全 文 ：52 植物生理与分子生物学学报, Journal of Plant Physiology and Molecular Biology 2006, 32 (1): 52-56
2 0 0 5 -0 4 -1 1 收到，2 0 0 5 -1 2 -0 6 接受。
*通讯作者(E-mail: shqpeng@163.com; Tel: 0898-66890670)。
拟南芥肌动蛋白解聚因子4基因(AtADF4)在烟草中表达引起植株形态变化
彭世清 *，黄冬芬
中国热带农业科学院热带生物技术研究所，热带作物生物技术国家重点实验室，海口 571101
摘要：用 PCR方法从拟南芥基因组 DNA中分离克隆肌
动蛋白解聚因子基因(AtADF4), 并进行了序列分析。通过
农杆菌介导转化将AtADF4导入烟草，PCR和RT-PCR检
测证明AtADF4已整合到烟草基因组中并得到表达。转基
因烟草幼苗下胚轴的弯曲度在暗培养与光照培养条件下
均比对照的大，暗培养条件下下胚轴弯曲程度较高；下胚
轴薄壁细胞壁比对照大，维管束排列不整齐；根毛稀少弯
曲，而对照根毛密集且直；转基因烟草开花时间比对照平
均延迟了 7~8 d，花粉萌发时花粉管比对照粗短。
关键词：肌动蛋白解聚因子；ADF4；肌动蛋白；性状
中图分类号：Q7 4
肌动蛋白(actin)是真核生物细胞中普遍存在的一
种重要的蛋白质，构成细胞骨架中的微丝系统。肌
动蛋白骨架对植物高度特异化的细胞如花粉管、根
毛、叶毛和气孔保卫细胞的形态发生和功能起着重
要作用，同时在高等植物形态发生的细胞分裂和伸
长过程中起着关键的调节作用 (Kost等1999; Dong等
2001)。目前有关植物中肌动蛋白骨架的直接功能的
研究还很少(Ramachandran等 2000; Baluska 等
2001)。体外研究表明，在动物和酵母系统中肌动
蛋白骨架的功能是由大量的肌动蛋白结合蛋白控制
的。在这些蛋白中，肌动蛋白解聚因子( a c t i n -
depolymerizing factor, ADF)是F-actin的重要调节因子。
ADF通过解聚和切割肌动蛋白而调节肌动蛋白微丝
骨架的动态装配，从而调节肌动蛋白的功能
(Ayscough 1998; Bamburg 1999; McCurdy等 2001;
Smertenko等 2001)。对动物和酵母的ADF的研究已
有较多的报道，而植物 ADF的研究相对来说还很
少。拟南芥ADF1和百合 LiADF1及玉米 ZmADF3
等研究的报道，证明它们与植物形态建成相关(Jiang
等 1997; Dong等 2001; Allwood等 2002)。ADF4是
拟南芥肌动蛋白结合蛋白 ADF/cofilin家族中的一
员，到目前还未见到拟南芥 ADF4的功能的报道。
本研究利用拟南芥 ADF4基因在烟草中表达来探讨
ADF4 的功能。
1　材料与方法
1.1　材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Nicotiana
tabacum cv. K326)种子，大肠杆菌(Escherichia coli)
DH5α、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105
和载体 pBI121由本实验室保存。
1.2　拟南芥DNA的提取
参照傅荣昭等(1994)的方法进行。
1.3　拟南芥 AtADF4基因的克隆
根据拟南芥 ADF4基因的mRNA序列设计一对
引物：P1，5 ACTCTAGAATGGCAGTCCATGAT-
GACT 3；P2，5 ACGGATCCTTAGTTGACGCG-
GCTTTTC 3。以拟南芥DNA为模板，94℃预变性
3 min后加入 Taq DNA聚合酶，进行 PCR反应。反
应条件为 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35个
循环后在 72℃继续延伸 10 min。于 4℃保存。PCR
产物的克隆按 Sambrook等(1989)的方法进行，序列
测定由上海生物工程公司进行。
1.4　植物表达载体的构建
用XbaI和BamHI从分别克隆载体 pMDT-ADF4
和 pBI121进行酶切，回收目的片段和载体，然后
进行连接，鉴定按常规方法进行。构建好的植物表
达载体命名为 pBADF4。通过三亲交配将 pBADF4
导入农杆菌 EHA105。
1.5　烟草的遗传转化
采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草，最后将转
基因烟草的组培苗移入营养钵中，置于温室中培
养。
1.6　转基因植株的RT-PCR检测
烟草 RNA的提取参照傅荣昭等(1994)的方法进
53彭世清等: 拟南芥肌动蛋白解聚因子 4基因(AtADF4)在烟草中表达引起植株形态变化1期
行。反转录与 PCR反应按大连宝生物工程有限公司
产品(TaKaRa RNA PCR Kit Ver2.1)说明书进行。
1.7　转基因植株下胚轴的显微观察
取在黑暗条件生长 10 d的转基因烟草和对照烟
草下胚轴中间部位，用FAA固定液在室温下固定24
h,用乙醇 /正丁醇系列脱水，石蜡包埋，切片厚度
为 8 µm。切片经固绿染色，在 Olympus-BH2研究
显微镜下观察和照相。
2　结果
2.1　拟南芥 AtADF4基因
PCR扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分析为一
长约 500 bp的片段，PCR产物经琼脂糖电泳后回
收，插入pMD18-T载体。重组质粒经BamHI和XbaI
酶切获得约 500 bp的片段(图 1)。对重组质粒进行测
序结果表明，该片段长为 490 bp。与mRNA比较
发现在 249~339 bp有一长 91 bp的内含子(图 2)，编
码区核苷酸序列与推导的氨基酸序列与报道的同源性
为 100%，表明克隆的片段为拟南芥 AtADF4基因。
2.2　转基因烟草
以烟草栽培品种 K326为受体材料，经预培养
和与农杆菌共培养，转入含头孢霉素和卡那霉素的
筛选培基上，7 d左右在叶盘上开始出现抗性芽，而
未转化的叶盘在筛选培养基上逐渐褪绿，最后白化
死亡。待芽长到 2 cm左右时，切下并置于生根培
养基中生根，待根系发育良好以后，置于温室中进
行常规管理。从移栽成活的抗卡那霉素转化株系中
随机抽取 20株提取DNA进行PCR检测，有 14株能
扩增出长度约为 500 bp大小的特异带，未转化的烟
草再生植株无此扩增带(图 3A)。从 PCR的检测结果
可以初步证明拟南芥AtADF4基因已整合到烟草基因
组中。从 PCR检测有目的基因整合的 14株转化烟
草叶片中提取 RNA，通过 RT-PCR检测有 5株扩增
出约 400 bp的特异带，与 ADF4基因mRNA的大小
一致(图 3B)，表明 AtADF4基因在烟草中已经转录，
并通过mRNA的剪接加工切除AtADF4的内含子。将
获得的 T0转基因植株进行种植，RT-PCR检测最终
筛选获得稳定表达的转基因植株。
图 1　拟南芥AtADF4基因的PCR扩增及重组质粒的酶切鉴定
Fig.1　PCR product of AtADF4 and restriction endouncleases
digested recombinant plasmid
M: PCR markers; 1: PCR product; 2: Recombinant/BamHI+HindIII.
图 2　拟南芥 AtADF4 的DNA序列及推导的氨基酸序列
Fig.2　Nucleotide sequence of AtADF4 of the amino acids derived from it
Intron region is indicated by small letters.
54 32卷 植物生理与分子生物学学报
2.3　转基因烟草的生长发育
转基因T2代植株下胚轴无论在光照或黑暗条件
下都表现出不同程度的弯曲(图 4A)，而且根毛稀
少、粗且短，而对照根毛密集，细且长(图 4B); 对
下胚轴横切面进行显微镜观察，发现转基因 T2代烟
草下胚轴横切面部分薄壁细胞比对照大(图4C); 对T2
代烟草开花时间进行了观察，发现 T2代烟草开花时
间比对照推迟了 7~8 d，T2代烟草的花粉在萌发培养
基上培养，花粉管比对照长得粗和短(图 4D)。
3　讨论
肌动蛋白对生物正常细胞形态维持、胞质分
裂、胞质环流、细胞器运动及植物的顶端生长起着
重要的作用。一旦破坏生物体细胞肌动蛋白的动态
平衡，生物或多或少表现出形态异常。肌动蛋白行
使其生物学功能需要一系列肌动蛋白结合蛋白维持其
正常生理状态(Ayscough 1998; McCurdy等 2001)。
而肌动蛋白生理活动本身又受肌动蛋白解聚因子在内
图 3　部分转基因烟草植株的 PCR和RT-PCR检测
Fig.3　Detection of transgenic tabacco plants by PCR and RT-PCR amplication
(A) M: Marker; 1: pBADF4; 2–10: Transgenic tobacco plants; 11: Wild-type. (B) M: Marker; 1: pBADF4; 2: Wild-type; 3–9: Transgenic
tobacco plants.
图 4　转基因烟草的生长发育
Fig.4　The growth and development of the transgenic tobacco
(A) Seedings of 10-old dark- and light-grown wild-type and transgenic tobacco. (B) Root hairs of 10-old wild-type and transgenic tobacco
seedings. Bar=14 µm. (C) Microscopy analysis of etiolated hypocotyls. Specimens were taken from the central region of the hypocotyls of
10-day-old dark-grown seedlings. Bar=20 µm. (D) Microscopy Analysis of pollen tubes. Bar=27 µm.
55彭世清等: 拟南芥肌动蛋白解聚因子 4基因(AtADF4)在烟草中表达引起植株形态变化1期
众多结合蛋白的调控。肌动蛋白解聚因子解聚和切
割肌动蛋白，肌动蛋白解聚因子的过表达会破坏肌
动蛋白的动态平衡(Chen等 2002)。因此肌动蛋白动
态平衡一旦遭到破坏，就有可能影响植物正常生
长。本实验结果表明，转基因烟草与对照相比较，
ADF4在烟草的过量表达，影响根毛、下胚轴、花
粉管的正常生长，表现为根毛及下胚轴弯曲(图
4A、B)，下胚轴部分薄壁细胞变大，维管束排列
不规则(图 4C)，花粉管变短变粗(图 4D)，开花时间
延迟，叶下表皮保卫细胞开度较小(结果未示)。这
说明ADF4明显影响了转基因植株形态的改变。这
些结果与拟南芥肌动蛋白解聚因子ADF1功能相类似
(Dong等 2001)。在已知的 12个拟南芥肌动蛋白解
聚因子 A D F 中，A D F 4 与 A D F 1 的同源性最高
(Bowman等 2000)，理论上其基因功能应该相似，
试验结果正好证明了这一点。
参 考 文 献
Allwood EG, Anthony RG, Smertenko AP, Reichelt S, Drobak
BK, Doonan JH, Weeds AG, Hussey PJ (2002). Regulation
of the poolen-specific actin-depolymerzing factor LIADF.
Plant Cell 14: 2915–2927
Ayscough KR (1998). In vivo functions of actin-binding proteins.
Curr Opin Cell Biol 10: 102–111
Baluska F, Jasik J, Edelmann HG, Salajova T, Volkmann D
(2001). Latrunculin-B induced plant dwarfism: plant cell
elongation is F-actin dependent. Dev Biol 231: 113–124
Bamburg JR (1999). Proteins of the ADF/cofilin family: essential
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Bowman GD, Nodelman IM, Hong Y, Chua NH, Lindberg U,
Schutt CE (2000). A comparative structural analysis of the
ADF/Cofilin family. Proteins 15: 374–384
Chen CY, Wong EI, Vidali L, Estavillo A, Hepler PK, Wu H, Cheung
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depolymerizing factor in elongating pollen tubes. Plant Cell
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actin-depolymerizing factor with actin. Plant J 25: 203–212
56 Journal of Plant Physiology and Molecular Biology 2006, 32 (1): 52-56
Expression of an Arabidopsis Actin-Depolymerizing Factor 4 Gene
(AtADF4) in Tobacco Causes Morphological Change of Plants
PENG Shi-Qing*, HUANG Dong-Fen
State Key Laboratory of Tropical Crop Biotechnology, Institute of Tropical Biosciences and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical
Agricultural Sciences, Haikou 571101, China
Abstract: The actin-depolymerizing factor 4 gene
(ADF4) of Arabidopsis thaliana was cloned and
sequenced (Figs.1, 2). The plant expression vector
with ADF4 was constructed and transformed into
tobacco by Agrobacterium tumefaciens. Molecu-
lar identification showed that the ADF4 gene was
integrated into the genome of tobacco and ex-
pressed in transgenic tobaccos assayed by PCR and
RT-PCR (Fig.3). Expression of an Arabidopsis
thaliana ADF4 gene in tobacco resulted in mor-
phological change of plants. The effects of ADF4
on transgenic tobaccos growth were as follows: the
hypocotyls of transgenic plants were wavy, espe-
cially in darkness, whereas those of the control
were straight (Fig.4A); the root hairs of transgenic
plants were less than the control, and they were
also wavy (Fig.4B); the parenchyma cells of
transgenic plants were larger than the control and
the arrangement of vascular bundle was out of or-
der (Fig.4C); the flowering time of T2 line was at
least 7 days later than the control; the pollen tubes
of transgenic plants were shorter than those of the
control (Fig.4D).
Key words: actin-depolymerzing; ADF4; actin; morphogenesis
*Corresponding author (E-mail: shqpeng@163.com; Tel: 86-898-
66890670).