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用cDNA阵列鉴定拟南芥油菜素内酯的应答基因



全 文 :第 1 3卷 第 6 期
中 旧 种 荃 ( c辑 )
S C N E IC N C N A E H I I( S
e r ie s C ) 2 0 0 1 年 1 2 月
用 cD N A 阵列鉴定拟南芥油菜素内醋的
应答基因 *
胡玉欣① 汪政科② 王永红① 包 方① 李 凝③
彭镇华② 李家洋① * `
(①中国科学院遗传研究所 , 北京 10 101 ; ②中国林业科学院林业研究所 , 北京 1砚洲洲)9 1 ; ③香港科技大学生物系 , 香港 )
摘要 采用 c D N A 阵列方法 , 以拟南芥油菜素内醋合成缺陷突变体 de tZ 的悬浮细胞
培养系为材料 , 对油菜素内醋的应答基因进行 了系统鉴定 . 在 1 30 0 0 个 c D N A 克隆中,
初步鉴定出 5 3 个油菜素内醋的应答克隆 . 对这些克隆的序列分析表明: 19 个克隆为新
基因 , 3个为涉及细胞分裂调控的基因 , 4 个是与逆境反应有关的基因 , 4个是参与植物细
胞信号转导分子或转录因子基因 , 3 个是涉及 R N A 拼接及结构有关的基因 . 还发现植物
其他一些生理过程基因的表达受到 了油菜素内醋的影响 , 包括光反应 、 离子运输及一些
合成酶基 因等 . 这些结果从基因表达水平说明 , 油菜素内醋影响了植物生长发育及代
谢的多个过程 .
关键词 c D N A 阵列 油菜素内醋应答基因 拟南芥
油菜素内醋 (b r a s s i n o s t e r o i d s , B R s )是由 o r o v e 等人 I’ ]发现的植物固醇类激素 . 近 3 0 年的研
究证明 , 油菜素内醋像生长素及细胞分裂素等其他植物激素一样 , 是植物生长发育不可缺少
的一种激素 , 影响植物的细胞伸长与扩展 、 细胞分裂 、 维管分化 、 衰老 、 育性及逆境反应等 12, 3 ].
近年来通过其合成突变体的研究 已经阐明了油菜素内醋在植物体内的生物合成途径 l3,4 ], 然而
对其作用的分子机制及信号转导的研究却进展缓慢 , 原 因之一就是缺乏对其所调控基因的系
统鉴定和分析 . 尽管近来已陆续发现了个别受油菜素内醋调控的基因 , 但总的来说 , 对于油菜
素内酷的应答基因仍知之甚少 , 因此也就无法从分子机制上 了解油菜素内醋的功能 . 近年来
发展起来的功能基因组研究方法如 D N A 微阵列等 , 虽已开始应用于植物有关方面的研究 5[,6 」, 但
由于种种原因 , 至今尚未有油菜素 内醋调控基因表达方面的研究报道 .
为系统鉴定油菜素内酷的应答基因 , 我们发展了一种简单有效 的以膜为支持物的 c D N A
阵列方法 17 . 采用这种方法 , 在 13 0 0 个克隆规模的阵列膜上 , 对拟南芥油菜素内醋的应答基
因进行了鉴定和分析 , 克隆了部分油菜素内醋的应答基因 , 为进一步研究油菜素内醋作用的
分子机制奠定了基础 .
1 材料与方法
L l 植物材料
拟南芥油菜素内醋合成缺陷突变体 de 1tZ 8] .
2 0 0 r

0一巧 收稿 , 2 0 0 1一 0 5一 10 收修改稿
* 国家自然科学基金 (批准号 : 3 0 0 7 0 0 7 4) 及 国家杰出青年基金 (批准号 : 3 9 5 2 5 01 7) 资助项 目
* * 联系人 , E 一m a i l : j y l i @ g e n e t i e s 沮 e . e n
中 国 科 学 ( c辑) 第 31 卷
Z L悬浮细胞系培养及激素处理
将 e d Z t种子用 7 0% 乙醇表面杀菌 3 5 ~i n m后 , 用 or % Bl ae ch 浸泡灭菌 10 一巧 m in , 无菌水
洗 3科 次 . 灭菌后的种子播于固体愈伤组织诱导培养基上 , 在 25 ℃黑暗条件下诱导愈伤组织 .
愈伤组织诱导培养基以 B S 培养基为基本成分 , 含有 4 . 5 林m o l/ L Z , 4 一 d i e h l o r o p h e n o x y a e e ti c a c i d
(2
,
4

D )
,
0
.
4 5 林m o lz L k i n e t i n (K T ) , 2 %葡萄糖及 0 . 8 %琼脂 . 将生长状态 良好的愈伤组织悬浮于
液体培养基 (B S + 4 . 5 林m o l几 2 , 4 一 D + 0 . 4 5 林m o l / L K T + 2%葡萄糖 )中 , 于弱光下在转速为 13 0
r/ m in 的摇床上建立和继代悬浮细胞系 . 每 7 d 更换新鲜培养基进行扩增培养 .
在用 24 一表油菜素内醋 (2 4 一 eP i 一 b r as s i n ol ide , B )L 处理前 , 将悬浮细胞系用无激素 B S 培养基
洗 3 次 , 继续在其中进行激素饥饿培养 48 h . 用 5 林m ol L/ B L 和等体积 D M SO( 对照 )处理悬浮
细胞 Z h , 提取 R N A 用于 c D N A 阵列探针制备 ; N or the m 杂交验证的 R N A 来 自于 5 林m ol 几 B L
处理 0 , 1 , 2 , 4 h 的细胞 .
1
.
3 c D N A 阵列
c D N A 阵列方法如文献 7[] 所述 . 高密度的单克隆 c D N A 阵列膜采用 iB o m ek ZO0 0 核酸工
作站制成 : 探针为 [a 一 32 P ]一 d e T P 标记的反转录第 l 链 : 杂交信号用 p h o s p h o i m a g e r (M o l e e u la r
D y n a m i c s
,
S u n n n y v a l e
,
C A
,
U S A )扫描后进行差异表达克隆的鉴定 .
1
.
4 R N A 提取与 N o r t h e r n 杂交
总 R N A 提取采用酸性硫氰酸肛 一苯酚 一氯仿抽提法 9[] . 取一定量悬浮系细胞于液氮中研碎 ,
经硫氰酸肌 、 酸性苯酚和氯仿抽提 , 乙醇沉淀后 , 用 LI CI 洗涤 1 次 , 再用氯仿抽提 1 次 , 总
R N A 溶于无核酸酶的水 中 , 测定 A 值 , 定量后于一20 ℃保存 .
将 巧 此 总 R N A 在甲醛变性胶中电泳后 , 转移至尼龙膜上 , 在真空烤箱中于 80 ℃烤膜 Z h
以固着 R N A , N o r t h e r n 杂交采用 e h u r e h 系统 [`0 ] , 6 5 ℃杂交 1 6一Z o h , 在常规条件下洗膜 , 用
p h o s p h o im a g e r 进行分析 .
L S 序 列分析
将差异表达克隆的 c n N A 亚克隆到 p B l u e s e r i p t 1 s K (+ )质粒上 , 于 A B I3 7 3 A 型 D N A 测
序仪 (eP kr in lE m er , u s A )上进行末端序列测定 , 并在 G en B an k 中进行 D N A 或蛋白序列 同源性
比较分析 .
2 结果分析
.2 1 油菜素内醋应答基因的鉴定
为了研究油菜素内醋作用的分子机制 , 采用我们发展的 c D N A 阵列法对油菜素内醋的应
答基因进行鉴定 . 将质粒用 iB o m ek 2 0 0 核酸工作站制成高密度的 c D N A 阵列膜 . 为了使挑选
的差异表达克隆更加可靠 , 每个克隆在膜上同时设置了 3 个重复 . 因此 , 每张膜上包含了 3 x
3 8 4 个 c D N A 克隆 . 整套膜共有 12 张 , 包含了 13 0 0 个 c D N A 克隆 . 每张膜同时制作 4 份 , 以
备多个处理或其他方面的检测之用 .
用油菜素内醋合成突变体 de tZ 的悬浮细胞培养系为材料对油菜素内醋应答基因进行检测 .
因为 de tZ 是在油菜素内醋合成初期被阻断 , 细胞内源油菜素内醋含量极低 8[] , 从而可以尽可能
地排除内源油菜素内醋的影响 . 图 l 所示为其中一张膜的 B L 处理和对照的基因表达模式 . 尽
管在处理和对照间基因的表达模式非常相似 , 但一些克隆的表达在对照和 B L 处理间明显不同 ,

中 国 科 学 ( c辑 ) 第 31 卷
参与调控了植物光反应 、 离子运输及其他一些代谢过程 .序列 比较结果还表明 , 在 N or t h er n 杂
交中不稳定的基因基本都是与光合作用有关的基因 (见第 3 节 ) .
表 l 油菜素内酷的应答基因
功能 十八 ” )
+ /一

同源基因 /蛋自 同序性 /% 注册 号
未知
耐黔93D245P毖8器与细胞分裂有关 C y e D 3M y 卜 1ik e P r o te i n
M L O Z (eY
a s t )
X 8 3 37 1
P 3 4 12 7
T 4 0 4 19
与逆境反应有关
C y e l o Ph i l i n
H s p 9 0 A (s j )
H s P 9 0 B ( 8 2 )
P u t a r i v e s t r e s s Pr o t e i n
与信 号转导有关
与 R N A 有关
脾93D85gl渊6P
其他
克隆
l9
B RR J 6
B R R万了
B R R Z ]
B R R了2
BR R I ]
B R R歹2
B R R石
BR R S
B R R Z了
B R R Z石
B R R 2 7
B R R2 2
B R R4 0
B R R多I
B R R I
B R R了
B R R I 4
B R R Z万
B R R ] 9
B R R g
BR R4 了
B R R幸夕
B R R I了
B R RZ
RVA ] D N A bi
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C C A AT b i n d i n g f a e t o r
P u t a t i v e k in a s e (eY
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G A G A t r a n s e r i Pt i o n f a e t o r
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P o l y A b i n d i n g P r o t e i n
F e r i t i n
C H L H (M g Z+ e h e l a t a s e )
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卜 a e y l一 s n 一 g l y e e r o l一 3 一 P h o s P h o r e a e y l t r a n s fe r a s e
P r o ly l e a r b o x yP e P t id a s e
A T P s v n t h a s e d e l t a s u b u n i t
U 4 0 39 9
Y 0 76 】3
Y 1 18 2 7
C A B 8 8 29 6
A B0 138 8 6
N M 0 3 15 5 3
A J 30 3 0 0 7
L 2 22 0 5
X 9 8 13 0
A J2 9】7 6 2
L 19 4 】8
A F 32 6 8 6 9
2 6 8 4 9 5
L 4 3 0 8 1
A F 36 ( ) 12 4
P 10 79 6
A F 36 0 12 4
A F 0 2 6 4 0 0
2 9 5 6 3 7
A A F 186 2 8
A A K 0 5 8 6 5
+叫
。 ) 十 , J、诱 导作用 ; 一 示抑制作用 b) D 不基因 . c ) P 示蛋 自质 . d) ?示 N or t h er n 杂交验证不稳定 的克隆
3 讨论
植物基因的差异表达是植物生长发育及对内外环境生理反应 的分子生物学基础 . 植物激
素是植物生长发育所必需的生长调节物质 , 它们通过影响特定基 因的表达而影响植物生长发
育及代谢过程 . 通过对其应答基因的鉴定可从分子机制上了解其作用机理 . 我们采用 c D N A 阵
列方法 , 对油菜素内醋的应答基 因进行了系统的鉴定 , 为进一步研究其作用机理奠定了基础 .
特别值得注意的是 , 由于我们采用油菜素内醋的合成缺陷突变体为材料 , 基本排除了内源油
菜素内酷的影响 , 使得到的油菜素内醋的应答基因中可能含有在正常植株中难于发现的基因 ,
这也为其他激素的研究提供了一个很好的范例 . 另外 , 采用悬浮细胞培养系和短处理时间也
使得到的应答基 因多为初期反应基因或调控基因 , 为进一步研究油菜素内醋的信号转导及调
控机制打下了基础 .
油菜素内醋应答基因中有 3 个与细胞分裂有关 , 这是新发现的油菜素内酷调控细胞分裂
基因 . 伪 c D 3 是一个 D 型细胞分裂蛋白基因 , 而 D 类细胞分裂蛋白已被证明通过感受外界信号
而调节细胞分裂 I” 1 . 细胞分裂素正是通过诱导 伪 c D 了 的转录表达而促进细胞分裂的 I’ 2 ] . 我们
已证 明油菜素内醋对 细胞分裂 的促进作用是通过一条独特的 yC c D 了 诱导途径实现的 l” ] .
M yb

ilk
e 蛋白实际上是一个类 c de 分子 , 它在体内的功能尚不清楚 , 可能涉及分化或其他过程 L’ 4 ] .
材乙口2 是酵母中一个与细胞分裂有关的基因 , 它的过量表达可导致酵母细胞分裂的抑制 [ ’ 5〕.
油菜素内酷能够增强植物的逆境反应 , 特别是对高温 、 低温及盐的耐受性 13] . 我们发现 4
第 6期 胡玉欣等 : 用 c A N D阵列鉴定拟南芥油菜素内醋的应答基因
个与逆境有关的基因均被油菜素内醋诱导 . 两个 H sp9 0家族成员基因 H s PS I和 H s P82 在 BL
处理以后表达量增加 , 说明油菜素内醋很可能通过影响 H sP 90 家族成员基因的表达而增强植
物对热的耐受性 l ’ “ , . 另外 , 在人和动物 中的多种类 固醇激素的细胞内受体 , 如雌激素 、 黄体
酮 、 雄激素 、 糖皮质激素的受体等 , 是一个很大的复合体 . H s p 90 不仅是其组成成分并使类固
醇激素受体保持一种活性状态的构象 , 而且还参与了类 固醇激素的信号转导 I ’ 7 J.
c cy ol hP il
n 是另一类在动植物中普遍存在 、 比较保守的伴侣蛋 白 , 主要参与蛋 白质的折叠 .
在拟南芥中已发现 7 个 伪 cl op hi il 。 基因 L’ 81 . 酵母 c yc loP hi h n 缺乏突变体 , 在正常条件下生长
正常 , 但热激后则难以存活 L’ ” ] . 玉米和大豆在热激等条件下 , 伪。 lop ih il 。 的表达量也增加 20[ } .
这些结果表明 , c yc l叩 hi h n 可能是在逆境条件下参与信号转导或蛋白折叠的一个重要蛋白质 .
我们还发现参与油菜素内醋信号转导以及转录和转录后调控的一些因子的表达发生了改
变 . RVA I是具有 A P Z 和 v PI 两个 D N A 结合位点的 D N A 结合蛋白 , 它的功能尚不清楚 12 ’ 〕
. 而
B R R 2 6 是一个推测的蛋白激酶 , 具有典型的蛋 白激酶保守区 , 说明油菜素内醋的信号转导中
有蛋 白激酶的参与 , 而 B L 对 C c A AT 结合因子以及 G A T A 转录因子的调控说明了油菜素内酷
通过转录因子调节了某些基因的表达 . 另外 , R N A h e l i e a s e , u Z s n R N P a u x i l a r y 因子以及 p o xy A
结合蛋白基因的转录改变说明油菜素内酷可能通过 R N A 的转录后水平或翻译水平对某些基因
的表达进行调控 .
油菜素内醋还被证明参与了植物 的光反应 2z[] , 在其合成 突变体 中 , 一些光合作用基因如
A st 表达发生了改变 23[ } . 我们也发现了 4 个光合作用 的基因表达受到油菜素内醋的影响 , 但它
们在 N or t h en 杂交验证中表现不稳定 , 这可能与所用的材料是培养细胞有关 . M g +2 鳌合酶是叶
绿素合成的一个关键酶 , 它催化 了 M g +2 鳌合到叶琳环中 , 有 c H LI , c H L D 和 c H L H 3个亚基 124 ! .
油菜素内醋诱导 C H L H 的表达 , 也表明油菜素内醋参与了光反应 的调节 ` 从应答基因还可以
看出油菜素内酷影响植物的离子运输以及体内的其他一些代谢过程 (AT P 合成酶等几个代谢酶
基因 ) .
对油菜素内醋应答基 因的鉴定已经为我们提供了其作用机制的线索 , 而且还有很多尚未
知功能的新基因 . 对这些基因的功能及与油菜素内酷关系的研究将进一步揭示油菜素内醋这
种植物激素对植物生长发育的调节机理 ,
致谢 感谢美 国 M i ch iga n 大学 iL J ian m ing 博士提供 de tZ 种子 , 中国科学院上海植物生理
研究所赵毓橘博士惠赠 2 4 一表油菜素内醋 ( 24 一e p i 一 b r a s s i n o l i d e , B L ) .
参 考 文 献
G r o v e M D
,
S Pe n e e r G E R o h w e d de r W K
,
e t a l
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B r a s s i n o l i d e
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N a t u r e
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2 8 1 : 2 16心 17
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A n n u R e v P l a n t P h y s i o l P l a n t
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I d e n t i if e a t i o n o f t h e SA A T g
e n e i n v o l v e d 玉n St r a w b e r r y fl a v o r bi o g e n e s i s b y
u s e o f D N A m i e r o a r a y
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P l a n t C e l l
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20 0 0
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12 : 6 4 7 ~6 6 1
4 8 6 中 国 科 学 (C 辑 ) 第 31 卷
6
7
8
9
13
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D i fe
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i n A ra b id op
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P l a n t C e l l
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P l a n t
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K h a m li e h i C
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C y t o k i n in a e t i v a t i o n o f A ar b id
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t y Pe e y e l i n
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S e i e n e e
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B a o F
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P r o m o t i v e e fe
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e D 了一 i n d u c t i o n Pa t h w a y . P l a n t J ,
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14 H i r a y a m a T, S h i n o z a k i K
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A c d e s
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Ja v e r z a t J P, C r a n s t o n G, A l l
s h i r e R C
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F i s s i o n y e a s t g e n e s w h i c h d i s r u P t m i t o t i c e h r o m o s o m e s e g r e g a t i o n w h e n
o v e r e x P r e s s e d
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N u e l A e id s R e s
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C h a u d h ar y S
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D o b i n s o n K F
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M a r i v e t J
,
F r e n d o P, B
u r k a r d G D N A s e q u e n e e a n a l y s i s o f a e y e l o Ph i l i n g e n e fr o m m a i z e : de v e l o Pm e n t a l e x P r e s s i o n a n d
r e g u l a t i o n b y s a l i e y l i e a e id
.
M
o l G e n G e n e t
,
19 9 5
,
24 7 : 22 2 一2 2 8
K a g a y a Y, O h m i y a K
,
H a t t o r i T
.
R A V I
,
a n o v e l D N A

bi n d in g P r o t e i n
,
bi n d s t o b iP a r t i t e re e o g n i t i o n s e q u e n e e t h r o u g h tw o
d i s t i n e t D N A

b i n d i n g d o m a i n s u n i q u e l y fo
u n d i n h ig h e r P l a n t
.
N u e l e i e A e id s R e s
,
] 9 9 9
.
2 7 : 4 7 0礴 7 8
N e f M M
,
N g u y e n S M
,
M
a l a n e h a r u v i l E J
,
e t a t BA S I : a g e n e er g u lat i n g b r a s s in o s t e r o id 比v e l s a n d l ig h t r e s Po n s i v e n e s s i n
A ar b iJ
口P s i s
.
P r o e N a t l A e a d S e i U S A
,
19 9 9
,
9 6 : ] 5 3 ] 6 一 15 3 2 3
C h o r y J
,
N a g P a l .P Pe t o C A
.
P h e n o t y P i e a n d g e n e t i e a n a l y s i s o f de tZ
,
a n e w m u t a n t t h a t a fe
e t s l i g h t

r e g u l a t e d s e e d l in g
d e v e i o P m e n t i n A ar b i J
口17 5 15
.
P l a n t C e l l
,
19 9 1
,
3: 4 4 5礴5 9
P a p e n b r o e k J
,
o r afe s
,
K r u s e E
,
e t a l
.
M g
Z+

c h e l a t a s e o f t o b a e e o : sd e n t i if e a t i o n o f a e h一D e D N A s e q u e n e e e n c o d i n g a t hi r d
s u bu n i t
,
a n a l y s i s o f t h e i n t e r a e t i o n o f the t h r e e s u b u n i t s w i t h t h e y e a s t tw o

h y b r i d s y s t e m
,
an d r e e o n s t i t u t i o n o f t h e e n z y m e
a c t iv i ty b y e o
·
e x P r e s s zo n o f r e e o m b in a n r C H L D
,
C H L H a n d C H L I
.
P l a n r J
, 一9 97 , 一2 : 9 8】~9 9 0