全 文 ：科 考 连 叙 第 4 6卷 第 2 3期 21 0 0年 1 2月 简 报
通过 c A D N阵列技术鉴定拟南芥生长素应答基因
包 方 胡玉欣 李家洋 *
(中国科学院遗传研究所 北京 1 0] 01 , ` 联系人 , E 一m a i一: jy l s @ g e n e it e s ` a e ￡n )
摘要 生长素作为一种重要的植物激素具有广泛的生理作用 , 但其作用的分子机理还有待于深入研究 .
为系统地鉴定生长素应答基因 , 采用 c D N A 阵列技术检测拟南芥悬浮细胞系经 IA A 处理前后基因表达
的变化 , 从 13 82 4 个 c D N A 克隆中筛选到 50 个差异表达克隆 . 这些生长素应答基因分别与信号转导 、 逆
境反应 、 衰老 、 光合作用 、 蛋白质合成与转运等功能相关 . 从分子生物学角度证 明了生长素的广泛作
用 , 为研究其作用机制提供了线索 . 另外 , 初步鉴定了一个受外源生长素抑制的叶绿体蛋白酶调节亚
基 C l , C 基因的功能 , 证明该基因在衰老叶片中被诱导 , 是一个衰老相关基因 .
关键词 c D N A 阵列 生长素应答基因 拟南芥 C勿c 衰老相关基因
生长素是一种重要 的植物激素 , 参与细胞分裂
与伸长 、 维管束分化 、 侧根发生 、 植物向性反应以及
叶片衰老等生理过程 . 尽管生长素的生理功能已得
到深人研究 , 但其作用的分子机理尚不十分清楚 . 目
前对生长素信号转导的研究主要包括两个方面 : 一
方面是对生长素不敏感突变体的分离与研究 , 在此
基础上 , 提出了一条泛素介导 的生长素信号转导途
径 [ ’长另一方面是生长素早期应答基因的鉴定与分析 ,
现已鉴定出多个生长素早期应答基因家族曰 然而 ,
生长素早期应答基因的功能及其下游基因并不清楚 ,
生长素泛素信号转导途径的靶蛋白尚未确定 , 该途
径与早期应答基 因的相互关系仍有待进 一步研究 .
因此全面地鉴定生长素应答基 因 , 将有助于从整体
_
L 了解生长素生理作用 的分子机制 , 并有可能将其
信号转导途径与特异的下游功能相联系 .
生长素抑制叶片衰老 , 但生长素对衰老相关基
因的调控作用 目前尚无报道 . 叶片衰老涉及一系列
降解过程 , 受到严格调控 , 多种蛋白酶 、 R N A 酶等均
受衰老诱导 3J] . 其中 , 一种高度选择性的叶绿体蛋白
酶 (e lp p r o te a s e )￡4 J的多个亚基 已被证明参与衰老过
程 , 但叶绿体蛋 白酶在衰老过程中的作用并不清楚 ,
而且并非其所有亚基均受衰老诱导 15] .
我们采 用 c D N A 阵列技术 6l[ , 从拟南芥苗 期
c D N A 文库的 1 3 8 2 4 个克隆中鉴定生长素应答基因 ,
对其进行了初步分析 , 并对其中一个功能未知 的叶
绿体蛋白酶调节亚基 C心, c 基因进行了初步鉴定 , 发
现其在叶片衰老过程中被诱导 .
1 材料与方法
( i ) 植 物材料 . 拟 南芥 (A r a 右i而 l , 5 1、 动 a l ia n a )
C o l u m b i a 生态型 (C o l一 0 ) .
( il ) 悬浮细胞系的建立与激素处理 . 悬浮细胞
系的建立方法如文献 7[ ]所述 . 用 5 仁m ol L/ 叫噪乙酸
( i n d o xe
一
3
一 a e e t i c a e i d
,
xA A )处理饥饿培养 4 8 h 的悬浮
细胞 , 第 0 , 1 , 3 小时收集细胞 , 提取 R N A 用于逆
转录制备 c D N A 探针 ; 用 5 林m ol L/ I A A 处理悬浮
细胞 O, l , 2 , 4 , s h 后提取 R N A 作 N o r t h e r n 分析 ; 用
10 0 林川 0 1几 脱落酸 (a b s c i s i c a e id , A B A )处理悬浮细胞
O
,
z
,
2
,
4
,
s h 后提取 RN A 作 N o r t h e r n 分析 .
(正 ) c D N A 阵列 . c D N A 阵列方法如文献口 ]所
述 . 从拟南芥苗期 c D N A 文库提取单克隆质粒 D N A ,
用 B i o m e k 2 0 0 0 核酸工作站 ( B e e k m a n , U S A )在强化硝
酸纤维素膜 ( S e h l e i e h e r & s e h u e 一, G e rm a n y ) _上制成高
密度 c D N A 阵列膜 , 每个克隆重复 3 次 , 平行制作 3
套阵列膜 . 以 [a 一 3 2P] d c T P标记的 c D N A 第一链为探针 ,
反转录方法如文献7[ ]所述 . 杂交信号用 hP os p ho im a ge r
(M o l e e u l a : D y n a m i e s
,
u s A )扫描后进行差异表达克
隆的挑选 .
( iv ) RN A 提取与 N or ht er n 分析 . 总 RN A 提取
采用酸性硫氰酸肌一苯酚一氯仿抽提法8[] . 定量后 一 20 ℃
保存 . 将 巧 扛g 总 R N A 在甲醛变性胶中电泳后转移
至 Hy bo n d 一N +尼龙膜 (A m e r s h a m hP amr a e i a , u SA ) , 80 ℃
烤膜 Z h 固着 R N A . 杂交方法如文献 9[ ]所述 . 用
P h o s p h o i m a g e r 扫描并测定灰度值 .
( v ) 测序及同源性分析 . 将挑选出的克隆亚克
隆到 p B l u e s e d p t n s K (+ )质粒上 , 用 D Y E n a m i e D i r e e t
d G T P e y e l e s e q k i t (A m o r s h a m p h a r m a e i a
,
U s A )在
A B I 3 7 3A 型 D N A 测序仪 (P e r k i n E lm e r, U S A ) 仁测序 .
在 G en B an k 中进行核昔酸或氨基酸顺序同源性 比较 .
1 98 8 WW W
.
S C ICh i n a
.
C O m


简 手及 第 4 6卷 第 23期 2 0 01 年 1 2月 科 考连 叙
源生长素的干扰 .c A D N阵列技术使得经济有效地大
量检测差异表达基因成为可能 .该技术被证明具有
较高的准确性 [] 6 (图 ) 2, 并已被成功地应用于油菜素
内醋应答基因的鉴定 l7, ” ].
3
.
1 对生长素应答基因的初步分析
我们鉴定到的生长素应答基因涉及信号转导 、 逆
境反应 、 衰老以及光合作用等多个方面 , 与已知生长
素的功能相 一致 . 值得 注意 的是 , 钙调 蛋 白基因
aC MZ 和阳离子通道基因 A t C N G . ( e y e li e n u e l e o t i d e -
g a t e d c a t i o n 。 h a n n e l , e n g 通 道 )均 受 生长素调 控 .
tA C N G cZ 编码一种环核昔酸门控阳离子通道蛋白〔’ 2],
当有 c A M P或 c G M P结合时 , 便形成孔道 , 使阳离子
如 K + , e a Z+或 N a +通过 . 动物细胞内的 c n g 通道将
c A M P或 c G M P 的变化转换为膜电位或阳离子流导入
细胞 内 , 引发一系列信号转导级联反应 【’ 3〕. 生长素
对 c a M Z 和 A t C N G c Z 的抑制作用提示生长素可能通
过影响胞内 c a +2 水平来调节依赖 C a +2 或 c a +2廊调蛋白
的信号通路 . 此外 , 生长素还可能通过 M yb 相关转录
因子等调节下游基因的转录水平 . s m t 3 ( s u p p r e s s o : o r
m尹 )是一种类泛素 ( u b i q u i ti n 一 l i k e ) , 生长素对其表达
的调控可能是生长素介入泛素途径的方式之一
有证据表 明 , 生长素与植物逆境或抗性反应存
在相互关联 . 生长素的早期应答基因家族 G H Z4/ 同
时受到逆境相关途径 的调控 [ ’ 4 ;] 植物受伤 〔’ 5 ]或受病
原菌侵染 16 】后 , 参与叫噪 乙 酸代谢 的基 因 NI ZT
( n i t r i l a s e )或 从形 ( I A A 一A la h y d r o l a s e )被诱导 , 导致有
活性的游离态引噪乙酸水平提高 . 我们鉴定出的生
长素应答基因中有 5 个与逆境反应相关 . A刃U E K K I
(A ar b i故沪 5 15 h o m o l o g u e o f M E K K ) 编码一个M A p K K K
(m i t
o g e n
一 a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e k i n a s e k i n a s e )
, 被低
温和渗透胁迫诱导〔’ 7 ] . A t 一尺￡刀3 (R e l A / S p o T h o m o l o g )
是 植物中首次 克 隆到 的 R e lA SP/ o T 同源 基因 8j[ .]
eR lAI SP
O T 在细菌细胞中调节 (p ) P GP p 的水平 , 参与
细 菌严 紧 型 反 应 ( s t r i n g e n t r e s p o n s e ) , 因 此推 测
A tR s H 3 可能参与植物对逆境的类似反应 ’` “ 1. 过氧化氢
酶 l ( e a t a l a s e x , C a t l )参与清除逆境损伤所产生的 H Z O Z ,
其基因在多种逆境反应中被诱导 【’ 91 . 铁结合蛋 白基
因 F o lr ( fe r it n) 受冷诱导 20[ l , 并与植物对氧化损伤和
病原侵染的抗性有关12
生长素具有抑制叶片衰老的功能 . A块 s rZ 仪 lut a -
m i n e s y n t h e t a s e i n e y t o s o z)编码叶绿体中的一种谷氨
酸合成酶 l2] , 参 与 叶片衰老过 程 中叶绿体内氮元
素的重组与分配 , 被衰老过程诱导 , 是一个衰老相关
基因 .
拟南芥 tA C D c , 与酵母 。 dc s +基因同源 , 主要在
芽和根的分生组织表达 , 推测其功能与 。 d叮 十相似 ,
在细胞周期调控中起作用 , 推动细胞从 G Z 期进人 M
期 123 ] . 生长素可能通过对该基因的调节影响细胞分
裂或侧根发生 .
早期研究证明 , 生长素在叶片或离体的叶绿体
内促进光合作用和二氧化碳固定 12 4 } , 参与质体建成
的叶绿体 a/ b 结合蛋白 ( c ab ) 、 参与 C O : 固定的磷酸 /
磷酸丙糖转运蛋白 、 磷酸烯醇式丙酮酸梭化激酶等基
因均被生长素诱导 . 此外 , 与肤链的合成 (延伸因子
E F
一
l a
一
A 4) 和与蛋白质的运输 (。 l at hr in 及热激蛋白辅
助因子 H s c 7 0) 有关的基因也受生长素调控 .
生长素应答基因的鉴定结果显示 , 与细胞生长
或分裂相关的基 因受到生长素诱导 , 而与衰老和逆
境相关的基因则大多被抑制 . 这从分子生物学角度
印证了生长素促进生长 、 抑制衰老的作用 , 并为研究
生长素不同生理功能的作用机制提供了线索 .
.3 2
CIP
c 在衰老叶片中被诱导
植物叶绿体蛋白酶位于叶绿体内 , 是一类具有
高度选择性的蛋 白酶 , 它包括两个亚基 : 调节亚基
cl CP 和催化亚基 cl p P[ 4] . 植物中已发现多个不同的
叶绿体蛋白酶亚基 125 一27] . 叶绿体蛋 白酶可能 由不同
的亚基搭配组合而成 l5] , 其调节亚基 E R D I 和催化亚
基 n cl pPS , p cl p P 已被证明参与衰老叶绿体中蛋白质
的降解 , 其他亚基如 tA c lP c 则不受衰老诱导 15] . 我们
鉴定出的生长素应答基因 C IP C 的表达模式与功能 目
前尚无报道 . 离体叶片经黑暗处理可强烈诱导衰老
相关基因的表达 128 ] , 我们在黑暗诱导衰老的叶片中
检测 C IP c 表达量的变化 , 研究其是否为衰老相关基
因 . 结果显示 , C IP c 表达量随处理时间延长而增加 ,
而 I A A 处理可在诱导初期抑制其表达 (图 3( c) ) . 此外 ,
A B A 处理也诱导 c 勿c 表达 (图 3 (b) ) . 以上结果提示 ,
C勿c 可能是一个衰老相关基 因 .
致谢 本工 作 为 国家 自然科 学基金 资助项 目 (批准号 :
30 0 7 00 7 4
,
39 8 8 90 0 3
,
39 5 2 50 17 )
.
WW W
.
S C io h i n 日 . C 0 m 19 9 1
科 考 五 叙 第 4 e卷 第 2 3期0 0 2 1年 2 1月 简 手及
参 考 文 献
2
3
l 8
4
l 9
5
0 2
6
7
2 1
8
2 2
9
10
2 3
l 1
2 4
l2
2 5
13
】4
2 6
l 52
7
28
16
m it o g en
一
a et iv at ed P r ot e in k in a s e k in a s e k in a s e 15 ind u e ed
5 im ul t an e o u sl y w ir g hn e e sf o
r a m it o gn e
一
a et iv at ed P r ot e in k in a s e
n ad an 6 5r b i o s o m al P r ot e in k in a s eb yt o u e h
,
e o ld
,
a n d w a t e r
s t r e s s i n A ar b id op
s i s t ha l i a n a
.
P r o c N a t l A e a d S e i U S A
,
19 9 6
,
9 3:
7 6 5~ 7 69
v a n d e r B i e z e n E
,
S u n J
,
C o l e m a n M J
,
e t a l
.
A ar b id o P s l s
R e lA /S P o T h o m o l o g s im P l ie a t e (P )P PG P p i
n P l a n t s ig n a l in g
.
P r o c
N a t l A e a d S e i U S A
,
2 0 0()
,
9 7 : 3 74 7一 3 7 5 2
G u a n L M
,
Z h a o J
,
S e a n da l i o s J G
.
C i s
一
e l e m e n t s a n d t r a n s
一
fa e t o r s
t h a t r e g u l a t e e x Pr e s s i o n o f t h e m a i z e aC
t ] a n t i o x id a n t g e n e i n
r e s Po n s e t o A B A a n d o s m o t i e s t r e s s : H Z O Z 15 t h e l ik e ly
i n t e r m e d i a r y s ig n a l i n g m o l e e u l e fo r th e r e s Po n s e
.
P l a n t J
,
2 0 00
,
2 2 : 8 7 ~ 9 5
S e ki M
,
N a r u s a k a M
,
A be H
,
e t a l
.
M o n i t o r in g th e e x Pr e s s i o n
P a t t e r n o f 13 0 0 A ar b盆d即 s i s g e n e s u n d e r d r o u g h t a n d e o 飞d s t er s s e s
b y u s i n g a fo l l
一
l e n g t h c D N A m i e r o a r a y
.
P l a n t C e l l
,
2 0 0 1
,
13 :
6 1 、 7 2
D e a k M
,
H o r v a t h G
,
D a v l e t o v a S
,
e t a l P l a n t s e e t o P i e a l ly
e x P r e s s i n g th e i r o n
一
b in d i n g P r o t e i n
,
fe r r i t i n
,
a r e t o l e r a n t t o
o x i d a t i v e d a m a g e a n d P a t h o g e n s
.
N a t u r e B i o t e e h
,
19 9 8
,
17 :
1 92 ~ 19 6
B e r n h a rd W R
,
M a t i l e P D ife
r e n t i a l e x P r e s s i o n o f g lu t a m in e
s y n t h e t a s e g e n e s d u r i n g th e s e n e s e e n e e o f 月ra b id o P s i s rh a l i “ n a
r o s e t t e l e a v e s
.
P l a n t S e i
,
19 9 4
,
9 8 : 7 一 14
H i r a y a m a T, Sh i
n o z ak i K
、
A e dc 多+ h o m o l o g o f a h i g h e r P l a n t,
A r a b i口口P s 行 rh a l必 n a . P r o e N a t l A e a d S c i U S A , 19 9 6 , 9 3 : 13 3 7 1~
1 33 7 6
B r e n n e r M L
,
C he ik h N
.
T h e r o l e o f h o r m o n e s i n P h o t o s y n t h a t e
P a r t i t i o n i n g a n d s e e d if l l i n g
,
I n : D a v i e s p J
,
e d
.
P l a n t H o r m o n e s :
P h y s i o l o g y
,
B i o e h e m i s t r y a n d M
o l e e u l a r B i o l o g y
.
D o r d r e e h t:
K lu w e r A e a de m i c P u b l i s he r s
,
19 9 5
.
6 4 9~ 6 7 0
K iy o s u e T
,
aY m
a g u e h i
一
S h in o z a k i K
,
S h i n o z a k i K
.
C ha r a e t e r i z a
-
t j o n o f e D N A fo r a d e h y d ar t主o n 一孟n d u e ib ] e g e n e t h a t e n e o d e d a
C I P
一
A
, 一
B li k e P r o t e i n in A ra b i dop
s i s rh a l i a n a L
.
B i o e h e m
B i o P h y s R e s
,
19 9 3
,
] 9 6 : 12 14 ~ ] 2 2 0
M
o o r e T
,
K e e g s t r a K
.
C h a r a e t e r i z a t i o n o f a e D N A e l o n e e n e o d in g
a c h l o r o P l a s t
一
t a gr
e t e d C IP ho m o l o g u e
.
P la n t M o l B i o l
,
19 9 3
,
2 1:
5 2 5~ 5 37
S e h a
fe
r A A
,
Ry a n C A
.
C l o n i n g o f a t o m a t o e D N A ( G e n B a n k
L 3 85 8 1 ) e n e o di n g t h e P r o t e o ly t i e s u b u n i t o f a C lp
一
l ik e e n e r g y
d e p e n d e n t P r o t e a s e
·
p l a n t p h y s i o l
,
19 9 5
, 10 5 : 13 4 1一 134 3
W e a v e r L M
,
G a n S
,
Q u i r i n o B
,
e t a l
.
A e o m P a r i s o n o f t h e
e x P r e s s i o n Pa t t e r n s o f s e v e r a l s e n e s e e n e e
一
a s s o e i a t e d g e n e s i n
r e s Po n s e t o s t r e s s a n d h o r m o n e tr e a tm e n t
、
P l a n t M
o l B i o l
,
19 9 8
,
3 7 : 4 5 5一 4 6 9
17
W a lk e r L
,
E s忱 l l e M . M o l e e u l a r m e e h a n i sm s o f a u x i n ac t i o n . C u r r
O P in P l a n t B i o l
,
19 9 8
,
l : 4 3 4 一 4 3 9
A be l S
、
T h e o l o g i s A
.
E a r l y g e n e s a n d a u x i n a e t i o n
,
P l a n t P h y s i o l
19 9 6
,
] 11 : 9~ 17
B u e h a n a n
一
W o l l a s t o n 丫 T he m o l e e u l a r b i o l o g y o f l e a f s e n e s e e n e e
J E x P B o t
,
19 9 7
,
4 8 : 18 1一 19 9
S h a n k l i n J
,
D e w i t t N D
,
F l a n a g a n J M
.
T h e s t r o m a o f h ig h e r P l a n t
Pl a s t id s e o n t a i n C IP P a n d C IP C
,
fu n e t i o n a l h o m o l o g s o f
石s e h e r i e h i a e o l i C IP P a n d C IP A : A n a r e h e t y P a l tw o 一 e o m P o n e n t
AT P
一
d e Pe n de n t P r o t e a s e
.
P l a n t C e l l
,
19 9 5
,
7 : 17 13 一 17 2 2
N a k a ba y a s h i K
,
I t o M
,
K iy o s u e T
,
e t a l
.
Id e n t i if e a t i o n o f e lP g e n e s
e x P r e s s e d i n s e n e s e i n g A r a b id op
s i s le a v e s
.
P l a n t C e l l P h y s io l
,
19 9 9
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4 0 : 5 0 4 ~ 5 14
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H u Y, B a o F, L i J
.
T h e P r o m o t i v e e fe
e t o f b r a s s i n o s t e r o i d s o n e e l l
d i v i s i o n i n v o l v e s a d i s ti n e t e y e D 3
一
i n d u c t i o n Pa t h w a y i n
A r a b止d op s i s
.
Pl a n t J
,
2 0 0 0
,
2 4 : 6 9 3 ~ 7 0 1
W a d s w o r rh G
,
R e d in b a u g h M
,
S c a n d a l io s J
.
A P r o e e d u r e fo r
s m a l l
一
s e ar e i s o l a t i o n o f P 1a n t RN A s u i t a b l e fo r R N A b l o t a n a 1y s i s
.
A n a l B i o c h e m
,
19 8 8
,
17 2 : 2 7 9 一2 8 3
C h u r c h G
,
G i lb e r t W
.
G e n o m i e s e q u e n e in g
.
P r o e N a t l A c a d S e i
U S A
,
19 84
,
8 1 : 19 9 1~ 19 9 5
v a n d e r Z a a l E
、
M
e m e [ i n k J
、
M
e n n e s A
,
e t a l
`
A u x in
一
in d u e e d
m R N A s Pe e i e s i n t o b a e e o e e l l e u l t u r e s
.
P l a n r M o l B i o l
, 19 87
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10 :
14 5 ~ 】5 7
胡玉欣 , 汪政科 , 王永红 , 等 . 用 c D N A 阵列鉴定拟南芥的油菜
素内醋的应答基 因 . 中国科学 , C 辑 , 20 01 , 3 6 (6) : 48 1一 4 86
L e n g Q
,
M
e r c i e r R W, aY
o
W,
e t a l
.
C l o n i n g a n d f i r s t f u n e t i o n a l
e h a r a c t e ri z a t i o n o f a P l a n t e y e l i e n u c l e o t id e
一
g a t e d e a ti o n e h a n n e l
P l a n t Ph y s i o l
,
1 99 9
,
12 1: 7 5 3一 7 6 1
Z a g o t t a W N
,
S i e g e lb a u m 5 A
.
S t r u e t u er a n d fu n e t io n o f e y e l i e
n u e l e o t id e
一
g a t e d e h a n n e l s
.
A n n u R e v N e u or s e i
,
199 6
,
19 : 23 5 一 26 3
U lm a s o v T
,
O h m i y a A
,
H a g e n G
,
e t a l
.
T he s o y b e a n G用 /4 g e n e
th a t e n c o de s a g l u t a t h i o n e s
一
t r a n s fe r a s e h a s a Pr o m o t e r rh a t 15
a c t iv a t e d by a w id e r a n g e o f e h e m ie a l a g e n t s
.
P la n t P h y s i o l
,
19 9 5
,
10 8 : 9】9 ~ 9 2 7
R Oj o E
,
T i t a r e n k o E
,
L e o n J
,
e t a l
.
R e v e r s i b l e Pr o t e i n
Ph o s Ph o r y l a t j o n r e g u l a t e s j a s m o n i e a e id
一
deP e n de n t a n d
一
in d eP e n d e n 之
w o u n d s zg n a l t r a n s d u e t io n P a t h w a y s in A ar b i j ol , 5 15 rh a l i a n a
.
P l a n t J
,
19 9 8
,
13 : 1 53 一 16 5
B a rt e l B
,
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r e n t i a l r e g u l a t i o n o f a n a u x in
一
P r o d u e i n g
n i z r i l a s e g e n e f a m il y in A r a b葱d op s i s rh a l ia n a
.
P r o c N a r l A e a d S e i
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,
19 9 4
,
9 ] : 66 4 9 ~ 6 6 5 3
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z o g u e h i T
,
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H i r a y a m a T
,
e t a l
.
A g e n e e n e o di n g a ( 20() 1
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0 3 收稿 , 2 0() 1一。一 , 收修改稿 )
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