全 文 ：中国农学通报 第23卷 第 12期 2007年 12月
http://www.casb.org.cn
农业生物技术科学
Gateway克隆技术是美国Invitrogen公司开发的
一种位点特异重组的克隆技术，该技术主要基于λ噬
菌体位点特异重组系统（λ噬菌体用此重组系统进行
裂解途径和溶原途径间的互相转换）[1,2]实现了不需要
传统酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转
移，同时还保持了正确的ORF和方向[3]。该技术主要由
BP和LR两个反应构成。
雄性不育是生产上杂交制种的基础，花药及花粉
发育异常会导致雄性不育，因此对这些基因的深入研
究既有理论意义，又有实际应用价值。随着2000年底
模式植物拟南芥[4,5]全基因组测序工作的完成[6]，大量
育性相关基因被识别，在拟南芥花药及花粉发育过程
中约有3500个特异表达基因[7]，这些基因的突变会导
致雄性不育[8]，但是目前绝大部分基因的功能尚不清
楚。要阐明这些基因的功能，利用国际上已经成熟构建
的拟南芥突变体库[9,10]，用反向遗传学方法进行基因功
能鉴定是条捷径。突变基因的功能研究需要构建相应
的载体进行互补实验[11]而Gateway技术是一种高效，
快速的克隆系统。
笔者从ABRC获得SALK-138003突变体是拟南
芥 GHF (glycosyl hydrolase family 17 protein)基因
(At3g23770)的T-DNA插入突变。该基因与花药蛋白
基金项目：国家自然基金“芸薹属蔬菜可调控雄性不育基因构建”（30471188/C02021001）。
第一作者简介：胡金艳，女，1979年出生，硕士，生物化学与分子生物学专业，基因工程方向，从2006—2007于中国农业科学院蔬菜花卉研究所客座硕
士论文，主要研究花药败育相关基因，通过拟南芥雄性不育突变体从反相遗传学角度阐明了PMEI,GHF两个与花药育性相关的基因的功能。通信地
址：100027 北京朝阳区霄云路霞光里30号院14楼4门103室。Tel：010-52011807，E-mail：hujinyan12345@126.com。
收稿日期：2007-10-01，修回日期：2007-10-28。
基于Gateway技术的拟南芥雄性不育GHF
基因表达载体的构建
胡金艳 1,2,张书祥 1,王晓武 2,武 剑 2
(1安徽大学生命科学院，合肥232007；2中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081)
摘 要:随着模式植物拟南芥全基因组测序工作的完成更多雄性不育相关基因功能需要阐明。利用拟南
芥突变体库,从反向遗传学角度进行突变基因的功能研究需要构建相应的载体进行互补实验。Gateway
技术是一种高效,快速的克隆系统。笔者利用Gateway克隆技术成功构建拟南芥GHF基因表达载体,并
遗传转化拟南芥,为进一步阐明该基因功能奠定了基础。
关键词:Gateway克隆技术;拟南芥(Arabidopsis thaliana);雄性不育;GHF基因;表达载体
中图分类号:S- 3 文献标识码:A
Construction of Expression Vector of Arabidopsis Male Sterile GHF
Gene Using Gateway Cloning Technology
Hu Jinyan1,2, ZhangShuxiang1, WangXiaowu2, Wu Jian2
(1Anhui University, Life College, Hefei 232007；
2Institution ofVegetables and Flowers, Chinese AcademyofAgricultural Sciences, Beijing100081)
Abstract: With the completion of the whole genome sequence of mode plant Arabidopsis, more functions of
male sterile gene need tobe expounded. UsingArabidopsis mutant bank toidentifyfunctions ofmutant gene
and correspondingvector need tobe constructed .In order tocarryout the complementary experiment. Gate-
waycloningtechnologyis a fast cloningsystem. In this article, using Gateway technology GHF gene expres-
sion vector was constructed and introduced into Arabidopsis. It was useful for further gene functional re-
search.
Key words: Gatewaycloningtechnology, Arabidopsis thaliana, male sterile, GHF gene, expression vector
农业生物技术科学
45· ·
ChineseAgriculturalScienceBuletinVol.23No.122007December
htp:/www.casb.org.cn
农业生物技术科学
的特异表达相关，为进一步阐明该基因功能，笔者通过
Gateway克隆技术构建GHF基因表达载体，并将该载
体遗传转化拟南芥。
1材料与方法
1.1试验时间、地点
分子克隆试验于2007年初在中国农业科学院蔬
菜花卉研究所进行。
1.2植物材料
将columbia生态型拟南芥（Arabidopsisthaliana）
GHF基因突变纯合株种子播于育苗钵中，上覆纱布，
置于人工气候室 21~23℃，8000lx，16h光照 /8h黑暗
每天，80%湿度培养至开花，剪去已开花的主茎抑制顶
端优势，当抽出大量开花侧枝时做花序浸润转化[12]。
1.3拟南芥花蕾总 RNA的提取及 GHF基因的 cD-
NA克隆
拟南芥花蕾总RNA的提取采用Trizol法并稍加
修改，其中用氯仿抽提蛋白杂质两遍，异丙醇于-20℃
沉淀RNA2h以上。RNA反转录合成单链cDNA按反
转录试剂盒程序进行（Invitrogen）。根据拟南芥数据库
中 GHF基因（At3g23770）序列，利用软件Primer5.0设
计，合成一对特异引物 （Top5′ggggacaagttgta
caaaaaagcaggctaATGACTCCTTTTGCTCTGTTCCT3′,
Botom5′ggggaccacttgtacaagaaagctgggtcTCTTTTGAT
CCTTTCCTCCACAC3′），在上、下游引物5′端分别加
上pDONRvector的定向重组位点atB1、atB2（小写
部分），预期扩增GHF基因全长1864bp。以cDNA为
模板，Tm55℃，34个循环进行RT-PCR扩增。
1.4GHF基因表达载体的构建
RT-PCR产物经 PEG纯化：45μlPCR产物加入
135μlTE (pH8.0)和 90μlPEG（Invitrogen），4℃ ，
15000rpm/min，离心 20min，去上清，将沉淀溶于少量
TE中。按Invitrogen公司GatewayBPreaction试剂盒
操作说明取适量纯化产物与 pDONR201进行 BP反
应，获得入门克隆，热激转化大肠杆菌DH5a，50mg/L
Kan抗性筛选，挑取单克隆用上述基因特异引物（去
掉atB位点）进行菌落PCR鉴定（图1）。鉴定出的阳
性克隆用小量SDS法（分子克隆手册）抽提质粒，取适
量阳性质粒（即entryclone）与目的载体pH7WG2.0按
GatewayLRreaction试剂盒程序进行LR反应，获得
表达载体，热激转化大肠杆菌DH5a，100mg/LHyg抗
性筛选，挑取单克隆再次用基因特异引物进行菌落
PCR鉴定，PCR所得阳性克隆再进行 Xbal、HindⅢ
（Promaga）双酶切鉴定并送北京生工生物工程公司测
序，最终阳性克隆命名为GHF-pH7WG。随后，采用电
激转化法 [13]将 GHF-pH7WG质粒导入农杆菌菌株
AGL0。
1.5GHF-pH7WG表达载体对拟南芥的遗传转化
拟南芥的转化采用花序浸润法，参照Clough等[12]
的方法并略做修改；将离心收集得到的农杆菌菌体悬
浮于浸染液 （LB+5%蔗糖 +0.02%表面活性剂
Tween20）至OD600约0.8。取待转化植株迅速倒扣在
浸染液中，使植株全部花序浸没90s后取出置于暗处
46· ·
中国农学通报 第23卷 第 12期 2007年 12月
htp:/www.casb.org.cn
农业生物技术科学
平放一夜，移至长日照条件下生长，收种。
2结果与分析
2.1GHF基因的cDNA克隆
野生型拟南芥的RT-PCR扩增产物在1.0%的琼
脂糖凝胶电泳中均呈现一条清晰的条带，片段大小与
预期的1864bp一致（图2A），而负对照无扩增条带，表
明已成功扩增获得拟南芥GHF基因片段。
2.2GHF基因表达载体的构建
BP反应后获得入门克隆，经Kan抗性筛选，进行
菌落 PCR鉴定，其中挑取 10个单克隆 9个均扩出
1864bp的目标带，阳性重组率高达90%；LR反应获得
表达载体，经Hyg抗性筛选后，PCR鉴定阳性重组率
亦高达 89%（图 2C）。以 Xbal、HindⅢ双酶切质粒
DNA，也表明GHF-pH7WG中含有大小正确的GHF
基因片段（图2B）。测序结果在NCBI中比对与目的基
因 (At3g23770)的同源性高达 99%。电激转化
GHF-pH7WG质粒入根癌农杆菌AGL0菌株后，抽提
出GHF-pH7WG质粒进行PCR鉴定获得目的片段。上
述结果表明笔者构建的植物表达载体 GHF-pH7WG
含有GHF基因，并已成功转化农杆菌 AGL0，可用于
植物的遗传转化。
2.3GHF-pH7WG表达载体对拟南芥的遗传转化及
阳性苗鉴定
携带着GHF-pH7WG质粒的根癌农杆菌AGLO的
菌体浸润拟南芥的大量花序后，收获被浸润植株的种
子，播于含10mg/LHyg抗性的培养基上，生长7~10d
后发现，具有Hyg抗性的植株大小正常，子叶绿色并
能形成正常根系，而没有整合外源基因的对照组很小
就白化死亡。以抗性植株的基因组DNA为模版，PCR
扩增出了预期片段，表明目的外源基因GHF已经整合
到拟南芥突变体基因组中。
3讨论
Walhout等人[14]在2000年Science上发表的论文
中使用Gateway克隆技术，用来在酵母双杂交系统中
进行蛋白相互作用的研究。Rudolph等人 [15]发表在
PANS上的文章中使用了Gateway系统中的TOPO反
应构建了Entry质粒。Grand-Peret等人[16]在2001年的
Nat.Med.上的论文中用Gateway克隆技术克隆目的基
因。可见Gateway克隆技术已经广泛应用于各种研究
领域。与传统的克隆方法相比，Gateway克隆技术的优
点是：可以不必考虑目的DNA是否有合适的酶切位
点，也不必进行烦琐而费时费力的酶切和连接反应，一
图2GHF基因的RT-PCR扩增,GHF-pH7WG2.0重组载体的酶切鉴定及LR反应菌落PCR鉴定
A：1—DNA分子量标准；2、3—野生型拟南芥；4—GHF基因突变体对照。B：1—GHF-pH7WG2.0载体的酶切检测；2—DNA分子量标准。C：1—DNA
分子量标准；2~10—GHF基因的单菌落PCR。
2000bp
1200bp
C
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A
1 2 3 4
2000bp
1200bp
1864bp
B
8505bp
2013bp
992bp
1 2
10000bp
8000bp
2000bp
1000bp
47· ·
ChineseAgriculturalScienceBuletinVol.23No.122007December
htp:/www.casb.org.cn
农业生物技术科学
但获得入门克隆，就可以按确定的方向和读码框快速
而准确地将目的DNA克隆到各种与Gateway技术兼
容的目的载体上[17,18]。
笔者利用Gateway克隆技术构建载体采用Gate-
way特有的 PEG纯化法，BP、LR重组反应各只需
60min，不仅省时省力而且阳性重组率极高，因为重组
反应除了有抗性筛选外，在pDONR201和pH7WG2.0
质粒上均带有ccDB基因[19]对大肠杆菌有致死作用，
只有发生正确重组被目的基因片段替换后，宿主菌才
可以正常生长。笔者在实验中构建的GHF-pH7WG表
达载体为进一步阐明拟南芥雄性不育GHF基因功能
创造了条件。
参考文献
[1] BushmanW,ThompsonJF,VargasLetal.Controlofdirectionality
inlambdasitespecificrecombination.Science,1985,230(4278):
906-911.
[2] LandyA.Dynamic,structural,andregulatoryaspectsoflambda
site-specificrecombination.AnnuRevBiochem,1989,58:913-949.
[3] HartleyJL,TempleGF,BraschMA.DNAcloningusinginvitro
site-specific recombination. Genome Research,2000,10 (11):
1788-1795.
[4] MeyerowitzEM.Arabidopsisthaliana.AnnuRevGenetics,1987,21:
93-111.
[5] KonczC,ChuaN-H,SchelJ.MethodsinArabidopsisResearch.
WorldScientificPress,1992.
[6] KaulS,KooHL,FraserCMetal.Analysisofthegenomesequence
ofthefloweringplantArabidopsisthaliana.Nature,2000,408:
796-815.
[7] SandersPM,BuiAQ,WeteringsKetal.Antherdevelopmentalde-
fectsinArabidopsisthalianamale-sterilemutants.SexPlantReprod,
1999,11:297-322.
[8] WilsonZA,MorolSM,DawsonJetal.TheArabidopsismale
sterility1(MS1)geneisatranscriptionalregulatorofmalegameto-
genesis,withhomologytothePHD-fingerfamilyoftranscription
factors.PlantJ,2001,28:27-39.
[9] Azpiroz-LeehanR,FeldmannK.T-DNAinsertionmutagenesisin
Arabidopsis:Goingbackandforth.TrendsGenet,1997,13:152-156.
[10] KrysanPJ,YoungJC,SussmanMR.T-DNAasaninsertionalmu-
tageninArabidopsis.PlantCel,1999,11:2283-2290.
[11] PatrickJKrysan,JeferyCYoung,MichaelR.T-DNAasanInser-
tionalMutageninArabidopsis.PlantCel,1999,11:2283-2290.
[12] CloughSJ,BentAF.Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobac-
terium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ,
1998,16:735-743.
[13] DenDulk-RasA,HooykaasPJJ.ElectroporationofAgrobacterium
tumefaciens.MethodsMol.Biol,1995,55:63-72.
[14] WalhoutAJ,SordelaR,LuXetal.Proteininteractionmappingin
C.elegansusingproteinsinvolvedinvulvaldevelopment.Science,
2000,287(5450):116-122.
[15] RudolphC,SchreierPH,UhrigJF.Peptide-mediatedbroad-spec-
trumplantresistancetotospoviruses.ProcNatlAcadSci,2003,100
(8):4429-4434.
[16] Grand-PeretT,BouilotA,PerotAetal.SCAPligandsarepotent
newlipid-loweringdrugs.NatMed,2001,7(12):1332-1338.
[17] 陈其军,安瑞,周海梦,等.使用与Gateway技术兼容的T载体获得
入门克隆.生物化学与生物物理进展,2004,31(10):951-954.
[18] 梅文倩,宋文强,朱玉贤,等.利用Gateway克隆技术大规模克隆拟
南芥转录因子.分子植物育种,2004,2(3):358-364.
[19] BernardP,CouturierM.CelkilingbytheFplasmidCcdBprotein
involvespoisoningofDNA-topoisomeraseⅡ complexes.MolBio,
1992,226(3):735-745.
（责任编辑：刘艳鹏）
48· ·