全 文 ：镉胁迫对拟南芥的毒害作用及
自噬现象的观测
高 玲 1, 2*， 张卫娜 2, 4*， 陈文利 2, 3
1. 青岛农业大学生命科学学院，山东青岛 266109；
2. 华南师范大学激光生命科学教育部重点实验室，广州 510631；
3. 华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室，广州 510631；
4. 广东省农业科学院，广州 510640
收稿日期：2011-03-23；接受日期：2011-04-29
基金项目：教育部长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0829)，广东省科技攻关项目(2007A020300008-6)，
华南师范大学激光生命科学教育部重点实验室开放课题基金项目
通讯作者：陈文利，电话：(020)85211436-8512，E-mail：chenwl@scnu.edu.cn
*并列第一作者
摘要：镉离子(Cd2+)具有强植物毒性， 可抑制植物生长， 甚至导致植物死亡。 为了研究重金属镉
对拟南芥的毒害作用， 采用叶绿素荧光技术、 流式细胞技术、 激光共聚焦技术及半定量 RT-PCR
技术， 检测光合参数的变化、 活性氧(reactive oxygen species， ROS)的累积、 自噬的发生， 以及
病原相关蛋白 （pathogenesis-related protein， PR） 基因表达的变化 。 实验结果显示 ， 随着
50 μmol/L CdCl2处理时间的延长， ROS和 Cd2+在细胞中大量积累。 而在镉胁迫的初期， 会观察
到自噬的发生及 PR 基因表达的变化。 说明植物受到外界 Cd2+作用的初期， 会通过自噬及增强
PR 基因表达来抵抗外界胁迫。 但随着处理时间的延长， 植物细胞内累积了大量的 ROS 和 Cd2+，
当植物不足以通过自噬途径抵抗胁迫时， 就会导致生长受阻， 最终对光合系统造成损伤。
关键词：镉； 活性氧； 自噬； 叶绿素荧光； 流式细胞技术
中图分类号：Q945， Q947
DOI：10.3724/SP.J.1260.2011.00676
引 言
近年来，工业、矿业生产中产生的大量重金属被释放到环境中，镉 (Cd) 即是其中之
一。大量研究表明，镉是环境中的主要重金属污染源，是对植物毒性最强的元素之一。镉
毒害同其它逆境一样，主要伤害机制之一是影响植物体内活性氧 (reactive oxygen species，
ROS) 和自由基的代谢平衡，引起 ROS和自由基的积累，产生膜脂过氧化作用，导致植物
的中毒甚至死亡[1]。植物体内的超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD) 和过氧化氧
酶 (catalase，CAT) 等保护酶对 ROS及自由基的清除能力，是决定其逆境抗性的重要因素
之一[2]。镉胁迫成为各种生物面临的一种新挑战。植物和藻类细胞虽然可以耐受一定量的镉
胁迫[3]，但过量的镉会直接或间接地抑制植物体的生理过程，如呼吸作用、光合作用和氮代
生物物理学报 2011年 8月 第 27卷 第 8期:
ACTA BIOPHYSICA SINICA Vol.27 No.8 Aug. 2011:
676-686
676-686www.cjb.org.cn研究论文 / Research Article
676
www.cjb.org.cn｜ACTA BIOPHYSICA SINICA
高玲等：镉胁迫对拟南芥的毒害作用及自噬现象的观测 研究论文 / Research Article
谢等，导致植物生长受阻[4]。进入土壤的 Cd2+通常具有较高的生物有效性，易被植物的根系
吸收并向籽实迁移，然后通过食物链进入人体, 从而对人类的生命健康构成威胁[5]。当植物
吸收过量的 Cd2+时，会诱导植物产生一系列可见的表形特征[6]。早期研究发现，Cd2+影响植
物的光系统Ⅱ (photosystem Ⅱ，PSⅡ)，并导致其在叶绿体中电子传递的解偶联 [7]，促使
ROS的产生及基因表达的变化。在分子水平，镉能够影响巯基 (-SH) 和金属鳌合键的形成
与分离、蛋白质的二级结构和细胞内氧化还原状态的改变，还会影响植物对其生长所必须
的金属元素的吸收、转移和代谢[8]。另外，在生物体内，镉能使在氧化还原或电子转移过程
中发挥重要作用的金属蛋白质发生毒化，致使自由基增多，导致蛋白质、脂类及其它生物
分子发生非特异性破坏[9]。但目前对于镉胁迫引起植物细胞死亡的机制依然不明。本实验以
外施 CdCl2作为影响因子，采用叶绿素荧光技术、流式细胞技术、激光共聚焦技术及半定
量 RT-PCR技术，在 CdCl2溶液处理的不同时间点，检测拟南芥生长及其光合参数的变化、
ROS的积累、自噬的发生，以及相关基因的表达情况，为监测重金属胁迫对植物的损伤作用
提供简单便捷的方法，同时为揭示植物对 Cd2+的响应机理提供实验依据。
材料和方法
拟南芥的培养和原生质体的分离
拟南芥种子哥伦比亚野生型和突变体 atg2 (购买于 The Nottingham Arabidopsis Stock
Centre，由于 ATG2基因的缺失，突变体不能发生自噬现象，且正常生长条件下也会表现出
早衰现象 )，经 1%次氯酸钠溶液表面消毒后，用无菌水浸泡，置于 4℃冰箱低温春化
处理 3 d。播种后在人工培养室培养，培养条件为 16 h 光照、8 h 黑暗，光照强度
120 μmol/L·m2·s，温度 22℃，相对湿度 82%。待幼苗长至 28～35 d左右时，取大小均一、
生长一致的植株进行相关实验[10]。
提取原生质体时，用锋利的刀片将拟南芥叶片切割成 0.5～1 mm 的长条。将大约 10～
20个叶片溶解于 5～10 ml的酶解液 〔1%～1.5%纤维素酶 R10 (Yakult Honsha，Tokyo，
Japan)， 0.2%～0.4%离析酶 R10 (Yakult Honsha，Tokyo， Japan)， 0.4 mol/L 甘露醇，
20 mmol/L KCl，20 mmol/L MES (pH 5.7)，10 mmol/L CaCl2〕中，抽真空 20～30 min后，
置于黑暗中继续酶解 3 h。用孔径为 35～75 μm 的尼龙网过滤，加 W5 溶液 〔2 mmol/L
MES (pH 5.7)，154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl〕，使细胞悬浮，100 g
离心力下离心 3 min，重复离心三次，将下层原生质体小心地悬浮于W5溶液中，悬浮浓度
1～2×105 /mL[11,12]。每组实验重复三次。
实验方法
叶绿素荧光参数的测量
应用 Imaging-PAM便携式叶绿素荧光仪 (Walz，Germany)，测定不同实验组叶片的叶
绿素荧光参数。测定前，将叶片放置到 Imaging-PAM型荧光仪匹配的暗适应夹中适应 25～
30 min。测定时，将拟南芥的叶片放置到样品室，打开检测光 (0.1 μmol/m2·s)，测定初始荧
光 (Fo)；然后照射饱和脉冲光 (3000 μmol/m2·s)，每 2.5 s 1个脉冲，测定最大光化学效率
677
ACTA BIOPHYSICA SINICA｜Vol.27 No.8｜Aug. 2011
生物物理学报 2011年 第 27卷 第 8期研究论文 / Research Article
(Fv/Fm)；打开内源光化光 (336 μmol/m2·s)，至稳态后照射远红外光，测定非光化学淬灭
(non-photochemical quenching, NPQ) 等参数。
激光共聚焦扫描显微成像观察
利用激光共聚焦扫描显微镜 (LSM 510及 LSM 510 META) 进行显微观察。使用氩离
子激光器，LTG (LysoTracker@ Green DND-26，用于自噬小体的检测 ) [13]和 LeadmiumTM
Green AM dye (用于 Cd2+的检测) (MolecularProbes，Invitrogen，Calsbad，CA，USA)[14]的
荧光用 488 nm的激发光激发，选择合适的分色镜后，通过 500～550 nm 的带通滤光片探
测；叶绿体自发荧光的激发波长为 488 nm，使用 650 nm的长通滤光片接收。物镜为 100倍
的油镜。图片使用 Zeiss Rel 3软件处理。将叶片和提取好的原生质体悬浮于细胞培养皿
(悬浮浓度 2×105原生质体 /mL) 并用荧光染料孵育染色后，置于黑暗处 20 min，然后用
50 μmol/L CdCl2溶液处理 2 h，置于共聚焦显微镜下观察。
流式细胞技术分析活性氧的变化
提取的原生质体经W5反复洗涤三次后，加入荧光染料 2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酯
(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2DCFDA)(终浓度为 5 mmol/L)，于黑暗中静置染
色 10～15 min，再加入 50 μmol/L CdCl2溶液处理不同的时间，用流式细胞仪 FACSCanto
Ⅱ cytofluorimeter (Becton Dickinson，Mountain View，CA，USA) 观察活性氧的变化。激
发波长为 488 nm。
RNA的提取及半定量 RT-PCR
选取 3周大小的拟南芥植株，用 CdCl2处理一定时间后提取总 RNA，然后根据其 OD260
确定 RNA浓度。根据说明书 The SuperScript Ⅱ First-Strand Synthesis System for RT-PCR
(Invitrogen) 反转录合成第一链 cDNA后，进行半定量 RT-PCR实验[15]。引物设计见表 1。
Gene Primer sequence Fragment length (bp)
ACTIN
PR1
PR2
5- AACGATTCCTGGACCTGCCTCATCATACTC-3
5- AGAGATTCAGATGCCCAGAAGTCTTGTTCC-3
5-CGTCTTTGTAGCTCTTGTAGGTGCTCTTGTTC-3
5-GTATGGCTTCTCGTTCACATAATTCCCACGAG-3
5-ATGTCTGAATCAAGGAGCTTAGCCTCACCACC-3
5-GTTGAAATTAACTTCATACTTAGACTGTCGATCTGG-3
353
451
1017
表 1 文章中用到的引物序列
Table 1 The primers used in this paper
数据分析
结果为重复三次的实验数据，采用 Microcal Origin 6.0绘图软件和 SPSS 11.5统计分
析软件进行数据分析。
结果与分析
镉胁迫对拟南芥生长及其叶绿素荧光参数的影响
50 μmol/L CdCl2对野生型拟南芥植株生长及其叶绿素荧光参数的影响如图 1所示。
678
www.cjb.org.cn｜ACTA BIOPHYSICA SINICA
高玲等：镉胁迫对拟南芥的毒害作用及自噬现象的观测 研究论文 / Research Article
高浓度的 Cd2+造成植物生长受阻，并表现出植株生长缓慢、植株矮小、叶片褪绿等中
毒症状，严重影响作物产量与质量，甚至会导致植物的死亡[11]。分别用 50 μmol/L的 CdCl2
溶液浇灌处理拟南芥植株 5、10和 15 d，最后同时采撷样品进行实验观察，发现处理不同
时间的拟南芥，其地上部分及根长都有很大的差异。从图中可以明显看出，进行 CdCl2处
理后，虽然是在营养土中生长相同的时间后取材，但处理 5和 10 d的植株与对照相比，其
根长和地上部分的生长均受到抑制。随着作用时间的延长，植物根的生长受到显著抑制，
叶片生长缓慢且逐渐变黄 (图 1A)。很显然，CdCl2溶液处理对拟南芥的生长有非常强的负
面效应。
其次，CdCl2胁迫后，荧光参数 Fv/Fm显著降低，Fo上升，而 NPQ呈现出先上升后下
降的趋势 (图 1B～D)。Fv/Fm表示 PSⅡ的最大光化学量子产量，即 PSⅡ的原初光能转换效
率，被用作表征环境胁迫程度的指标和探针[16]。经过 15 d的 CdCl2处理，Fv/Fm从 0.806±
0.006下降到 0.727±0.007 (P<0.05)，图 1C表明，Cd2+使 PSⅡ反应中心受损，抑制光合作用
的原初反应，阻碍光合电子传递的过程。而 PSⅡ失活或被破坏，则导致初始荧光 Fo的升
高，Fo是 PSⅡ全部开放时的荧光水平[17]。NPQ即非光化学淬灭，反映的是 PSⅡ吸收的光
能不能用于光合电子传递、而以热的形式耗散掉的部分[18,19]。CdCl2分别处理 0、5和 15 d
时，NPQ先上升后逐渐下降 (0.483±0.002→0.497±0.002→0.472±0.001) (图 1D)。非光化学淬
679
ACTA BIOPHYSICA SINICA｜Vol.27 No.8｜Aug. 2011
生物物理学报 2011年 第 27卷 第 8期研究论文 / Research Article
灭是一种自我保护机制，对光合机构起一定的保护作用，是植物对逆境抗性的表现[18]。为
了探讨镉胁迫初期 PSⅡ受损是否与 ROS产生有关，我们对拟南芥原生质体在镉胁迫初期
的 Cd2+和 ROS积累情况进行了观测。
Cd2+和 ROS的检测
在野生型拟南芥中，Cd2+和 ROS的测定结果如图 2所示。
680
www.cjb.org.cn｜ACTA BIOPHYSICA SINICA
高玲等：镉胁迫对拟南芥的毒害作用及自噬现象的观测 研究论文 / Research Article
表 2 镉胁迫的拟南芥鲜重、干重和根长的测定结果
Table 2 Detection of fresh weight, dry weight and root length under the treatment of CdCl2
Group
Wild type atg2
Fresh weight Dry weight Root length Fresh weight Dry weight Root length
15 d Control
5 d CdCl2
10 d CdCl2
15 d CdCl2
0.72±0.01
0.58±0.05
0.35±0.07
0.24±0.04
0.056±0.007
0.034±0.001
0.028±0.006
0.017±0.005
2.61±0.18
2.04±0.33
1.56±0.21
1.32±0.30
0.71±0.05
0.46±0.03
0.21±0.16
0.18±0.16
0.043±0.003
0.029±0.005
0.026±0.007
0.019±0.003
2.31±0.25
1.75±0.19
1.32±0.25
0.96±0.17
Cd2+进入植物体内后，有一个不断累积的过程。从图 2A可以发现，随着 CdCl2处理拟
南芥原生质体时间的延长，进入细胞内的 Cd2+不断增加。当 CdCl2处理原生质体 80 min
时，可以明显观察到细胞内绿色荧光的聚集；处理 110 min时，细胞内的绿色荧光达到最
亮，且此时细胞部分破损 (图 2A)；继续观察发现，当处理时间为 120 min时，细胞内的绿
色荧光基本不变。上述结果说明，随着 CdCl2处理时间的延长，细胞内的 Cd2+是不断累积
的。但是，细胞结构破损后，绿色荧光基本不再改变 (图 2A)，说明细胞内 Cd2+的累积可能
与细胞的完整性有关。同时，Cd2+还会诱导细胞内 ROS的产生和积累。
适量的 ROS可诱导植物逆境响应信号的转导，从而使植物避免逆境伤害，但过量的
ROS会直接造成 DNA损伤和细胞死亡。关于这一点，我们以前已有报道[11]。如图 2B所
示，通过流式细胞技术，我们也得出同样的结论。伴随 CdCl2处理时间的延长，二氯荧光
素 (dichlorofluorescein，DCF) 的荧光强度逐渐上升，但是处理后的前 30 min，处理组和对
照组的 DCF荧光强度并没有明显差异。经 90 min CdCl2处理的原生质体，其 DCF荧光强
度大约是对照组的 10倍，而不经 CdCl2处理的原生质体并没有大量 ROS的产生。当 CdCl2
处理时间为 110和 120 min时，细胞内 DCF荧光强度的比值变化不大，分别为 78.9%和
79.3% (P<0.05)。可以推测，Cd2+诱导的 ROS的累积可能参与了 Cd2+诱导的植物生长的异
常。ROS的过量积累，很可能是造成拟南芥根的生长受抑制，以及植株矮小且叶片逐渐变
黄的主要原因之一。
镉胁迫初期拟南芥的抗镉机制——自噬的发生
镉胁迫下的野生型和 atg2突变体中，干重、鲜重和根长的测定值见表 2，自噬结构的
测定结果如图 3所示。
镉胁迫对植物的生长有一定的影响作用。我们用野生型拟南芥和突变体 atg2拟南芥为
材料，进行干重、鲜重和根长的测定 (表 2)。与对照组相比，用 50 μmol/L CdCl2溶液浇灌
处理的植株，其鲜重、干重和根长都随着处理时间的延长而减少，说明 50 μmol/L的 CdCl2
对拟南芥的生长有抑制作用。实验还发现，当 CdCl2处理相同时间时，突变体 atg2拟南芥
受胁迫程度较野生型拟南芥更严重。我们推测可能与植物本身的基因有关。其次，我们以
前的文章[11]已报道，镉胁迫可引起细胞死亡。目前，自噬性死亡途径是研究的热点，于是，
我们观察了镉胁迫初期自噬体的产生情况 (图 3A)。自噬广泛存在于正常的生理过程中，是
以细胞质空泡化为特征的溶酶体依赖性的降解途径，如清除细胞废物、结构重建、生长分
化等，同时又是细胞对不良环境的一种防御机制，如对抗营养缺乏、电离辐射等。但是，
681
ACTA BIOPHYSICA SINICA｜Vol.27 No.8｜Aug. 2011
生物物理学报 2011年 第 27卷 第 8期研究论文 / Research Article
图 4 在镉胁迫下，野生型(WT)和 atg2突变体中基因表达
变化的测定 50 μmol/L CdCl2处理 3周大小的拟南芥 1、2
和 3 h后，提取总 RNA进行半定量 RT-PCR的实验结果
Fig.4 The change of gene expression in wild type
(WT) and the mutant atg2 Arabidopsis under CdCl2
stress The 3-week-old healthy WT and atg2 Arabidopsis
thaliana plants were soaked in 50 μmol/L CdCl2 for 1, 2
and 3 h respectively, then extracted total RNA for semi-
quantitative RT-PCR
图 3 镉胁迫下野生型(WT)和 atg2突变体中自噬结构的测定 (A) 野生型和 atg2突变体中，应用 LTG染料对
CdCl2诱导的自噬结构的测定。CdCl2处理野生型和 atg2突变体 2 h后，薄壁组织细胞中 LTG标记的自噬结构。
LTG绿色荧光与叶绿体红色荧光相叠合。标尺为 50 μm。图片是典型的实验图。(B) 野生型和 atg2突变体中自噬
结构的测定。实验数据都是 3组重复实验的平均值
Fig.3 Autophagosome-related structures in wild type (WT) and atg2 Arabidopsis under CdCl2 stress
(A) Autophagy induction in Cd-stressed Arabidopsis. LysoTracker Green (LTG) staining of autophagosomal-like
structures in leaves of WT plants and atg2 plants. LTG-derived fluorescence was apparent in palisade parenchyma
cells after 2 h Cd-stressed WT and atg2 leaves. Green channel images of LTG-derived fluorescence are
superimposed with red autofluorescence of chloroplasts. Scale bars = 50 μm. Pictures represent typical example.
(B) Detection of autophagosome-related structures in WT and atg2 Arabidopsis under CdCl2 stress. Each value is
the mean±SD of three replicates
无论是自噬过度还是自噬不足，都可能导致细胞生长不正常[20]。当 50 μmol/L CdCl2浸泡植
物叶片 2 h时，野生型拟南芥中有大量自噬小体出现，而自噬缺失突变体 atg2中则没有 (图
3A)。数据分析显示，经 CdCl2处理后，野生型拟南芥的自噬小体数与对照相比明显增加，
而 atg2突变体则无明显变化 (图 3B)，说明在镉胁迫下，植物干重、鲜重和根长的变化可能
与自噬的发生有关。拟南芥受镉胁迫的初期，野生型拟南芥可以通过自噬来抵抗 Cd2+的毒
害作用，而突变体 atg2则不会发生自噬，所以其生长受到的抑制较野生型拟南芥严重。
镉胁迫对拟南芥抗性相关基因表达的影响
在镉胁迫下，野生型和 atg2突变体中基因表达的变化情况如图 4所示。
682
www.cjb.org.cn｜ACTA BIOPHYSICA SINICA
高玲等：镉胁迫对拟南芥的毒害作用及自噬现象的观测 研究论文 / Research Article
重金属镉进入植物体后，会引起植物基因表达的变化。已有研究表明，病原相关
(pathogenesis-related，PR) 家族蛋白的诱导表达是重金属胁迫的典型特征之一。PR蛋白的
表达有助于植物产生防御反应，包括防止一些重金属的初级和次级效应[21,22]。PR1超表达的
植株，除了对细菌性病原体等生物胁迫有防御反应外，还对重金属 (如 Cd2+和 Hg2+) 有较强
的抗性[23]。因此，我们对 PR1和 PR2基因的表达进行了分析。实验结果表明，与对照组相
比，50 μmol/L的 CdCl2浸泡处理 2 h后，野生型和 atg2拟南芥的 PR1和 PR2均有明显的增
加，且在野生型拟南芥中表达更为显著 (图 4)。由于 PR基因表达的增强，可能使得野生型
拟南芥对重金属镉的耐性增强，说明基因表达与植物对重金属的抵抗能力有关。在野生型
拟南芥植株中，PR1和 PR2的表达随处理时间的延长而增强；而在突变体 atg2中，PR1和
PR2的表达在 CdCl2处理 2 h时增强，但是继续延长处理时间，PR1和 PR2的表达又降低。
说明 50 μmol/L的 CdCl2浸泡处理，对 atg2突变体造成的损伤比较严重，其基因表达受到
严重影响，而 CdCl2对野生型拟南芥的毒害作用比较弱。我们推测，以上结果的出现可能
与自噬的发生有关。突变体 atg2由于缺少 ATG2基因而使得自噬无法正常进行，从而减弱
对外界胁迫的抵抗能力。
讨 论
叶绿素荧光与光合作用中的各个反应过程紧密相关，是研究植物光合生理状况及植物
与逆境胁迫关系的理想探针[24]，对其的观测可作为分析植物光合功能的重要手段，逆境对
光合作用过程的影响可通过体内叶绿素荧光诱导动力学变化反映出来。通过对各种荧光参
数的分析，可以得到有关光能利用途径的信息。叶绿素荧光法具有简单、快速、准确的优
点[25]。Fo的增加 (图 1B) 可能是由于拟南芥叶片的 PSⅡ反应中心出现了可逆的失活或不易
逆转的破坏。Fv/Fm反映了 PSⅡ的原初光能转化效率，是最常使用的参数，在正常生理状
态下，Fv/Fm比较稳定，但植物受到胁迫后，Fv/Fm将下降，因此，它是说明植物生长环境
良好与否的一个重要参数[18]，并可在植物受到胁迫较短的时间内反映出外界胁迫对光合机
构的伤害。Fv/Fm有明显下降，说明在镉胁迫下，开放的 PSⅡ反应中心数量减少，关闭的
反应中心增多，从而使拟南芥的光合活性下降 (图 1C)。NPQ反映的是 PSⅡ天线色素吸收
的、不能用于光合电子传递而以热形式耗散掉的光能部分，这是一种自我保护机制，对光
合机构起一定的保护作用。本实验中，Cd2+使拟南芥的 NPQ最终下降，说明 Cd2+的累积浓
度超过拟南芥的耐受能力，使得热耗散系统受到了不可逆的损伤，因而无法通过热耗散来
减轻植物受到的伤害 (图 1D)。我们推测，NPQ的增加主要是因为 SOD等保护酶的活性受
到抑制，当酶促活性氧系统不足以清除植物体内的大量 ROS时，ROS分子便开始攻击光反
应中心，光合色素分解加快，反应中心色素分子数量减少，光能吸收降低，NPQ上升，引
起光化学效率的下降，对拟南芥本身是一种保护作用。随后，NPQ又开始下降，说明 Cd2+
的累积浓度超过拟南芥的耐受能力，植物受损程度增强。综合以上，我们得出结论：提高
非光化学淬灭，耗散过剩能量，可以避免光合机构遭到破坏。
自噬是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性的降解途径，在饥饿环境条件下，
可以调节细胞内蛋白质和细胞器降解的过程，通过平衡细胞合成和分解代谢来稳定细胞内
683
ACTA BIOPHYSICA SINICA｜Vol.27 No.8｜Aug. 2011
生物物理学报 2011年 第 27卷 第 8期研究论文 / Research Article
1. Huang YS, Luo GH, Kwan KM Frances. Peroxidation
damage of oxygen free radicals induced by cadmium to
plant. Acta Bot Sin, 1997, 39: 522~526
2. Hendny GAF, Baker AJM, Wart CFE. Cadmium tolerance
and toxicity, oxygen radical proceses and molecular
damage in cadmium-tolerance and cadmium-sensitive
clones of Holcus lanatus L. Acta Bot Neerl, 1992, 41:
271~281
3. Di Toppi LS, Gabbrielli R. Response to cadmium in higher
plants. Environ Exp Bot, 1999, 41: 105~130
4. Pál M, Horváth E, Janda T, Páldi E, Szalai G.
Physiological changes and defense mechanisms induced
by cadmium stress in maize. J Plant Nutr Soil Sci, 2006,
169: 239~246
5. Liu J, Liao BH, Zhou H, Zhang Y, Zeng M, Huang YX,
Zeng QR. Main characteristics of physiological-ecological
dynamics of soybean during the growth cycle under Cd
stress. Acta Ecol Sin, 2010, 30: 333~340
6. Kahle H. Response of roots of trees to heavy metals.
Environ Exp Bot, 1993, 33: 99~119
7. Mohanty N, Mohanty P. Cation effect on primary processes
of photosynthesis. In: Singh R, Sawhney SK (Ed).
Advances in frontier areas of plant biochemistry. New
Delhi: Prentice-Hall of India, 1988. 1~18
8. Sandalio LM, Dalurzo HC, Gomez M, Romero-Puertas MC,
del Rio LA. Aadmium induced changes in the growth and
oxidative metabolism of pea plant. J Exp Bot, 2001, 52:
2115~2126
9. Schutzendubel A, Schwanz P, Teichmann T, Gross K,
Langenfeld-Heyserk R, Godbold DL, Polle A. Cadmium
induced changes in antioxidative system, hydrogen peroxide
content, and differentiation in Scots pine roots. Plant
Physiol, 2001, 127(3): 887~898
10. Zhang LR，Xing D．Methyl jasmonate induces production
of reactive oxygen species and alterations in mitochondrial
dynamics that precede photosynthetic dysfunction and
subsequent cell death. Plant Cell Physiol, 2008, 49:
1092~1111
参考文献：
环境，维持细胞的存活[26]。细胞在缺乏营养和能量供应时，部分细胞质与细胞器被包裹进
双层膜或者多层膜结构的自噬体中，形成的自噬体再与溶酶体融合成自噬溶酶体，胞质和
细胞器成分在这里被降解为核苷酸、氨基酸、游离脂肪酸等小分子物质[27]。自噬作为细胞
生存的一种机制，在很多生理过程 (如清除损伤和衰老细胞器及冗余蛋白质) 中发挥着重要
作用[28]。除营养和能量缺乏外，氧化应激、感染以及蛋白质大量聚集等因素，也可以诱导
细胞发生自噬[29]。通过自噬，细胞可以在饥饿条件下存活数天甚至数周。实验发现，自噬
的发生使得野生型拟南芥抵抗重金属的耐性增强 (图 3)。我们推测，Cd2+诱导的自噬在初期
可以作为植物的防御机制抵抗镉的毒害作用，但是，当 Cd2+积累的程度超过植物的耐受性，
就会影响植物生长并且最终导致其死亡。
有研究表明，植物受到病原菌和外源胁迫时，会发生基因表达的变化，从而导致特殊
蛋白质的合成。大部分可诱导的蛋白质是 PR家族蛋白，当植物受到病原菌侵染或非生物胁
迫时，这类蛋白会在体内大量诱导表达或累积[30]。PR家族蛋白的诱导也是重金属胁迫的典
型特征之一。PR1超表达的植株，除了对细菌性病原体等生物胁迫有防御反应外，还对重
金属 (如 Cd2+和 Hg2+) 有较强的抗性[23]。我们的实验也表明，在野生型拟南芥中，PR基因
表达增强，使植物抵抗重金属胁迫的抗性增加 (图 4)，而 atg2突变体由于不能发生自噬，
缺少一道防线，因而容易受到重金属胁迫。
本实验发现，在植物受 Cd2+毒害的过程中，ROS的累积和 Cd2+的聚集是时间依赖的，
随着 CdCl2处理时间的延长，ROS和 Cd2+不断增加。Cd2+毒害导致植物生长受阻，产生大
量的 ROS，影响植物的光合作用。我们在实验中还发现，镉胁迫初期，植物会发生自噬并
诱导特定蛋白的表达。在胁迫初期，自噬作为细胞的一种防御机制，对细胞的生存起着积
极的作用，PR基因表达的增强对植物抵抗重金属胁迫也有正面效应。但是，植物通过自噬
抵抗镉胁迫的具体机制目前还不清楚，有待于我们进一步研究证实。
684
www.cjb.org.cn｜ACTA BIOPHYSICA SINICA
高玲等：镉胁迫对拟南芥的毒害作用及自噬现象的观测 研究论文 / Research Article
11. Bi YH, Chen WL, Zhang WN, Zhou Q, Yun LJ, Xing D.
Production of reactive oxygen species, impairment of
photosynthetic function and dynamic changes in
mitochondria are early events in cadmium induced cell
death in Arabidopsis thaliana. Biol Cell, 2009, 101:
629~643
12. Gao CJ, Xing D, Li LL, Zhang LR. Implication of reactive
oxygen species and mitochondrial dysfunction in the early
stages of plant programmed cell death induced by
ultraviolet-C overexposure. Planta, 2008, 227: 755~767
13. Moriyasu Y, Hattori M, Jauh GY, Rogers JC. Alpha
tonoplast intrinsic protein is specifically associated with
vacuole membrane involved in an autophagic process.
Plant Cell Physiol, 2003, 44(8): 795~802
14. Liu Y, Schiff M, Czymmek K, Tallóczy Z, Levine B,
Dinesh-Kumar SP. Autophagy regulates programmed cell
death during the plant innate immune response. Cell, 2005,
121: 567~577
15. Li Z, Xing D. Mechanistic study of mitochondria-dependent
programmed cell death induced by aluminium phytotoxicity
using fluorescence techniques. J Exp Bot, 2010, 62:
331~343
16. Krause GH, Weis E. Chlorophyll fluorescence and
photosynthesis: The basics. Annu Rev Plant Physiol Plant
Mol Biol, 1991, 43: 313~349
17. Demming B, Bjorkman O. Comparison of the effect
of excessive light on chlorophyll fluorescence (77K) and
photon yield of O2 evolution in leaves of higher plants.
Planta, 1987, 171: 171~184
18. Zhang SR. A discussion on chlorophyll fluorescence
kinetics parameters and their significance. Chin Bull Bot,
1999, 16: 444~448
19. Lin F, Gu ZL, Qin ZH. Autophagy and its roles played on
cell metabolism and diseases. Prog Biochem Biophys,
2005, 32: 298~303
20. Ye Q, Zheng MH. Molecular mechanism of autophagy
associated with diseases. Int J Pathol Clin Med, 2007,
27(4): 358~362
21. Jonak C, Nakagami H, Hirt H. Heavy metal stress.
Activation of distinct mitogen-activated protein kinase
pathways by copper and cadmium. Plant Physiol, 2004,
136: 3276~3283
22. Maksymiec W. Signaling responses in plants to heavy
metal stress. Acta Physiol Plant, 2007, 29: 177~187
23. Sarowar S, Kim YJ, Kim EN，Kim KD, Hwang BK,
Islam R, Shin JS. Overexpression of a pepper basic
pathogenesis-related protein 1 gene in tobacco plants
enhances resistance to heavy metal and pathogen
stresses. Plant Cell Rep, 2005: 216~224
24. Li Z, Xing D. Application of noninvasive optical techniques
in the study of aluminum toxicity to higher plants. Aata
Laser Biol Sin, 2009, 18: 275~280
25. Chen YP, Chen YN, Xu CC, Li WH, Fu AH. Effects of
groundwater depth on the gas exchange and chlorophyll
fluorescence of Populus euphratica in the lower reaches of
Tarim River. Acta Ecol Sin, 2011, 31(2): 344~353
26. Zhang SL, Tang H. Autophagy: TypeⅡ programmed cell
death. Prog Biochem Biophys, 2005, 32: 1011~1015
27. Pfeifer U. Morphologische and funktionelle aspekte der
cellul覿ren autophagie. Acta Morphol Acad Sci Hung, 1972,
20: 247~267
28. Terman A, Gustafsson B, Brunk UT. Autophagy, organelles
and ageing. J Pathol, 2007, 211: 134~143
29. Levine B, Klionsky DJ. Development by self-digestion:
Molecular mechanisms and biological functions of
autophagy. Dev Cell, 2004, 6: 463~477
30. Kim YJ, Hwang BK. Pepper gene encoding a basic
pathogenesis-related 1 protein is pathogen and ethylene
inducible. Physiol Plant, 2000, 108: 51~60
685
ACTA BIOPHYSICA SINICA｜Vol.27 No.8｜Aug. 2011
生物物理学报 2011年 第 27卷 第 8期研究论文 / Research Article
Cadmium Toxicity and Autophagy in Arabidopsis
Seedlings
GAO Ling1,2*, ZHANG Weina2,4*, CHEN Wenli2,3
1. College of Life Science, Qingdao Agricultural University, Qingdao, Shandong 266109, China;
2．MOE Key Laboratory of Laser Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China;
3．College of Life Science, South China Normal University, Guangdong Key Lab of Biotechnology for Plant Development,
Guangzhou 510631, China;
4. Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China
This work was supported by grants from the Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University
(IRT0829), the Chinese Science and Technology Foundation of Guangdong Province (2007A020300008-6), the opening project of
MOE Key Laboratory of Laser Life Science, South China Normal University
Received: Mar 23, 2011 Accepted: Apr 29, 2011
Corresponding author: CHEN Wenli, Tel: +86(20)85211436-8512, E-mail: chenwl@scnu.edu.cn
*These authors contributed equally to this work
Abstract: Cadmium (Cd), a strongly phytotoxic heavy metal, inhibits plant growth and even leads to plant
death. In order to study the toxicity of Cd2+ to photosynthesis, accumulation of reactive oxygen species
(ROS), autophagy and expression of pathogenesis-related protein (PR) were investigated using chlorophyll
fluorescence, flow cytometry, laser confocal scan microscopy and semi-quantitative RT-PCR technology. Data
showed that Cd2+ could result in accumulation of ROS and Cd2+. Autophagy and enhanced PR gene
expression during early stage of Cd-stress were found. Above all, when Arabidopsis seedlings encountered
the outside stress, they would protect themselves by autophagy and enhanced PR gene expression.
However, with the processing time of Cd2+ treatment, a lot of ROS and Cd2+ accumulated in cells were
detected. The inhibition of growth even injury to photosynthesis would be followed when the plants were
unable to self-protect through autophagy.
Key Words: Cadmium; Reactive oxygen species; Autophagy; Chlorophyll fluorescence; Flow cytometry
DOI: 10.3724/SP.J.1260.2011.00676
686