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中国科学 C 辑:生命科学 2008 年 第 38 卷 第 9 期: 836 ~ 840
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836
《中国科学》杂志社
SCIENCE IN CHINA PRESS
拟南芥愈伤组织细胞类 58K 蛋白定位及多泡体的
分泌途径
许珊①②†, 钱洁①†, 宋馨①, 祝建①*
① 同济大学生命科学与技术学院, 上海 200092;
② 第二军医大学基础部电子显微镜实验室, 上海 200433
† 同等贡献
* 联系人, E-mail: zhujian1@mail.tongji.edu.cn
收稿日期：2008-01-24; 接受日期：2008-04-23
国家自然科学基金(批准号：30470863)资助项目
摘要 通常认为多泡体是原生质体和胞饮作用中的一种特殊的细胞结构, 是由细胞质
膜的内陷所起源. 然而多泡体的起源、功能及其分泌途径以及与高尔基体和细胞壁的关系
等问题一直存有争论. 本文应用动物细胞的 58K 蛋白的单克隆抗体、免疫印记、激光共
聚焦显微技术在拟南芥和贯叶连翘愈伤组织中成功定位了类 58K 蛋白. 免疫电子显微镜
的观察结果显示, 类 58K 蛋白存在于拟南芥愈伤组织细胞的高尔基体库槽、分泌泡、多
泡体、细胞壁和液泡中. 由此我们认为多泡体与细胞壁和液泡发育的关系十分密切, 它起
源于高尔基体并以分泌泡的形式将高尔基体所合成的物质运送至细胞壁和液泡. 所以多
泡体的分泌途径可能是运送高尔基体合成的物质到细胞壁, 属于胞吐形式; 也有可能是
运送相关物质到液泡中参与液泡的发育, 属于胞饮形式. 这主要取决于多泡体所运送物
质的种类以及它将这些物质运往何处. 因此多泡体的分泌途径很可能有多种形式. 研究
结果也显示应用动物细胞 58K蛋白抗体可以定位植物细胞中的类 58K蛋白, 说明植物细
胞中存在与动物细胞相类似的蛋白.
关键词
拟南芥
(Arabidopsis
thaliana)
类 58K
蛋白
定位
多泡体
分泌途径
在动物细胞中, 原生质体和胞饮途径中多泡体
是由细胞质膜内陷所形成的[1], 并且一些多泡体在形
成之前就与溶酶体前体互相融合[2]. 然而, 有一些文
献报道指出, 在胞吐过程中也有多泡体的出现, 并且
多泡体逐渐向细胞质膜移动, 与质膜融合, 释放其内
含的小泡[2]. 另外还有一种观点支持多泡体来源于内
质网的库槽, 它与质膜相融合, 然后释放其内容物[1].
在最近的报道中, 认为多泡体参与了细胞板的装配
和成熟[3], 并相信多泡体的功能与细胞壁的生长有关.
细胞壁组成成分, 如多糖、糖蛋白和糖转移酶, 都是
由高尔基体合成的[4,5], 大部分多糖已被证实是在高
尔基体的库槽中加工形成的, 库槽间多糖的产生也
可以通过免疫细胞化学清晰地显示出来[6]. 多糖、糖
蛋白和多泡体之间的关系以及这些组分通过多泡体
转移到细胞壁的机制, 至今仍然不清楚.
58K 蛋白作为一种膜蛋白, 位于动物细胞的高
尔基体中[7], 并且已被相应的抗体所标记[8]. 李岩等
人[9]曾经报道用动物细胞的 58K 蛋白抗体来标记植
物花粉管细胞膜的类 58K 蛋白. 然而是否类 58K 蛋
白广泛地分布在植物细胞中还不得而知. 本实验使
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用了动物细胞 58K 蛋白的单克隆抗体, 应用免疫印
记、免疫荧光和免疫电子显微镜技术对拟南芥愈伤
组织进行研究, 旨在说明多泡体的起源、功能和分
泌途径, 阐述高尔基体和多泡体之间的关系.
1 材料和方法
1.1 实验材料
愈伤组织由拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶柄和
贯叶连翘(Hypericum perforatum)叶片经组织培养获
得, 并在诱导愈伤组织培养基中继续培养. 温度保持
在 25℃, 光照 12 h (2000 lx).
1.2 58K 蛋白抗体
鼠单克隆抗高尔基体 58K 蛋白(FTCD)抗体向美
国 Sigma 公司购买, 作为高尔基复合体的标记物, 这
一抗体已经经过高度纯化, 58K 蛋白预先也已经过鉴
定, 就像 FTCD 这一双重功能的酶, 引导 1-碳单位从
亚胺甲基谷氨酸, 组氨酸降解至叶酸途径中代谢产
物之一.
1.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法
(Western blotting)
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和 Western blot 杂交的
详细步骤严格按照 Laernmli 和 Towbin[10,11]的描述进
行. 电泳后的凝胶移至硝化纤维膜进行杂交, 20 V, 25
min 封闭. 然后, 首先使用一抗(1︰500)(鼠单克隆抗
体, 抗 58K 蛋白, Sigma 公司)孵育 1 h, 用 TBS(缓冲
液)清洗 3遍, 随后经二抗(羊抗鼠 IgG, Sigma公司)1 h,
TBS 清洗 3 遍, 然后染色.
1.4 免疫荧光共聚焦显微镜分析
拟南芥和贯叶连翘的愈伤组织切片经 3.5%多聚
甲醛固定, 用 1% BSA 封闭 10 min. 样品用一抗(抗
58K 蛋白, 1︰500)在 4℃条件下孵育过夜、清洗, 用
二抗(IgG-FITC, 1︰300)处理 1 h. 激光共聚焦显微镜
C1(尼康, 日本)观察、分析.
1.5 免疫电子显微镜分析
免疫电子显微镜的技术方法参见文献[12]. 拟南
芥的愈伤组织首先经过 4%多聚甲醛和 0.1%戊二醛固
定 2 h, 后经乙醇脱水(浓度为 30%, 50%, 70%, 85%,
100%), 经乙醇/LR-WHITE 环氧树脂渗透(2︰1, 1︰1,
1︰2), LR-WHITE 环氧树脂包埋, 使用莱卡超薄切
片机切片(厚度 100 nm). 免疫胶体金标记实验流程如
下: 材料经 0.1%双氧水蚀刻 1 min, 经 3% BSA 封闭
1 h, 随后用一抗(抗 58K 蛋白, Sigma)在 4℃条件下孵
育过夜, 用 TBS 清洗数次, 使用二抗(羊抗鼠 IgG 和
胶体金, 粒径 12nm)孵育 1 h, 然后切片经醋酸铀和柠
檬酸铅双染色, 用于 JEOL-1230 电子显微镜下分析.
2 结果
SDS 凝胶电泳结果显示, 确实有一条带位于拟南
芥和贯叶连翘的 58K 蛋白附近, 并且免疫印记结果显
示拟南芥和贯叶连翘中的类 58K 蛋白与其抗体相互作
用, 从而证实了类 58K 蛋白或其同源蛋白确实存在于
拟南芥和贯叶连翘的愈伤组织细胞中(图 1(a)和(b)).
图 1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果(a)和拟南芥和贯叶连翘 58 K 蛋白的免疫印记结果(b)
(a) 条带 2 和 4 为拟南芥叶, 条带 3 和 5 为贯叶连翘叶(箭头示 60 kD 植物蛋白); (b) 示拟南芥和贯叶连翘 58K 蛋白的免疫印记结果
许珊等: 拟南芥愈伤组织细胞类 58K 蛋白定位及多泡体的分泌途径
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但是否像动物细胞一样, 类 58K 蛋白同样存在于植
物细胞高尔基体和分泌泡中并不清楚.
免疫荧光技术已经成功将类 58K 蛋白定位于拟
南芥(图 2(a))和贯叶连翘(图 2(b))的愈伤组织细胞中.
图 2 激光共聚焦图片
拟南芥((a), 400×)和贯叶连翘((b), 400×)细胞的类 58K 蛋白的免疫
荧光定位
此外, 应用免疫电子显微镜技术可以特异地定
位高尔基体和多泡体的类 58K 蛋白, 进而有可能弄
清植物细胞中这 2 种具膜结构的细胞器之间的关系,
使得多泡体的起源和功能得以进一步阐述. 电子显
微镜观察显示, 免疫胶体金颗粒可以特异地定位于
高尔基体库槽, 高尔基体附近的分泌泡(图 3(a)和(b))
和细胞壁中(图 4(a)~(c)).
由单位膜包裹许多小泡组成的多泡体通常位于
细胞壁和液泡附近. 图 5(a)和(b)显示多泡体与细胞质
膜相连, 许多免疫胶体金颗粒定位于多泡体内部小
泡膜上, 而有些小泡则整体进入细胞壁中(箭头所示).
免疫胶体金颗粒清晰地定位于多泡体与细胞质膜连
接的地方, 细胞壁附近和细胞壁中的小泡上(图 5 (b)).
尽管多泡体中小泡常常解体形成一些小片段, 但仍
可为免疫胶体金标记(图 6 (a)和(b)).
图 3 拟南芥细胞的高尔基体(a)和局部放大(b)
(b)高尔基体库槽及其附近囊泡(箭头所示)的类 58 K 蛋白的标记;
G 示高尔基体
无论怎样, 在多泡体与质膜融合后可以清楚地
观察到细胞壁中带有免疫金颗粒标记的小泡(图 7(a)
和(b)). 并且仍然有一些带有免疫胶体金颗粒的多泡
体内陷进入中央液泡(图 8(a)和(b))而不是仅仅向细胞
壁方向移动.
3 讨论
SDS 凝胶电泳和免疫印迹实验已经清晰地显示
了 58 K 蛋白抗体与拟南芥和贯叶连翘愈伤组织呈免
疫反应的条带(图 1), 这可以证明愈伤组织细胞中具
有类 58 K 蛋白. 在这之前, 百合花粉管中的类 58 K
蛋白也得到李岩等人[9]的证实.
图 4 细胞壁中的类 58K 蛋白
(b)是(a)的局部放大; (c)箭头示细胞壁中集中分布的免疫胶体金颗粒
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图 5 示多泡体与细胞壁相连
大量的免疫胶体金颗粒特异地定位于多泡体内小泡膜上; (b)图是
(a)图的局部放大; W 示细胞壁
图 6 多泡体中解体的小泡
有时多泡体与细胞壁相连时多泡体内的小泡已发生解体, 但小泡
片段仍然为免疫胶体金所标记; W 示细胞壁
图 7 示多泡体的小泡进入细胞壁
多泡体的小泡及标记的金颗粒正位于细胞壁中(箭头); (b)是(a)的
局部放大; V 示小泡
3.1 高尔基体、多泡体和细胞壁之间的关系
从激光共聚焦显微镜和免疫电子显微镜的观察
结果分析, 类 58K 蛋白在拟南芥的高尔基体、多泡体
和细胞壁中均有分布, 可以推测多泡体可能起源于
高尔基体并且与细胞壁的生长有十分密切的联系.细
胞壁中的多糖如半纤维素、果胶等都是在高尔基体
图 8 多泡体的小泡进入液泡
多泡体及其特异性标记的小泡正进入液泡中; (b)是(a)的
局部放大
内加工合成的并且由高尔基体分泌泡运输. 由许多
小泡组成的多泡体作为高尔基体分泌泡的一种形式,
通常位于细胞壁附近, 更靠近细胞质膜, 有时甚至与
质膜相连. 在早期的一些研究中, 有学者认为多泡体
与细胞代谢的分泌过程有关, 或者与细胞壁的代谢
有关[13]. Halperin 和 Jensen [14]报道胡萝卜细胞中多泡
体起源于高尔基体, 并且作为分泌泡运送细胞壁的
前体物质. Marchant 和 Robards [15]认为多泡体与细胞
壁的生长有十分密切的关系. 多泡体的发生可能是
细胞壁前体物质向细胞壁运输的一个先决环节 [15],
之前关于多泡体的论述多是基于形态学证据和推论.
本研究应用 58K 蛋白的单克隆抗体作为高尔基体的
特异性标记, 证实了拟南芥和贯叶连翘愈伤组织中
高尔基体和多泡体存有类 58K 蛋白, 并且通过超微
结构的免疫定位证实了类 58K 蛋白在拟南芥愈伤组
织细胞的高尔基体、多泡体和细胞壁中均有分布. 事
实上免疫胶体金颗粒标记的这些结构毫无疑问地支
持了分布在拟南芥愈伤组织细胞中的类 58K 蛋白.
作为动物细胞中 58K 蛋白的类似蛋白, 同样可以与
动物细胞的 58K 蛋白抗体进行免疫交叉反应. 我们
的研究结果对于植物细胞中是否具有类似动物细胞
蛋白的讨论, 有一定的帮助, 并且开阔了研究视野.
当然, 仍有一个问题就是多泡体的外膜并没有
被 58K 蛋白抗体标记. 可以推测多泡体的外膜可能
起源于内质网等, 但至今仍没有直接证据来证实, 还
需要进行深入的研究.
3.2 多泡体的分泌途径
自从 1898 年发现了高尔基体以后, 高尔基体及
许珊等: 拟南芥愈伤组织细胞类 58K 蛋白定位及多泡体的分泌途径
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其分泌泡的分泌机制一直受到极大的关注并且成为
研究热点之一. 高尔基体合成的物质是通过胞吐途
径运送至细胞外从而履行了高尔基体的分泌功能 .
根据高尔基体库槽和多泡体的类 58K 蛋白的定位,
已经可以证实植物细胞多泡体的起源和分泌途径 .
图 5(b)说明当多泡体运送至细胞壁附近与细胞质膜
融合, 然后释放其内部的小泡或者小泡片段到细胞
壁, 从而通过分泌途径实现其运输功能. 安千里[16]
曾经报道了类似的现象. 此外, 免疫胶体金颗粒标
记的多泡体也会发生内陷进入中央液泡(图 8(a)和
(b))说明多泡体不但与细胞壁的生长有关而且有可
能与液泡的发育有关. 植物细胞中液泡具有动物细
胞溶酶体的性质. 动物细胞中溶酶体常常与多泡体
发生融合 [1], 所以植物细胞中多泡体与液泡的融合
也就不足为奇了. 另外, 植物细胞的多泡体在细胞
分裂后期还可以参与细胞板的形成 [3]. 综上所述 ,
多泡体的分泌途径既有向外分泌到细胞壁的胞吐途
径(运送物质到细胞壁), 也有向内与液泡融合的胞
饮途径(运送物质到液泡)[17], 这很可能取决于多泡
体所运送物质的种类及其目的地. 由此看来, 植物
细胞中高尔基体分泌泡的分泌途径可能要比动物细
胞更加丰富[18].
致谢 感谢陈昌杰和祝寿嵩教授对稿件的修改和讨论.
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