1的候选基因。分别用 6个简并引物与 T-
DNA特异性引物SKI1和SKI2进行了两轮PCR扩
增，结果发现有 2个简并引物AD1a与AD2可扩
增出明显的条带。其中 AD1a只扩增出约 500 bp
的一条带，AD2则扩增出约 250、300和 500 bp
的三条带，其它的简并引物未扩增出明显的条
带。为了验证AD1a与AD2的 PCR产物是否为特
异性扩增，又选择这两个简并引物与特异性引物
SKI3进行了第三轮 PCR，结果扩增出了预期的比
第二轮 PCR产物小约 20 bp的条带(图 4B)，证明
该 PCR产物为特异性扩增。将简并引物 AD1a、
AD2分别与特异性引物SKI3扩增的两个约500 bp
的 PCR产物克隆到 pGEM®-T easy 载体中，用通
用引物 T7测序。测序结果经 Blastn比对发现两个
PCR产物均与拟南芥基因组2号染色体上同一段约
400 bp的DNA序列一致(数据未显示)。根据以上
比对结果和 T-DNA的插入位置，我们将 SDT1的
候选基因初步选定为拟南芥2号染色体上的3个基
因。由于 sdt1的 Southern杂交结果显示 T-DNA是
两拷贝插入(图5A)，本实验室通过优化TAIL-PCR
的反应条件，获得了另一个 T-DNA的旁邻序列，
测序结果证明两拷贝在基因组中是右臂对右臂的串
联插入(图 5B)。
3　讨论
激活标记技术是构建功能获得突变体库的有
效方法，并具有独特的优势( W e i g e l 等 2 0 0 0 ;
Nakazawa等 2003)。本实验室以野生型拟南芥Col-0
和 Sha为材料，用该技术构建了拟南芥的功能获
得突变体库，共得到约 20 000个抗除草剂的 T1代
独立转化株系，对其中约 3 000个株系单株收获，
以利于后代的遗传分析。
用农杆菌“浸花法”(floral dip)转化拟南芥是
一种较为成熟的转基因方法(Clough和Bent 1998)。
本文在此基础上进行了拟南芥的 T-DNA转化，主
要不同之处是为了便于大规模转化，用“喷雾
法”代替“浸花法”进行转基因操作。实验结
果显示 5个不同批次之间的转化率有差异，最大
为 1.58%，最小为 0.62%，平均为 0.98%。实验
中发现，植株的健康状况是能否获得高转化率的
图 5　sdt1的 Southern杂交与 SDT1候选基因示意图
Fig.5　Southern blot analysis of sdt1 and the sketch map for the SDTI candidate genes
A: Southern blot analysis of Sha and sdt1. Lanes 1–3 are blotting results of the Sha genomic DNA digested by EcoRI, BamHI and HindIII,
respectively; Lanes 4–6 are blotting results of the sdt1 genomic DNA digested by EcoRI, BamHI and HindIII, respectively. B: Sketch
map for the SDT1 candidate genes.
505李志邈等: 拟南芥激活标记突变体库的构建及突变体基因的克隆5期
关键。因此，在转化方法可靠的基础上，提供
适宜的栽培条件，使拟南芥在转化和筛选等关键
时期植株的生长状况良好，是获得稳定的高转化
率的基础和保证。
在 T1代的转化植株中，绝大多数没有显著的
形态变化，约有千分之二的株系在植株的株型、
株高、叶形以及育性等方面表现出与野生型明显
不同的表型，主要包括矮化、叶形态改变和不育
等(图 2)。值得注意的是，有 68%突变体的表型
仅在 T1代出现，而在随后的遗传分析中，恢复为
野生型。Chalfun-Junior等(2003)认为这种现象与
4×CaMV 35S增强子被甲基化，而导致其转录增
强功能的沉默有关，且该增强子的甲基化程度与
T-DNA插入的拷贝数呈正相关。本实验室从突变
体库中随机选择 33个株系进行了 Southern杂交实
验，结果发现大多数株系是多拷贝(3个以上)的T-
DNA插入，占总数的 60.6%，而双拷贝和单拷贝
的插入分别占总数的 24.2%和 15.2%(图 3)。这一
实验结果与大多数突变体后代(68%)形态表型消失
的现象相吻合，并且印证了 Chalfun-Junior等的甲
基化可导致转录增强功能沉默的现象。有意思的
是，del1突变体的矮化表型可稳定遗传，迄今已
到 T10代，Southern杂交实验证明 del1为单拷贝T-
DNA插入，与 Col-0回交后代表型的遗传分析结
果也证明了这一点(结果未显示 )。M a r s c h -
Martinez等(2002)利用转座子转基因通常为单拷贝
的特点，将玉米的 En-I转座子系统引入到激活标
记技术中，构建了新的双元表达载体，在拟南芥
中可将 T1代转化植株中形态突变体的比例提高到
1%，为激活标记技术的发展提供了更高的效率。
质粒拯救是克隆激活标记突变体基因的有效
手段，本实验室用此方法成功地克隆了DEL1候选
基因(图 4A)，但是该方法过程较繁琐，且对自连
接反应和感受态细胞的转化效率要求很高，有时
难以在含氨苄青霉素的LB平板上筛选到正确的阳
性克隆。与之相比 TAIL-PCR的方法较为简便，
如扩大简并引物的试用范围，通常情况下均能扩
增到目的条带，可用于突变体库T-DNA基因组旁
邻序列的大规模获取，本实验室用此方法扩增得
到了 SDT1候选基因(图 5)。在实际应用中，可根
据突变体的具体表型和遗传分析结果，选用其中
的方法进行基因克隆。本实验室从上述激活标记
突变体库中筛选获得了一些重要的突变体，并用这
两个基因克隆方法分离了目标基因(结果未发表)。
参 考 文 献
李德葆，周雪平，许建平，何祖华(1996). 基因工程操作
技术. 上海：上海科学技术出版社，54- 56
萨姆布鲁克 J，拉塞尔 DW(2002). 分子克隆实验指南(第
三版). 北京：科学出版社，492- 509
Borevitz JO, Xia Y, Blount J, Dixon RA, Lamb C (2000).
Activation tagging identifies a conserved MYB regulator
of phenylpropanoid biosynthesis. Plant Cell, 12: 2383-
2393
Busov VB, Meilan R, Pearce DW, Ma C, Rood SB, Strauss SH
(2003). Activation tagging of a dominant gibberellin
catabolism gene (GA 2-oxidase) from poplar that regulates
tree stature. Plant Physiol, 132: 1283-1291
Chalfun-Junior A, Mes JJ, Mlynarova L, Aarts MGM, Angenent
GC (2003). Low frequency of T-DNA based activation
tagging in Arabidopsis is correlated with methylation of
CaMV 35S enhancer sequences. FEBS Lett, 555: 459-
463
Clough SJ, Bent AF (1998). Floral dip: a simplified method for
Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis
thalina. Plant J, 16(6): 735-743
Huang S, Cerny RE, Bhat DS, Brown SM (2001). Cloning of an
Arabidopsis patatin-like gene, STURDY, by activation T-
DNA tagging. Plant Physiol, 125: 573-584
Ichikawa T, Nakazawa M, Kawashima, M, Muto S, Gohda K,
Suzuki K, Ishikawa A, Kobayashi H, Yoshizumi T,
Tsumoto Y et al. (2003). Sequence database of 1172 T-
DNA insertion sites in Arabidopsis activation-tagging lines
that showed phenotypes in T1 generation. Plant J, 36:
421-429
Ito T, Meyerowitz EM (2000). Overexpression of a gene
encoding a cytochrome P450, CYP78A9, induces large
and seedless fruit in Arabidopsis. Plant Cell, 12: 1541-
1550
Kardailsky I, Shukla VK, Ahn JH, Dagenais N, Christensen
SK, Nguyen JT, Chory J, Harrison MJ, Weigel D (1999).
Activation tagging of the floral inducer FT. Science, 286:
1962-1965
Liu YG, Mitsukawa N, Oosumi T, Whittier RF (1995). Efficient
isolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA
insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR.
Plant J, 8: 457-463
Marsch-Martinez N, Greco R, Arkel GV, Herrera-Estrella L,
Pereira A (2002). Activation tagging using the En-I maize
transposon system in Arabidopsis. Plant Physiol, 129:
506 Journal of Plant Physiology and Molecular Biology 2005, 31 (5): 499-506
1544-1556
Mathews H, Clendennen SK, Caldwell CG, Liu XL, Connors K,
Matheis N, Schuster DK, Menasco DJ, Wagoner W,
Lightner J, Wagner DR (2003). Activation tagging in
tomato identifies a transcriptional regulator of anthocyanin
biosynthesis, modification, and transport. Plant Cell, 15:
1689-1703
Nakazawa M, Ichikawa T, Ishikawa A, Kobayashi H, Tsuhara
Y, Kawashima M, Suzuki K, Muto S, Matsui M (2003).
Activation tagging, a novel tool to dissect the functions of
a gene family. Plant J, 34: 741-750
Nakazawa M, Yabe N, Ichikawa T, Yamamoto YY, Yoshizumi
T, Hasunuma K, Matsui M (2001). DFL1, an auxin-
responsive GH3 gene homologue, negatively regulates
shoot cell elongation and lateral root formation, and
positively regulates the light response of hypocotyls
length. Plant J, 25: 213-221
Park DH, Lim PO, Kim JK, Cho DS, Hong SH, Nam HG (2003).
The Arabidopsis COG1 gene encodes a Dof domain
transcription factor and negatively regulates phytochrome
signaling. Plant J, 34: 161-171
The Arabidopsis Genome Initiative (2000). Analysis of the
genome sequence of the flowering plant Arabidopsis
thaliana. Nature, 408: 796-815
Weigel D, Ahn JH, Blazquez MA, Borevitz JO, Christensen SK,
Fankhauser C, Ferrandiz C, Kardailsky I, Malancharuvil
EJ, Neff MM et al. (2000). Activation tagging in
Arabidopsis. Plant Physiol, 122: 1003-1013
Zubko E, Adams CJ, Machaekova I, Malbeck J, Scollan C,
Meyer P (2002). Activation tagging identifies a gene from
Petunia hybrida responsible for the production of active
cytokinins in plants. Plant J, 29: 797-808
Construction of an Activation Tagging Library of Arabidopsis and Clon-
ing for Mutant Genes
LI Zhi-Miao1,3, ZHANG Hai-Kuo2, CAO Jia-Shu1*, HE Zu-Hua2
(1Institute of Vegetable Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China; 2State Key Laboratory of Plant Molecular Genetics,
Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032,
China; 3Institute of Vegetables, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China)
This work was supported by National Natural Science Foundation
of China (No. 30125030).
*Corresponding author (E-mail: jshcao@zju.edu.cn).
Abstract: Activation tagging is an important strat-
egy in plant genomics by generating gain-of-func-
tion mutants. In this work, a library of Arabidopsis
mutants was constructed by in planta transforma-
tion mediated by Agrobacterium tumefaciens con-
taining an activation tagging vector pSKI015 with
herbicide Basta as a selection marker (Fig.1).
Among 20 000 independent transformants, 38 lines,
i.e. about 0.2% of T1 progeny, show visible mor-
phological phenotypic variations (Fig.2). Results of
Southern blot analysis revealed that most of the
transformants have more than three copies of
T-DNA insertion (Fig.3). Plasmid rescue and TAIL-
PCR were used to recover the flanking genomic se-
quences of mutated target genes as the first step
towards mutant gene cloning (Figs.4, 5).
Key words: activation tagging; gain-of-function; Arabidopsis
thaliana; plasmid rescue; TAIL-PCR