全 文 ：
园艺学报 Acta Horticulturae Sinica，doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2016-0615
铁皮石斛 DoCDPK 基因的克隆与表达分析
盛 况， 高燕会*， 斯金平，朱玉球
（浙江农林大学，亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江省铁皮石斛产业技术创新能战略联盟，浙江临安
311300）

摘 要：利用 RACE 技术和 RT-PCR 相结合，从铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）中克隆得到长
度为 1 863 bp 和 1 729 bp 的钙依赖蛋白激酶（CDPK，calcium-dependent protein kinase）基因 DoCDPK1 与 DoCDPK2
的 cDNA 全长序列，开放阅读框分别为 1 539 bp 和 1 536 bp，编码 512 和 511 个氨基酸，编码蛋白表现为亲水性，
结构稳定，二级结构主要由 α–螺旋和无规卷曲构成。qRT-PCR 分析结果表明 DoCDPK1 和 DoCDPK2 主要在铁皮石
斛叶片中表达；低温和 NaCl 处理后，DoCDPK1 和 DoCDPK2 在各个时间点上的表达量有不同程度提高，；而 ABA
处理后 DoCDPK1 和 DoCDPK2 的表达量呈现不同变化趋势，推测铁皮石斛 CDPK1 和 DoCDPK2 参与低温等非生物
胁迫的响应。
关键词：铁皮石斛；CDPK 基因；基因克隆；逆境胁迫；基因表达
中图分类号：S567 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）

Cloning and expression analysis of DoCDPK genes in Dendrobium officinale
SHENG Kuang， GAO Yan-hui*，SI Jin-ping， and ZHU Yu-qiu
(Zhejiang Agricultural and Forestry University，Nurturing Station for State Key Laboratory of
Subtropical Silviculture，Zhejiang Provincial Strategic Alliance for Technical Innovation in Industry of
Dendrobium officinale，Lin’an，Zhejiang311300，China)

Abstract：To study the structure, function and expression patterns of CDPK (calcium-dependent protein
kinase ) genes in Dendrobium officinale Kimura et Migo, cDNA sequences were cloned from Dendrobium
officinale by RACE and RT-PCR. The full length of cDNA sequences of DoCDPK1 and DoCDPK2 genes
were 1 863 bp and 1 729 bp which the ORF (open reading frames) were 1 539 bp and 1 536 bp encoded
512 and 511 amino acids, respectively. And DoCDPK1 and DoCDPK2 proteins were hydrophilic and
stable, whose secondary structures were made up of α-helix and random coil. The qRT-PCR analysis
showed that DoCDPK1 and DoCDPK2 genes mainly expressed in leaves. The expression of DoCDPK1
and DoCDPK2 genes increased under low temperature and NaCl. However, the expression of DoCDPK1
and DoCDPK2 genes showed different expression patterns under the treatment of ABA. We speculated that
DoCDPK genes took part in the abiotic stresses like cold stress. The results will lay the foundation of
further study of the specific regulation mechanism and relationship with other signaling pathways.

收稿日期：2016- - ；修回日期：2016- -
基金项目：浙江省重大科技专项（2012C12912-9）
* 通信作者 高燕会 Author for correspondence（E-mail:gaoyanhui408@126.com）
网络出版时间：2016-10-26 18:08:45
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1924.S.20161026.1808.011.html

Key words：Dendrobium officinale；CDPK；gene cloning；abiotic stresses；gene expression


铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为兰科石斛属多年生草本植物，是传统名贵
珍稀中药材，具有滋阴清热、益胃生津等功效（吴韵琴 等，2010）。20 世纪 90 年代以来，随着铁
皮石斛组织培养技术的发展，铁皮石斛种植规模得到前所未有的突破，但在铁皮石斛人工种植栽培
过程中，许多非生物胁迫（低温、高温、干旱、盐渍等）一直都是制约其产业化发展的主要瓶颈（赵
瑞强 等，2012；李东宾 等，2013；李聪 等，2014）。
Ca2+作为植物细胞中的第二信使，其信号传导途径已被证明在植物响应生物胁迫和非生物胁迫
中发挥重要作用（崔喜艳 等，2015）。当植物遭受外界胁迫刺激时，胞质中的 Ca2+浓度会发生变
化并产生复杂的信号，这种信号被多种钙感受及响应元件所识别，并由钙传感蛋白将信号向下游进
一步放大与传递，包括改变蛋白的磷酸化作用、细胞骨架重排及修饰基因的表达模式等，引起胁迫
相关基因表达量的变化，从而引发植物生理生化过程的变化来提高对逆境的抵抗（Geiger et al.，2010；
张晓琳等，2013）。CDPK 蛋白是一类植物和原生动物特有的且能响应逆境胁迫信号的一类丝氨酸/
苏氨酸型蛋白激酶（Murphy et al.，2010）。研究表明 CDPK 基因能够通过识别和参与细胞内 Ca2+
信号转导来实现植物抵抗逆境胁迫的生物学功能（Zuo et al.，2012；Weckwerth et al.，2015）。目
前 CDPK 基因已在水稻、烟草、小麦、苹果、龙眼、黄瓜等多种植物中被发现，其响应低温、干旱、
高盐、低渗等多种环境因子的功能也已被证实（王娇娇，2008；陈 虎 等，2011；魏萌涵 等，2015；
许学文 等，2016）。本研究通过克隆铁皮石斛 CDPK 基因，并对其在多种非生物胁迫下的表达情
况进行研究，为提高铁皮石斛的抗逆性及其产业化发展奠定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料与试剂
供试材料铁皮石斛抗寒种质C15来源于浙江省临安市清凉峰国家自然保护浙西大峡谷野生居群
(30°17N，118°52E），保存于浙江农林大学铁皮石斛种质资源圃。种子于组织培养播种后，于室
温为 25 ℃±2 ℃，光照 16 h · d-1 条件下无菌培养 8 个月后用于 RNA 提取。PrimeScriptⅡ1st Strand
cDNA Synthesis Kit 试剂盒、Advantage 2 PCR Kit 和 SMARTer RACE 5’/3’Kit、rTaq DNA 聚合酶、
La Taq DNA 聚合酶、Quickcut 限制性内切酶等试剂均购自于 TaKaRa 公司；异丙基-β-d-硫代半乳
糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)、X-Gal、氨苄青霉素、酵母提取物、胰蛋白胨等
试剂均购自于生工生物工程（上海）股份有限公司；pEASY-T1 Simple Cloning Kit 购自于 TransGen
公司；DNA 凝胶回收、质粒提取和 PCR 清洁试剂盒均购自于 AxyGEN 公司；试验所用引物由生工
生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.2 铁皮石斛 CDPK1 与 CDPK2 的 cDNA 全长的克隆
利用改良 CTAB 法提取铁皮石斛总 RNA（蒋 园 等，2016），并通过 Nanodrop2000 检测 RNA
纯度和浓度，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。根据 PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit
试剂盒反转录合成 cDNA 第一链。
采用 Primer Premier 5.0 设计 CDPK 基因序列特异引物（表 1），用于扩增 CDPK1 和 CDPK2
的中间片段，再根据中间片段设计 RACE 引物进行 cDNA 末端快速扩增（表 1），扩增程序为：94
℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，68 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，32 个循环；72 ℃延伸 8 min。

PCR 扩增产物通过 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，并利用凝胶回收试剂盒回收目的片段，连接到
pEASY-T1 Simple Vector 后转化大肠杆菌 Trans1-T1 菌株，经蓝白斑筛选及菌液 PCR 检测后将阳性
克隆送至金斯瑞（南京）生物科技有限公司测序。

表 1 铁皮石斛 CDPK1 与 CDPK2 基因克隆所用的引物序列
Table 1 Primers sequences used in cloning of CDPK1 and CDPK2 genes in D.officinale
引物 Primer 序列(5-3)sequence
CDPK1-F
CDPK1-R
CDPK2-F
CDPK2-R
CDPK1-3GSP
CDPK1-5GSP
CDPK2-3GSP
CDPK2-5GSP
DoCDPK1-F
DoCDPK1-R
DoCDPK2-F
DoCDPK2-R
AAGATGCCGCTGTTGTAGTAAG
CAGAACCTCTGCAATGGCTTAC
CAGTTCGGTGTAACCTATCTTG
TCATCATAGCCACAAACTCGTC
TAAGAACTGCAAGCATGGGTTCCCG
GTGCTTATGCTAGGCCAGGGCTTCC
AGCGGCTGATGTAGATGGTGACGGC
CCGACTGCCGATCCTCGTAAACCCC
ATGGGAAGAGGAAGGATTTCTGCTA
TCAGGAGAAATAAGAACAAAGACCC
AAGAACACCGACTTTCTCCACT
ATCTCAACTACTGAACGCACCA

1.3 铁皮石斛 CDPK1 与 CDPK2 cDNA 序列全长验证及生物信息学分析
利用 DNASTAR、DNAMAN 等软件将测序所得 CDPK1 和 CDPK2 基因的中间片段、3’末端和
5’末端片段进行拼接，根据拼接 CDPK1 和 CDPK2 cDNA 全长序列设计引物（表 1），进行 PCR
扩增：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2.5 min，35 个循环；72 ℃
延伸 10 min。PCR扩增产物于 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测并回收目的片段，连接到 pEASY-T1 Simple
Vector 后转化大肠杆菌 Trans1-T1 菌株，经蓝白斑筛选及菌液 PCR 检测后将阳性克隆于金斯瑞（南
京）生物科技有限公司测序。
通过在线软件 ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）查找 CDPK 基因序列的
开放阅读框，运用 NCBI 上的 BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）检索近缘物种的 CDPK 基因序
列信息，通过 DNASTAR 对测序结果进行拼接与比对，利用在线工具 ProtParam
（http://web.expasy.org/protparam/）分析蛋白质的相对分子量、理论等电点、亲水性、不稳定指数 II
进行预测，运用 SOPMA 对蛋白质的二级结构进行预测，利用 MEGA 6.0 构建进化树。
1.4 铁皮石斛非生物胁迫处理及 CDPK1 和 CDPK2 的表达分析
取生长状况良好的铁皮石斛组培苗（8 月大苗龄），（1）分别放置于 4 ℃、0 ℃、-4 ℃、
-8 ℃的低温培养箱，以 25 ℃常温培养作为对照；（2）4℃低温处理：放置于 4℃低温培养箱分别
培养 0、2、4、8、12、24 h。（3）ABA 处理：用蒸馏水将组培苗根部培养基清洗干净后于 100 mmol · L-1
ABA 溶液分别培养 0h、2、4、8、12、24 h。（4）NaCl 处理：室温组培苗于 400 mmol · L-1 NaCl
溶液中处理 0 、2、4、8、12、24 h。以 0 h 作为对照（CK），各处理分别取叶片，液氮速冻并放
于-80 ℃保存备用。
利用 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒对铁皮石斛总 RNA 反转录合成 cDNA
第一链。根据定量引物设计原则设计 qRT-PCR 引物（见表 2）。以低温、ABA、高盐处理下反转录
后的铁皮石斛 cDNA 为模板，进行 qRT-PCR 检测；qRT-PCR 反应体系为 10 μL，包括 cDNA 0.5 μL，
SYBR Premix Ex Taq II 5 μL，Primer-F 与 Primer-R 各 0.4 μL，重复 3 次；PCR 反应扩增程序为 95 ℃
预变性 30 s，95 ℃变性 5 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 20 s（共 40 个循环），每个循环第 3 步进

行荧光采集；最后 95 ℃变性 1 min，退火至 60 ℃，保温 1 min 后上升至 95 ℃，在此过程中检测
荧光值并绘制溶解曲线；利用软件 GraphPad Prism 5.0 对实验数据进行制图。

表 2 铁皮石斛荧光定量 PCR 引物
Table 2 Primers sequences used in qRT-PCR of D.officinale
引物 序列(5-3)
Primer sequence(5-3)
DoCDPK1-RT-F
DoCDPK1-RT-R
DoCDPK2-RT-F
DoCDPK2-RT-R
Actin-F
Actin-R
GAAAGATGCCGCTGTTGTAGTAAGA
CAATGTCGTGAAATCTCTTCTCTGG
TTGTCAGAAGATGAGATTGTGGGTT
ATTCAACATAGTCAATCAAGCCGTC
TTGTGTTGGATTCTGGTGATGGTGT
TTTCCCGTTCTGCTGTTGTTGTGAA

2 结果与分析
2.1 铁皮石斛 CDPK1 基因和 CDPK2 基因的克隆
以铁皮石斛 C15 叶片 cDNA 为模板，根据转录组信息设计特异引物扩增 CDPK1 和 CDPK2 的
中间片段，再根据中间片段序列设计 3’GSP 和 5’GSP 引物进行末端克隆（图 1），将中间片段与
末端片段拼接得到 CDPK1 和 CDPK2 全长序列，根据拼接所得的 CDPK1 和 CDPK2 序列设计全长
引物，验证基因的 cDNA 序列全长（分别为 1 863 bp 和 1 729 bp），分别命名为 DoCDPK1、DoCDPK2
（图 2）。

图 1 DoCDPK1（A）和 DoCDPK2（B）基因的 RACE 3’和 5’扩增
Fig. 1 RACE3’ and 5’ amplification of DoCDPK1（A）and DoCDPK2（B）genes


图 2 DoCDPK1 基因（A）和 DoCDPK2 基因（B）的 cDNA 全长扩增
Fig. 2 The cDNA full-length amplification of DoCDPK1（A）and DoCDPK2（B）genes


2.2 铁皮石斛 DoCDPK1 基因和 DoCDPK2 基因的生物信息学分析
DoCDPK1 基因的 cDNA 序列全长 1 863 bp，通过 ORF Finder 分析得到 1 539 bp 的最大开放阅
读框，编码 512 个氨基酸，5’端和 3’端的非翻译区长度分别为 89bp 和 235bp；通过在线软件 Protparam
预测，蛋白质的分子式为 C2583H4095N737O758S17，分子量为 58.1 kD，理论等电点（isoeletric point，pI）
为 8.35，总体亲水性 GRAVY 为-0.480，属于亲水蛋白，不稳定指数 II 为 39.85，属于稳定蛋白；利
用 SOPMA 预测 DoCDPK1 蛋白的二级结构，发现其二级结构由 α-螺旋（α-helix）、β-折叠（β-turn）、
延伸链（Extended strand）和无规卷曲（Random coil）构成，分别占 46.09% 、7.81% 、14.06%和
32.03%，表明 DoCDPK1 蛋白主要由 α–螺旋（α-helix）和 β-折叠（β-turn）构成。
DoCDPK2 基因的 cDNA 序列全长 1 729 bp，通过 ORF Finder 分析得到 1 536 bp 的最大开放阅
读框，编码 511 个氨基酸，5’和 3’的非翻译区长度分别为 65bp 和 128bp；通过在线软件 Protparam
预测，蛋白质的分子式为 C2563H4030N714O776S21，分子量为 57.9kD，理论等电点（isoeletric point，pI）
为 5.54，总体亲水性 GRAVY 为-0.416，属于亲水蛋白，不稳定指数 II 为 35.14，属于稳定蛋白；利
用 SOPMA 预测 DoCDPK2 蛋白的二级结构，发现其二级结构由 α-螺旋（α-helix）、β-折叠（β-turn）、
延伸链（Extended strand）和无规卷曲（Random coil）构成，分别占 47.90% 、7.84% 、12.48%和
31.75%。
上述结果表明 DoCDPK1 基因与 DoCDPK2 基因的开放阅读框、蛋白分子式、分子量和二级结
构等物理常数高度相似，推测 DoCDPK 基因家族成员性质稳定。
2.3 铁皮石斛 DoCDPK1 基因和 DoCDPK2 基因编码氨基酸多序列比对
通过 BLASTp 将铁皮石斛 DoCDPK1 基因和 DoCDPK2 基因编码氨基酸序列与其他植物氨基酸
序列进行比较，结果发现 DoCDPK1 与胡杨（Populus euphratica，XP_011043190.1）、蔓花生（Arachis
duranensis，XP_015952040.1）的同源性均为 90%，DoCDPK2 与棕榈（Elaeis guineensis，
XP_010261434.1）、蓖麻（Ricinus communis，XP_002509886.1）同源性分别为 73%和 75%。通过
在线软件 SMART 分析表明铁皮石斛 DoCDPK1 和 DoCDPK2 都存在 4 个能促进 Ca2+结合的 EF 手型
结构及起催化作用的 Ser/Thr 蛋白激酶序列。通过 DNAMAN 进行氨基酸多序列比对，发现这些序
列都具有 CDPK 典型结构域：在氨基末端具有一段 40～200 个氨基酸组成的可变区，该区域的长度
变化大，不具有同源性；由约 300 个左右氨基酸组成的催化区，含起催化作用的 Ser/Thr 蛋白激酶
序列，同源性较高且相对保守；羧基末端具有包含 4 个促进 Ca2+结合的 EF 手型结构的调控区；调
控区与催化区之间有 30 bp 左右的连接区，此区保守性高且富含碱性氨基酸。结果表明：DoCDPK1
与 DoCDPK2 具有完整的功能结构域，确定所克隆的 DoCDPK1 基因与 DoCDPK2 基因结构完整。


图 3 铁皮石斛 DoCDPK1 基因和 DoCDPK2 基因与其他植物的多序列比对
Fig. 3 Multiple sequence alignment of DoCDPK1 and DoCDPK2 genes in D. officinale and other plants
Vr 绿豆（Vigna radiate，XP_014508998.1）；Bd 短柄草（Brachypodium distachyon，XM_003562825.3）；Ma 小果野蕉（Musa acuminata，
XP_009386117.1）；Eg 棕榈（Elaeis guineensis，XP_010261434.1）；Nn 荷花（Nelumbo nucifera，XP_010276092.1）；Ob 短药野生稻（Oryza
brachyantha，XP_006657859.1）；Pa 蝴蝶兰（Phalaenopsis amabilis，ABU45516.1）；Pd 海枣（Phoenix dactylifera，XP_008803232.1）；
Rc蓖麻（Ricinus communis，XP_002509886.1）；Ad蔓花生（Arachis duranensis，XP_015952040.1）；Pe胡杨（Populus euphratica，XP_011043190.1）


2.4 铁皮石斛 DoCDPK1 和 DoCDPK2 蛋白的进化树分析
从 NCBI 数据库中搜索拟南芥的 34 个 CDPK 并下载，运用 MEGA 6.0 绘制 DoCDPK1 和
DoCDPK2 与 34 个拟南芥 CDPK 的系统进化树（图 4），由于拟南芥 CDPK 可以分成四个组，Group
II 又可以进一步分为两个亚组。根据进化树的显示分析，DoCDPK1 与 AtCDPK28 亲缘关系最近，
位于 Group IV。DoCDPK2 与 AtCDPK3 亲缘关系最近，位于 Group II a。根据 Gao 等（2014）的报
导，AtCDPK28 基因的缺失会导致拟南芥幼苗对 NaCl 引起的渗透胁迫敏感，而 AtCDPK28 基因的超
表达能显著增强其对渗透胁迫的耐受性，由此说明 AtCDPK28 基因能参与渗透胁迫诱导。Mori 等
（2006）研究表明，AtCDPK3 基因能参与 ABA 介导的气孔，除此之外，AtCDPK3 基因的表达能增
加拟南芥耐盐胁迫能力(Mehlmer et al.，2010)。由于 DoCDPK1 和 DoCDPK2 与 AtCDPK28 和
AtCDPK3 亲缘关系近，可以推测铁皮石 DoCDPK1 和 DoCDPK2 与拟南芥的同源基因具有相似的功
能及调控机理。

图 4 铁皮石斛 DoCDPK1 和 DoCDPK2 蛋白与拟南芥 CDPK 蛋白的系统进化树分析
Fig.4 Phylogenetic tree analysis of DoCDPK1 and DoCDPK2 in D. officinale and Arabidopsis thaliana
AtCDPK1（OAO95404.1）；AtCDPK2（OAP04527.1）；AtCDPK3（OAP00335.1）；AtCDPK4（OAO98100.1）；AtCDPK5（OAP00897.1）；
AtCDPK6（OAP08681.1）；AtCDPK7（OAO93673.1）；AtCDPK8(Q42438) ；AtCDPK9（OAP01589.1）；AtCDPK10（OAP19692.1）；
AtCDPK11（OAP12436.1）；AtCDPK12（OAO89946.1）；AtCDPK13（OAP04364.1) ；AtCDPK14（OAP10936.1）；AtCDPK15（OAP00690.1） ；
AtCDPK16（OAP11640.1）；AtCDPK17（OAO95381.1）；AtCDPK18（OAP00569.1）；AtCDPK19（OAP11790.1）；AtCDPK20（OAP09595.1）；
AtCDPK21（OAO96798.1）；AtCDPK22（OAO99795.1）；AtCDPK23（OAO98015.1）；AtCDPK24（OAP09301.1）；AtCDPK25（OAP07914.1）；
AtCDPK26（OAO99190.1）；AtCDPK27（OAP00234.1）；AtCDPK28（OAO91951.1）；AtCDPK29（OAP18068.1）；AtCDPK30（OAP12253.1）；
AtCDPK31（OAO97236.1）；AtCDPK32（OAP03567.1）；AtCDPK33（OAP13223.1）；AtCDPK34（OAO91453.1）

2.5 铁皮石斛 DoCDPK1 和 DoCDPK2 表达模式分析
2.5.1 组织特异性表达
利用 qRT-PCR 技术对铁皮石斛 DoCDPK1 和 DoCDPK2 在其根、茎、叶中的表达模式进行分析
（图 5），结果表明 DoCDPK1 和 DoCDPK2 的表达具有组织特异性，叶片中表达量最高，其次是
茎，在根中表达量最低，说明 DoCDPK1 和 DoCDPK2 主要在叶片中表达。
根 茎 叶
0
2
4
6
8
Root Stem Leaf
D
oC
D
PK
1
相
对
表
达量
D
oC
D
PK
1
R
el
at
iv
e
Ex
pr
es
si
on
A

根 茎 叶
0
2
4
6
Root Stem Leaf
B
D
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D
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2
相
对
表
达量
D
oC
D
PK
2
R
el
at
iv
e
E
xp
re
ss
io
n

图 5 DoCDPK1(A)基因和 DoCDPK2(B)基因在根、茎、叶中的表达
Fig. 5 The relative expression of DoCDPK1 (A)and DoCDPK2(B) genes in different tissues

2.5.2 非生物胁迫下表达
图 6 表明，与 25 ℃常温（对照）相比，4 ℃时 DoCDPK1 和 DoCDPK2 的表达量极显著升高。
图 7 表明，在 4 ℃低温处理不同时间，DoCDPK1 和 DoCDPK2 的表达量均有不同程度增加，且在
4 h 时达到最大。图 8 表明，盐胁迫 NaCl 处理后，DoCDPK1 的表达量呈现上升趋势且在处理 4 h
达到最高，DoCDPK2 表达量也呈现上升且在 2 h 达到最大。图 9 表明，ABA 处理下，DoCDPK1
的表达量呈现先上升后下降的趋势，处理 2 h 时表达量达最大，随后显著降低，DoCDPK2 在 12 h
处理时表达量极显著高于对照，其余时间段与对照差异不显著。
上述结果表明：在低温、高盐、ABA 胁迫下铁皮石斛 DoCDPK1 与 DoCDPK2 都有不同程度的
表达。不同低温胁迫下 4 ℃的表达量极显著高于 0 ℃及以下的低温处理，推测 0 ℃以下冻害时水
分结冰会引发细胞质壁分离，Ca2+信号无法由细胞壁向胞质内传递，从而不能引起 CDPK 基因的表
达。对表达量最高的 4 ℃和 NaCl 处理分析表明，与处理前相比各时间点均有不同程度的上调，说
明 4 ℃和 NaCl 确实是一类能诱导 CDPK 基因表达的因子。ABA 处理下 DoCDPK1 与 DoCDPK2 所
呈现出不同的表达规律，其调控机理还需进一步研究。

CK 4 0 -4 -8
0
2
4
6 **
**
温度/℃
Temperature/℃
A
D
oC
D
PK
1
相
对
表
达
量
D
oC
D
PK
1
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el
at
iv
e
E
xp
re
ss
io
n
CK 4 0 -4 -8
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5 **
温度/℃
Temperature/℃
B
D
oC
D
PK
2
相
对
表
达
量
D
oC
D
PK
2
R
el
at
iv
e
E
xp
re
ss
io
n

图 6 DoCDPK1 基因(A)与 DoCDPK2(B)基因在不同温度处理下的相对表达量
Fig. 6 The relative expression of DoCDPK1(A) and DoCDPK2 (B) genes induced by different temperature

CK 2 4 8 12 24
0.0
0.5
1.0
1.5
**
**
**
** **
处 理 时 间/h
Treatment time/h
A
D
oC
D
PK
1
相
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表
达
量
D
oC
D
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1
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el
at
iv
e
E
xp
re
ss
io
n
CK 2 4 8 12 24
0
2
4
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**
**
**
处 理 时 间/h
Treatment time/h
B
D
oC
D
PK
2
相
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表
达
量
D
oC
D
PK
2
R
el
at
iv
e
E
xp
re
ss
io
n

图 7 DoCDPK1 基因(A)与 DoCDPK2 基因(B)在 4 ℃处理不同时间下的相对表达量
Fig.7 The relative expression of DoCDPK1 (A)and DoCDPK2(B) genes induced by 4 ℃ with different time
CK 2 4 8 12 24
0
2
4
6
8
**
** ** **
处 理 时 间/h
Treatment time/h
A
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1
相
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表
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量
D
oC
D
PK
1
R
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at
iv
e
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xp
re
ss
io
n
CK 2 4 8 12 24
0
1
2
3
4
5
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**
**
**
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处 理 时 间/h
Treatment time/h
B
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图 8 DoCDPK1 基因(A)与 DoCDPK2 基因(B)在 NaCl 处理不同时间下的相对表达量
Fig.8 The relative expression of DoCDPK1(A) and DoCDPK2(B) genes induced by NaCl with different time
CK 2 4 8 12 24
0.0
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* * * *
A
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图 9 DoCDPK1 基因(A)与 DoCDPK2 基因(B)在 ABA 处理不同时间下的相对表达量
Fig.9 The relative expression of DoCDPK1(A) and DoCDPK2(B) genes induced by ABA with different time

3 讨论

非生物胁迫是制约植物生长的主要逆境因子，近年报道的CDPK基因与植物的逆境胁迫有关，
CDPK 蛋白激酶是植物特有的一类 Ca2+信号受体（邹克琴 等，2005）。自从在水稻中克隆出了第 1
个 CDPK 基因以来（王娇娇 等，2008），水稻基因组中被报道有 31 个 CDPK 基因家族成员（Ray et
al.，2007），大多数成员与逆境胁迫信号有关。Saijo 等（2000）研究发现在水稻 OsCDPK7 基因过
量表达的转基因植株中，不少与干旱、冷害及盐害有关的基因的被诱导，表明 OsCDPK7 基因介导
了钙信号对干旱、冷害和盐胁迫等逆境信号的转导。CDPK 基因在其它植物中的研究也被陆续报
道，黄瓜 CsCDPK5 为淹水胁迫响应基因，可能参与黄瓜淹水后下胚轴不定根的形成过程（许学文
等，2016）。拟南芥中存在 34 个 CDPK 基因家族成员，根据其功能结构区至少划分为四个组（Tao
et al.，2013），Gao 等（2014）的研究结果表明，CDPK28 基因缺失导致拟南芥幼苗对 NaCl 引起
的渗透胁迫敏感，而 CDPK28 基因超表达拟南芥对渗透胁迫的耐受性显著增强，其作用机制是通
过蛋白水平通过磷酸化下游底物来参与胁迫反应。Mehlmer 等（2010）的研究结果表明，CDPK3 基
因的表达能极大提高拟南芥对盐胁迫的耐性，其在盐胁迫的作用机理与 CDPK28 基因相似（Gao et
al.，2014），。而本文所研究的 DoCDPK1 基因和 DoCDPK2 基因与拟南芥 CDPK28 基因和 CDPK3
基因具有较高的同源性，因而将其作为本课题的研究对象具有科学的依据，且本课题通过 qRT-PCR
的研究表明在高盐处理下 DoCDPK1 基因和 DoCDPK2 基因在不同的时间点上都有表达量的提高，
可见其确实能够响应盐胁迫。此外 Mori 等（2006）研究还表明拟南芥 CDPK3 基因能参与到 ABA
介导的气孔关闭的调控中。CDPK 基因是细胞中的一类钙依赖蛋白激酶，当细胞接受刺激时，胞质
中 Ca2+浓度会发生明显升高，Ca2+继而与钙依赖蛋白激酶结合，再进一步使 CDPK 基因作用的底物
发生磷酸化作用，从而发挥 Ca2+信号传导的作用，而低温、高盐、激素等都是一类能使胞质中 Ca2+
浓度升高的环境因子，因而 CDPK 基因能响应低温在内的多种非生物胁迫的调控。本研究对铁皮石
斛 DoCDPK1 基因与 DoCDPK2 基因进行荧光定量表达分析，结果表明其在低温、ABA 与盐胁迫下
均可被诱导并有不同程度的表达，从而推测铁皮石斛中的 CDPK 基因是通过胞质中 Ca2+信号传导发
挥作用的。此外，通过不同组织器官的表达分析，发现这两个成员均在叶中表达量最高，其次是茎
和根，说明 CDPK 基因的表达也具有组织特异性。
本课题从铁皮石斛中克隆出 2 个 CDPK 基因 DoCDPK1 与 DoCDPK2，通过对 CDPK 基因结构
及其编码的蛋白进行分析，表明CDPK保守结构由可变区、催化区、连接区和调控区构成（Etzold et
al.，2014），其编码的蛋存在丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶位点和 4 个 EF 手型结构，符合钙依赖蛋白激
酶典型结构特征，本课题所克隆的 CDPK 基因结构完整，具有完整的典型结构域（Wang et al.，
2010），且与其他植物具有较高的同源性；对非生物胁迫下铁皮石斛 DoCDPK1 基因与 DoCDPK2
基因的表达进行研究，表明其在低温、ABA 与盐胁迫下均受诱导，CDPK 基因作为植物特有能响
应外界刺激的蛋白激酶，对与低温、激素、高盐等非生物胁迫下的调控机制还需进一步研究。尽管
目前已证实 CDPK 基因在植物 Ca2+信号转导过程中具有重要作用, 但其具体的传导途径，以及与其
它信号通路之间的联系尚不明确，是接下来研究的重点（Harmon et al.，2003）。

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