全 文 :收稿日期:2012-03-15。
基金项目:国家环境保护总局“江西省野生兰科植物资源调查与保护”项目(GJJ09054)。
作者简介:蒙 阳(1987-),男,硕士生。*通信作者:杨柏云(1963-),男,教授。E-mail:yangboyun@163.com。
文章编号:1006-0464(2012)04-0385-04
始兴石斛的无菌播种及快速繁殖
蒙 阳,刘翠华,孔令杰,张小燕,杨柏云*
(南昌大学生命科学与食品工程学院;江西省植物资源重点实验室,江西 南昌 330031)
摘 要:以始兴石斛种子为外植体,研究了NAA、6-BA、IBA、蔗糖以及活性炭(AC)等对种子无菌萌发及快速繁殖
的影响。结果表明:适合种子萌发的培养基是 MS+6-BA1.5mg·L-1+NAA 0.6mg·L-1+AC0.1%,萌发率可
达100%;适合原球茎增殖的培养基是MS+6-BA0.8mg·L-1+NAA0.3mg·L-1+蔗糖4.5%,增殖系数为7.75
倍;适合分化的培养基是 MS+6-BA2.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+AC0.03%,分化率为92%;适合生根的培
养基是1/2MS+IBA0.5mg·L-1+AC0.05%,生根率为95.3%;以苔藓和树皮作为基质,试管苗移栽成活率可达
93%以上。
关键词:始兴石斛;无菌播种;快速繁殖
中图分类号:Q949 文献标志码:A
Sterile seeding and rapid propagation of Dendrobium shixingense
MENG Yang,LIU Cui-hua,KONG Ling-jie,ZHANG Xiao-yan,YANG Bai-yun*
(Colege of Life Science and Food Engineering;
Jiangxi Province Plant Rosources Key Labratories,Nanchang University,Nanchang 330031,China)
Abstract:We studied the effects of the concentration and the ratio of NAA,6-BA,IBA,sucrose and active
carbon on the germination of seeds and their rapid propagation of Dendrobium shixingense,by using its
seeds as explants,.Our results indicated that the optimum medium for germination of seeds was MS con-
taining 1.5mg·L-1 6-BA,0.6mg·L-1 NAA and 0.1%active carbon,with the germination rate being
100%.For multiplication of protocorms,the MS containing 0.8mg·L-1 6-BA,0.3mg·L-1 NAA and
4.5%sucrose was the suitable medium,and its propagation coefficient was 7.75.The Differentiation medi-
um was best in the MS containing 2.5mg·L-1 6-BA,0.5mg·L-1 NAA and 0.03%active carbon,whose
differential rate reached 92%.As for rooting,the 1/2MS supplemented with 0.5mg·L-1 IBA and 0.05
active carbon was preferred,in which the rooting rate reached 95.3%.,The survival rate of the rooting pla-
ntlets transplant was more than 93%in the case of using the moss and bark as ground.
Key words:Dendrobium shixingense;sterile seeding;rapid propagation
石斛为贵重药材,具有滋阴清热、益胃生津等功
效。现代药理研究表明,石斛在治疗胃肠道疾病、关
节炎及慢性咽炎等疾病上有很好的疗效[1]。始兴石
斛(Dendrobium shixingense)于2010年发现于广东
北部始兴县,现仅在广东及其与江西交界的少数地
区发现有分布,适生海拔约400~600m[2]。
石斛属是兰科中的附生兰,种子的萌发较为容
易,已见诸多用种子进行无菌播种和繁殖的报道,如
齿瓣石斛、梳唇石斛、铁皮石斛、疏花石斛等[3-6],都
通过种子的无菌萌发及其分化和生根等试验,建立
了无菌繁殖体系,但在石斛的丛生芽增殖及诱导原
球茎等方面的研究则有所欠缺。有关始兴石斛种子
的无菌播种和快速繁殖迄今未见报道,通过本试验
研究种子的无菌萌发、原球茎的增殖和分化及无根
第36卷第4期
2012年8月
南昌大学学报(理科版)
Journal of Nanchang University(Natural Science)
Vol.36No.4
Aug.2012
小苗的生根,从而建立始兴石斛的快速繁殖体系。
1 材料与方法
1.1 材料
始兴石斛(Dendrobium shixingense)的未开裂
蒴果:2009年12月采自江西赣州九连山国家自然
保护区,以蒴果里的种子为外植体。
1.2 表面灭菌与接种
蒴果经自来水洗净后,用70%酒精处理30s,
0.1%升汞水溶液处理8~10min,无菌水冲洗5
次,再用无菌滤纸吸干水分,用消毒刀以十字状纵切
果实,移到培养瓶口,轻轻敲打果实,使种子随机均
匀散落到的培养基中,培养基组成见表3,每组7
瓶,然后在培养基上加入适量无菌水,盖好瓶盖置于
培养室中培养,14d后统计萌发率。
1.3 原球茎的增殖
选取6-BA、NAA和蔗糖为三因素,各取三水平
(表1),进行正交试验。将1.2中2号培养基中的
原球茎随机接种到表4的各组培养基中,每组10
瓶,每瓶接种70颗约0.5g左右的原球茎。每瓶装
培养液为40mL,7d换液1次。28d后统计原球茎
的增殖情况。原球茎增殖系数=(培养后的重量—
接种量)/接种量。
表1 原球茎增殖因素水平表
水平
因素
6-BA/(mg·L-1) NAA/(mg·L-1) Sucrose/(%)
1 0.2 0.3 2.5
2 0.5 0.6 3.5
3 0.8 0.9 4.5
表2 原球茎分化因素水平表
水平
因素
6-BA/(mg·L-1) NAA/(mg·L-1)
1 0.5 0.5
2 1.5 1.0
3 2.5 1.5
1.4 原球茎的分化
选取6-BA 和 NAA 二因素,各取三水平(表
2),进行正交试验。将原球茎增殖试验中的7号培
养基中的原球茎随机接种到(表6)的各组培养基
中。每组6瓶,每瓶接种约20颗原球茎。25d后统
计原球茎的分化情况,并计算分化率。分化率=原
球茎分化的株数/接种原球茎的个数×100%。
1.5 生根培养
待7号分化培养基中的幼苗长到苗高2~3
cm,新叶5~6片时,将其转接到(表8)的各组培养
基中进行生根培养,20d后统计生根情况。生根率
=(生根苗的株数/接种苗的株数)×100%。
以上除种子无菌萌发试验外,均使用 MS培养
基。除表4所列培养基,均为附加蔗糖3%的固体
培养基,pH均为5.6~5.8。
1.6 移栽
将苗高5cm以上生根苗炼苗7d,取出小苗并
洗净附着的培养基,用0.1%高锰酸钾溶液浸泡5
min后晾干。种植基质为苔藓和树皮混合基质,且基
质使用前用1 000倍多菌灵溶液浸泡15min。将苗
定植于穴盘中,保持温度为18~25℃,相对湿度70%
~90%,光照强度为87~110μmol·m
-2·s-1。
1.7 培养条件
种子萌发培养初期进行暗培养。原球茎的增殖
为液体振荡培养,转速为110r·min-1,光照强度
15μmol·m
-2·s-1。分化、生根培养的光照强度
为30~40μmol·m
-2·s-1,光照时间为12h·
d-1,培养温度为(25±2)℃。
1.8 数据处理
采用SAS软件进行正交试验的设计,用SPSS
17.0对数据进行统计分析。
2 结果和分析
2.1 种子的无菌萌发
培养7d后种子吸水膨胀,14d时,第2组培养
基中的种子大量萌发,颜色变为墨绿色,萌发率可达
100%(图版Ⅰ:A),30d形成基部有丝状毛的原球
茎(图版Ⅰ:B)。实验结果(表3)表明:在激素相同
的情况下,MS中的种子萌发率高于B5;当培养基为
MS+6-BA1.5mg·L-1+NAA0.6mg·L-1+
AC1.0g·L-1,时萌发率可达100%。
表3 始兴石斛种子的无菌萌发
编号 培养基
6-BA/
(mg·L-1)
NAA/
(mg·L-1)
AC/
(g·L-1)
萌发率/
(%)
1 MS 1.0 0.4 0.5 76.67
2 MS 1.5 0.6 1.0 100.00
3 B5 1.0 0.4 1.0 33.39
4 B5 1.5 0.6 0 91.43
5 1/2MS 0.5 0.6 0.5 43.71
6 1/2MS 1.0 0.8 0 66.67
7 1/2B5 0.5 0.6 0.5 76.68
8 1/2B5 1.0 0.8 0 56.97
2.2 原球茎的增殖
液体增殖培养28d后原球茎多呈纺锤状(图版
·683· 南昌大学学报(理科版) 2012年
Ⅰ:C)。实验结果(表4)表明:随着6-BA浓度的升
高,增殖系数呈现出增加的趋势;而随着NAA浓度
的升高,原球茎的增殖系数呈下降趋势;而随着蔗糖
含量的提高,增殖系数呈升高趋势。发现6-BA0.8
mg·L-1、NAA0.3mg·L-1、蔗糖4.5%时,即7
号培养基的增殖系数可达7.75,且增殖的原球茎个
大、体圆、色绿、生长旺盛,故增殖的最佳培养基为
MS+6-BA0.8mg·L-1+NAA0.3mg·L-1+蔗
糖4.5%。方差分析(表5)可知,6-BA对原球茎增
殖影响显著,NAA和蔗糖影响均不显著,可见6-BA
在原球茎的增殖过程中起主要作用。
表4 原球茎增殖试验结果
编号
6-BA/
(mg·L-1)
NAA/
(mg·L-1)
Surose/
(%)
接种原
球茎总
质量/g
28d后
原球茎总
质量/(g)
增殖
系数
1 0.2 0.3 2.5 4.94 21.67 3.86
2 0.2 0.6 3.5 5.02 25.35 4.05
3 0.2 0.9 4.5 5.11 27.60 4.40
4 0.5 0.3 3.5 5.06 28.59 4.65
5 0.5 0.6 4.5 4.93 28.94 4.87
6 0.5 0.9 2.5 5.06 26.11 4.16
7 0.8 0.3 4.5 5.32 38.50 7.75
8 0.8 0.6 2.5 5.25 31.17 5.40
9 0.8 0.9 3.5 5.27 36.63 5.95
R 2.264 0.647 1.200
主次
顺序
1 3 2
表5 原球茎增殖方差分析
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 P值
6-BA 8.595 2 4.298 19.479 0.049
NAA 0.762 2 0.381 1.728 0.367
Sucrose 2.232 2 1.116 5.509 0.165
误差 0.441 2 0.221
总和 237.932 9
2.3 原球茎的分化
实验结果(表6)(图版Ⅰ:D)表明:随着6-BA
浓度的升高,苗的分化率随之提高,但随着NAA浓
度的增加,苗的分化率反而下降,观察发现当6-BA
浓度为2.5mg·L-1、NAA浓度为0.5mg·L-1
时,即7号培养基的分化效果最好,成苗率也最高,
可达92.00%。故分化的最佳组合为 MS+6-BA
2.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1。方差分析(表
7)可知,6-BA对原球茎分化影响显著,NAA对分化
的影响不显著,可见6-BA在原球茎的分化成苗中
起主要的作用。
2.4 生根培养
将分化的石斛苗转接到生根培养基中,经过20d
表6 原球茎分化的试验结果
编号
6-BA/
(mg·L-1)
NAA/
(mg·L-1)
接种原球
茎数(个)
40d苗
数(株)
苗分化
率/(%)
1 0.5 0.5 120 89 73.76
2 0.5 1.0 122 72 59.11
3 0.5 1.5 122 80 65.34
4 1.5 0.5 120 100 83.57
5 1.5 1.0 121 94 77.44
6 1.5 1.5 120 72 60.09
7 2.5 0.5 123 113 92.00
8 2.5 1.0 120 104 86.41
9 2.5 1.5 119 94 78.94
R 19.71 14.99
主次
顺序
1 2
表7 原球茎分化的方差分析
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 P值
6-BA 592.839 2 296.420 7.886 0.041
NAA 340.236 2 170.131 4.526 0.094
误差 150.355 4 37.589
总和 51 957.764 9
培养,可以得到生根试管苗(图版Ⅰ:E)。实验结果
(表8)表明:添加IBA激素的培养基的生根率及生
根状况普遍优于添加 NAA的培养基,且5号培养
基的生根率为最高,为95.3%,且生根数也最多。
1/2MS+IBA0.5mg·L-1为生根的最佳培养基。
表8 不同培养基对始兴石斛生根的影响
编号 培养基
接种
苗数/
株
25d生
根数/
株
25d总
根数/
条
生根
率/
(%)
平均每
株根数/
条
1 1/2MS+0.2NAA 61 47 238 93.4 3.9
2 1/2MS+0.5NAA 62 52 207 83.9 3.4
3 1/2MS+0.8NAA 59 48 173 81.4 3.6
4 1/2MS+0.2IBA 60 51 220 85.0 3.6
5 1/2MS+0.5IBA 64 61 262 95.3 4.3
6 1/2MS+0.8IBA 62 58 254 93.5 4.1
2.5 移栽
移栽25d后植株能产生新的根系,此时可移入
温棚进行正常水、肥、药的管理。本试验苔藓和树皮
混合基质的移栽成活率可达93%以上(图版Ⅰ:F)。
3 讨论
在种子萌发方面,我们发现激素的浓度和配比
相同,基本培养基不同,种子的萌发率是不一样的,
且 MS比B5 的种子萌发率要高,究其原因,可能与
MS是高盐培养基,无机盐离子浓度高,既含硝态
氮,又有氨态氮,而B5 是高 KNO3 含量的培养基,
含有较低的氨态氮有关,结果同符岸军等[7]石斛兰
“绿色星辰×出水芙蓉”杂交种子无菌萌发与组培快
·783·第4期 蒙 阳等:始兴石斛的无菌播种及快速繁殖
繁研究结果相一致。
在3、4组培养基中,种子的萌发率相差很大,尽
管这2组培养基中的6-BA和NAA的浓度不同,但
它们浓度的比值均为2.5,造成这种结果的原因,可
能与第3组含有活性炭有关,活性炭吸附了培养基
中的激素而造成2组激素的浓度降低,可见,始兴石
斛种子的萌发要有较高的激素浓度。在基本培养基
同为 MS的1、2组和5、6组中,亦可验证始兴石斛
种子萌发须较高浓度的6-BA和 NAA。虽然6、8
组中两种激素浓度也较高,且未含有活性炭,但可能
由于6-BA和NAA的浓度比值较小,故而萌发率也
不高。
原球茎的增殖主要是指其增重,而不是数目的
增加。在本试验中,通过对数据的极差和方差分析
可知6-BA在增殖过程中起最主要的作用,随着6-
BA浓度的增加,原球茎的增殖系数也随之提高,这
与冯莹等[8]关于石斛原球茎在不同6-BA浓度下生
长情况的报道相一致。虽然蔗糖和NAA对增殖不
起主要作用,但随着培养基中蔗糖含量的增加,原球
茎的增殖系数也提高,从而可证明蔗糖的添加为原
球茎的生长和增殖提供了充足的碳源和能量这个普
遍规律。
在原球茎的分化试验中,通过极差和方差分析
表明6-BA在石斛的分化过程中起主要作用,且较
高浓度的6-BA有利于原球茎的分化成苗,这一点
与刘丽锋等[9]的观点一致。故在本试验中可认为6-
BA对原球茎的增殖和分化影响作用显著。
参考文献:
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图版说明:图版ⅠA种子的无菌萌发;B原球茎放大照(×7倍);C原球茎的增殖;
D苗的分化;E生根培养;F移栽的小苗。
图1
·883· 南昌大学学报(理科版) 2012年