全 文 ：　 〔作者简介〕 吕雪荣 (1977-), 女 , 辽宁省丹东市人 , 在读硕士研究生 , 主要研究方向为免疫药理学。
玉竹提取物 B对 CEM 的抑制作用
吕雪荣 , 潘兴瑜 , 陈　莹 , 金艳书 , 佟　伟
(锦州医学院免疫与病原生物学教研室 , 辽宁锦州 121001)
【摘要】目的　研究玉竹提取物 B (Extraction B of poly-gonatom odo ratum , EB-PAOA)对 CEM 和人类正常 T
细胞作用。 方法　以不同浓度的 EB-PAOA 处理 CEM 细胞和正常人 T 细胞 , 采用 MTT 法测 EB-PAOA 对
CEM 及人类 T 细胞增殖的抑制作用 , 采用电镜检测 CEM 细胞形态学的变化 , 采用流式细胞仪及琼脂糖电泳检
测 DNA 的变化 , 观察 CEM 在 EB-PAOA 的作用下发生凋亡的情况。结果　最低浓度 (1∶4000/ml)对 CEM 的
增殖抑制作用较小 , 随浓度的增大抑制作用逐渐增强 , 最高浓度的抑制作用最强 (P<0.01);可促进 CEM 细胞
凋亡;EB-PAOA 对人的正常 T 淋巴细胞的增殖没有影响 (P >0.05)。结论　EB-PAOA可以抑制 CEM 的增
殖 , 其抑制作用随浓度增加逐渐增强;并能诱导 CEM 细胞凋亡;EB-PAOA 对人类 T 淋巴细胞的增殖没有影
响。
【关键词】　玉竹 ;CEM ;凋亡
【中图分类号】　R392.5　　　【文献标识码】 　A　　　【文章编号】　1000-5161(2004)05-0035-04
The Inhibitory Effect of EB-PAOA on CEM
LV Xue-rong , PAN Xing -yu , CHEN Ying , JIN Yan-shu , TONG Wei
(Department of Immunology and Microbiology , Jinzhou Medical College , Jinzhou 121001 China)
【Abstract】　Objective　To research the inhibitory action of EB-PAOA on the proliferation of CEM
cells.Methods　To assay for the proliferation of CEM and human T cells with M TT assay , to observe
the apoptosis wi th elect ron microscope , agarose elect rophoresis and flow cy tometer.Results 　1∶
4000ml-1 had litt le ef fect on CEM , w ith concentration increasing , inhibito ry act ion enforced , 1∶
500ml-1 had the g reatest act ion(P<0.01).It could induce apoptosis.EB-PAOA had no affect ion
on human T cells(P>0.05).Conclusions 　EB-PAOA could inhibit the proliferation of CEM and
induce apoptosis.It had no effect on human T cells.
【Key words】　EB-PAOA ;CEM ;apoptosis
　　目前白血病的治疗始终是临床治疗的难点 , 虽
已出现骨髓移植 , 但因配型困难及其昂贵的费用难
以普及 , 化疗仍是临床治疗的主要方法 , 但化疗药
物的严重副作用对患者产生极大严重的伤害 , 耐药
性的出现又给临床治疗带来更大的困难 。因而新的
毒副作用小的抗肿瘤药物的研究越来越受到关注 。
中药玉竹 (Polygonatum odoratum var plurifo rum o-
hwi , PAOA)为百合科黄精属中草药 , 被广泛应
用于心血管[ 1]及糖尿病[ 2]的治疗中 , 经本实验室
研究证明 , 不同的玉竹提取物具有明显免疫抑
制[ 3 ,4]及抗肿瘤活性[ 5 , 6] 。本实验的研究旨在探讨
玉竹提取 B对CEM 的抑制作用及作用途径 。
1　材料与方法
1.1　细胞株 　CEM 细胞 , 购自天津血液病研究
所;人 T 淋巴细胞 , 购自锦州中心血站经分离而
得 。
1.2　药品与主要试剂
玉竹提取物 B(EB-PAOA)为锦州医学院免疫
教研室潘兴瑜教授提供;RPM I-1640培养基 、Hep-
es为Gibco 公司产品;甲基四氮唑蓝(MTT)为瑞士
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锦州医学院学报
J Jinzhou Med College　2004 Oct., 25(5)
产品;锇酸 、琼脂糖 、蛋白酶 K 均为 Sigma 公司产
品;RNA酶 、碘化丙锭(PI)为华美公司产品。
1.3　方法
1.3.1　实验分组及给药将 EB-PAOA 分为按 1∶
4000/ml、 1∶2000/ml 、 1∶1000/ml、 1∶500/ml 、 二
甲基亚砜 (DMSO)及空白对照组分组 , 取 CEM
细胞培养 , 在对数生长期细胞给药后分别于 1 、 3 、
5d进行各项指标的测定。
1.3.2　指标测定
1.3.2.1　抑制率测定 (MTT 法)[ 7]
CEM 细胞及人 T 淋巴细胞接种于40孔培养板
中 , 取其对数生长期加处理因素 , 于前 4h 加MTT
(用 pH7.2PBS 配制 , 5mg/ml , 针头滤器除菌)
0.01ml/孔 , 4h后离心平板 2000r/min , 5min 。弃
上清 0.16m l , 加生理盐水 0.2ml , 离心洗 2 ～ 3 次
后弃上清 0.2ml , 加无水乙醇 0.2ml , 反复吹吸几
次 , 待 fomazan完全溶解后测 OD值 , λ取 570 。
1.3.2.2　电镜[ 8]
取 3×105/ml 细胞 , 分别加 EB -PAOA 及
1640培养基。分别培养 1d 、 3d 、 5d后取出 , 收集
细胞 PBS 洗涤两遍 , 体积分数为 3%戊二醛固定
4h , 质量浓度为 10g/ l锇酸固定 1h , 体积分数为
50%, 70%, 90%, 100%梯度丙酮脱水 , 树脂包
埋 , 超薄切片机切片 , 厚度 500A , 醋酸钠枸橼酸
铅双染色法染色 , 电子显微镜下观察 , 摄片 。
1.3.2.3　DNA 琼脂糖凝胶电泳[ 8]
取1×106 细胞 , PBS 洗涤两遍 , 移入微量离
心管中 (1.5ml)1000r/min 离心 5min 弃上清液 ,
加入细胞裂解液 100ul 混匀 , 加入无 DNA 酶的
RNA酶 , 终浓度 200mg/L , 37℃水浴后 1h , 再加
入蛋白酶 K , 终浓度 300 mg/ L , 50℃水浴 3h , 不
时摇动 , 冷冻到室温 , 加入等体积饱和 酚: 氯
仿: 异戊醇 =25∶24∶1 的溶液 , 小心混合两相 ,
使之形成乳浊液 , 12000r/min离心 15min , 将上清
液移入另一离心管中 , 勿触动界面层蛋白部分 。
氯仿: 异戊醇=24∶1溶液再抽提一次 , 然后加入
1/10体积 3mol/L 乙酸钠和 2倍体积的冷无水乙醇
充分混匀 , 可见 DNA 形成絮状物 , 放 -20℃过
夜 , 次日 12000r/min 离心 15min , 弃上清液 , 并
以体积分数为 70%乙醇洗涤 1次 , 真空干燥 , 最
后溶于 20μlTE 。取 10μl样品与 2μl上样液混匀 ,
质量分数为 1.8%琼脂糖凝胶电泳 3 ～ 4h , 电泳缓
冲液 0.5×TBE , 电压 2V/cm 。紫外灯下观察 , 拍
照 。
1.3.2.4　流式细胞仪检测[ 8]
取 5×106 个细胞 1000r/min离心 5min 收集细
胞 , 弃去培养液 , 加入冰预冷的 70%的乙醇 3ml
固定 , 4℃1h;1000r/min离心 10min 弃去固定液 ,
3ml PBS 重悬 5min;400 目的筛网过滤 1 次 ,
1000r/min 离心 5min , 弃去 PBS;加入 1ml PI 染
液 (含 PI 5mg , RNaseA 酶 1ml , 枸橼 酸 钠
100mg , TriponX-100 1ml , 生理盐水 65ml), 4℃
避光30min;流式细胞仪检测:PI用氩离子激发荧
光 , 激发光光波长为 488nm , 发射光光波长大于
630nm , 产生红色荧光 , 分析 PI 荧光的直方图 。
1.4　统计学处理
所有数据均采用均数±标准差 ( x ±s)表示 ,
采用方差分析。
2　结　　果
2.1　抑制率的测定 (MT T 法)
MTT (四甲基偶氮唑盐)法是一种检测细胞
生长的方法。抑制率的测定为:抑制率=(1-实
验孔OD值/对照孔 OD 值)×100%。EB-PAOA
对 CEM 的作用见表 1 , EB-PAOA 对正常人 T 淋
巴细胞的作用见表 2。由表 1可以看出 , 随浓度的
增加 , EB-PAOA 对 CEM 的抑制作用逐渐增强 ,
除 1∶4000/ml外随时间的增加抑制作用也逐渐增强
(P<0.01), 最高浓度即 1∶500/ml的增加不明显。
而表 2的数据显示 EB-PAOA 对人 T 淋巴细胞没
有影响 (F=1.19 , P>0.05)。
表 1　不同组别 , 不同时间点的细胞生长抑制率 (%)
Groups 1 day 3 day 5 day
1∶4000/ml 18.00±7.64 23.67±2.25 23.33±15.66
1∶2000/ml 36.33±9.13 35.00±4.10 46.00±6.99
1∶1000/ml 80.67±3.14 85.00±5.37 90.00±1.79
1∶500/ml 99.00±1.55 99.00±0.89 98.00±0.02
DMSO 0 0 0
F 340.66 1024.99 179.76
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表 2　EB-PAOA作用人 T 淋巴细胞 3d的 OD值
groups OD
cont rol 0.217±0.019
dmso 0.210±0.024
1:4000/ml 0.177±0.027
1:2000/ml 0.193±0.013
1:1000/ml 0.200±0.015
1:500/ml 0.207±0.019
2.2　电镜
透射电镜观察凋亡形态学改变:图 1为正常 T
淋巴细胞 , 表现为核膜完整 , 核染色质均匀 , 细胞
膜完整 , 无细胞器损伤。图 2为实验组的改变 , 染
色质聚集 , 细胞核固缩 , 并碎裂成大小不等的小
体 , 为核膜所包裹 , 形成凋亡小体 。
2.3　DNA琼脂糖凝胶电泳
正常活细胞 DNA 基因组条带位于加样孔附
近 , 坏死细胞由于其 DNA 的不规则降解显一条连
续的膜状条带 , 凋亡细胞的 DNA降解为 180 bp或
其多聚体组成的寡核苷酸片段显 “梯状 (ladder)”
条带。图 3 为实验组 3d的结果 , 可以看出随浓度
的增加梯状带越来越明显 , 在最高浓度可见大量坏
死细胞 DNA形成的膜状带 。
2.4　流式细胞仪检测
流式的结果见表 3 , 随 EB -PAOA 浓度的增
加 , 与对照组相比凋亡的细胞数逐渐增加;随时间
的增加 , 各组的凋亡细胞数也逐渐增多。
表 3　流式细胞仪检测凋亡结果
g roups 1 day (%) 3 day (%) 5 day (%)
dmso 6.28 6.31 7.73
1∶4000/ml 7.35 8.48 19.15
1∶2000/ml 8.42 11.56 20.13
1∶1000/ml 9.29 13.76 21.32
1∶500/ml 10.14 14.49 25.06
3　讨　　论
通过本实验证明 EB-PAOA能抑制 CEM 细胞
的增殖 , 并且呈明显的时间-剂量依赖性 , 从 1∶
4000/ml到 1∶500/ml抑制作用逐渐增强 , 1∶500/
ml作用最强 , 最高达 90%以上 。但对人的正常淋
巴细胞没有影响 。传统抗肿瘤药在杀伤肿瘤细胞的
同时也大量的破坏机体的正常细胞 , 这就给临床治
疗带来难以避免的副作用 。而玉竹提取物 B 的实
验已经证实对人的 T 淋巴细胞的正常生长没有影
响 , 共同培养 3d 各组的抑制作用没有明显差别 ,
均为 P >0.05。EB -PAOA 能诱导其发生凋亡
(apoptosis), 程序性死亡 (PCD)或凋亡是一种不
同于坏死且受基因指导的细胞自我消亡过程 , 亦是
许多抗癌药物的主要效应机制之一[ 9] 。Li[ 10] 等对
白血病的细胞系的研究发现 , 自发性的细胞凋亡普
遍存在 , 发生率为 0.1%～ 16%, 但大部分低于
3%。不同血液系统肿瘤细胞系 (HL60 、 K562 、
CEM 等)对药物的敏感性取决于在培养中产生的
自发凋亡的数目 。如细胞自发凋亡的比例高 , 则对
药物敏感;反之则不敏感 。同样的结论在急性髓性
白血病(AML)病人的临床观察中也得到证实[ 11] 。
由此可见 , 各种白血病的发生及其对治疗的反应可
能均与细胞凋亡有关。本实验的结果表明 , CEM
细胞的正常凋亡率在 6%左右 , 而加 EB -PAOA
处理后 , 流式细胞仪检测的结果表明凋亡率明显增
加 , 最高达 25.06%, 且具有浓度和时间依赖性。
琼脂糖电泳也证实了这一结果。据本实验室以往的
研究表明 , EB -PAOA 具有明显的抗肿瘤作用 ,
而且可以诱导 CEM 细胞分化 , 这对于急性白血病
的治疗具有明显的意义 。而本实验证实 EB -
PAOA的抗 CEM 作用主要机制之一是通过诱导
CEM 细胞凋亡。目前已经发现诱导凋亡的机制有
很多 , 不同的药物有不同的作用机制 , 玉竹具体诱
导凋亡的机制还有待于进一步的研究 。
〔参　考　文　献〕
[ 1] 　刘小红.玉竹减慢心率的临床观察 [ J] .职业与健康 ,
2002 , 18 (5):139-140.
[ 2] 　李小州.中药益气养阴复方治疗气阴两虚型糖尿病的临床和
实验观察 [ J] .中国自然医学杂志 , 2001 , 3 (1):29-31.
[ 3] 　潘兴瑜.玉竹提取物 A 对小鼠 MφIL-1和 TNF-α产生的
影响 [ J] .美国中华医药杂志 , 2000 , 3:11-12.
[ 4] 　潘兴瑜.玉竹提取物 A 对小鼠混合淋巴细胞培养和皮肤移
植排斥反应的作用 [ J] .美国中华医药杂志 , 2001 , 1:23
-24.
[ 5] 　潘兴瑜.玉竹提取物 B 对肿瘤的抑制作用 [ J] .中国免疫
学杂志 , 2000 , 16 (7):366-377.
[ 6] 　李淑华.玉竹提取物 B对 CEM 细胞表面标志的影响 [ J] .
锦州医学院学报 , 1997 , 10 (6):14-15.
[ 7] 　潘兴瑜.MT T 比色法改进的研究 [ J] .中国免疫学杂志 ,
2000 , 15 (6):559.
[ 8] 　朱立平 , 陈学清.免疫学常用实验方法 [ M] .北京:人民
军医出版社 , 2000.
37吕雪荣.等 ,玉竹提取物 B对 CEM 的抑制作用
[ 9] 　范如英.细胞凋亡的研究进展 [ J] .第三军医大学学报 ,
1999 , 21 (8):13-14.
[ 10] 　Li X , Gong J , Feldman E.Apoptosis cell death during t reat-
men t of leukemias [ J] .Leak lymphoma , 1994 , 13 (suppl
1):65-71.
[ 11] 　Smith BD , Bambach BJ , Vala MS , et al.Inhibi t apoptosis
and drug resistance in acute myeloid leukemia [ J ] .Br J
Heamatoml , 1998 , 102 (4):1042-1049.
〔收稿日期〕 2003-08-25
图 1　正常 CEM 细胞 5000× 图 2　凋亡晚期出现凋亡小体 5000×
M:marker　A:Control　B:1∶4000/ml　C:1∶20000/ ml　D:1∶1000/ml　E:1∶500/ ml　F:DMSO
图 3　玉竹作用 3d 的电泳结果
在统计分析中多组计量资料比较为什么不能用 t 检验
对于多组计量资料 , 如果用两均数比较的 t 检验来比较组间的差异 , 会加大犯 I 类错误的概率α, 从
而可能把本无差别的两个总体均数判为有差别。例如 , 有 4个均数 , 两两组合数为 C24=6 , 若用 t 检验做
6次比较 , 且每次比较的检验水准为α=0.05 , 则每次比较不犯 I 类错误的概率为 (1-0.05), 6次均不犯
I类错误的概率为 (1-0.05)6 , 这时 , 总的检验水准变为 1-(1-0.05)6=0.26 , 比 0.05大多了。因
此 , 多组均数间的比较不能直接用两均数 t 检验的检验水准和标准误。
多组均数之间的比较要采用方差分析 (F 检验), 当方差分析结果为 P <0.05时 , 只能说明 k 组总体
均数之间不完全相同 。若想进一步了解哪两组的差别有统计学意义 , 需进行多个均数间的多重比较 , 即
SNK-q 检验 (多个均数两两之间的全面比较)、 LSD-t 检验 (适用于一对或几对在专业上有特殊意义的
均数间差别的比较)和 Dunnett检验 (适用于 k-1个实验组与一个对比组均数差别的多重比较)。
本刊编辑部
38 锦州医学院学报　2004 年 10 月 , 25(5)