全 文 ：收稿日期:2009-09-18
基金项目:国家自然科学基金(30771441)
作者简介:孙　枫(1978-),男 ,江苏武进人 ,博士 ,主要从事植物防卫反应研究。
通讯作者:董汉松(1960-),男 ,山东莒南人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事植物防卫信号传导教学与研究。
拟南芥长链脂肪醇氧化酶(AtFAO3)
在抗病防卫反应中的作用分析
孙　枫 ,杨　雪 ,王晓莉 ,董汉松
(南京农业大学 农业部病虫害监测与治理重点开放实验室 ,江苏 南京　210095)
　　摘要:长链脂肪醇氧化物酶(FAO)基因编码一个与膜结合 ,包含黄素 , 产生 H2O2的长链脂肪醇氧化酶。在拟南芥
基因组中包含 4个 FAO同源基因。然而 , 拟南芥 FAO 在响应非生物和生物环境胁迫中起何种作用还不得而知。本研
究中 , 我们分析了拟南芥 AtFAO3 在植物防卫病原细菌 Pseudomonas syringae pathovar(pv.)tomato strain DC3000(Pst
DC3000)中的作用。拟南芥原生质体细胞瞬时表达 AtFAO3 偶联 GFP融合蛋白表明 , AtFAO3定位于细胞膜。与野生型
植株相比 ,拟南芥 AtFAO3 基因 T-DNA 插入突变体 Atfao3 在正常条件叶片中 H2O2 含量下降 ,在氧胁迫或生物胁迫下
积累活性氧含量减少。接种病原细菌 Pst DC3000 后 ,与野生型植株相比 , Atfao3 突变体体内细菌繁殖数量增加 , 叶片
病害症状加重 ,防卫相关基因 PR1 、PR2 和PAL 表达减弱。我们基于以上T-DNA突变体分析结果表明 , AtFAO3在植物
对病原细菌防卫中起重要作用。
关键词:长链脂肪醇氧化酶;T-DNA突变体;植物抗病防卫;活性氧
中图分类号:Q785　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2009)06-0001-05
Functional Analysis of Arabidopsis AtFAO3 in Defense
Against Pseudomonas syringae
SUN Feng ,YANG Xue ,WANG Xiao-li ,DONG Han-song
(Key Lab of Monitoring and Management of Plant Disease and Insects ,Ministry of
Agriculture ,Nanjing Agricultural Unversity ,Nanjing　210095 ,China)
Abstract:The long-chain alcohol oxidase(FAO)gene encodes a membrane bound , flavin-containing , hydrogen per-
oxide generating , long chain alcohol oxidase.There are four homologues of FAO in the Arabidopsis thaliana genome.But
very little information is known about the function of Arabidopsis FAOs in response to abiotic and biotic environmental
stresses.Here ,we analyzed the role of the AtFAO3 from Arabidopsis in plant defense against the bacterial pathogen Pseu-
domonas syringae pathovar(pv.)tomato strain DC3000(Pst DC3000).AtFAO3 translational fusion with green fluorescent
protein(GFP)was localized to the cell membrane in Arabidopsis protoplast cells.T-DNA insertion mutants of Atfao3 dis-
played less H2O2 content in leaves under controlled conditions and accumulated less ROS levels under oxidative or biotic
stress , compared to wild-type(WT)plants.Responded to bacterial pathogen , Atfao3 mutant increased growth of Pst
DC3000 and displayed a increased severity of disease symptoms as compared to WT plants.The Atfao3 mutant plants also
exhibited reduced expression of the defense-related PR1 , PR2 and PAL genes after pathogen infection.On the basis of
analysis of T-DNA insertion mutants ,we confirmed that AtFAO3 played a key role in defense against bacterial pathogens.
Key words:AtFAO3;T-DNA mutant;Plant defense;ROS
　　长链脂肪醇氧化酶(Long-chain fatty alcohol
oxadise ,FAO)参与长链脂肪酸或烷烃的 ω氧化途
径 ,催化ω-醇氧化生成ω-醛和H2O2 。FAO最初在工
业酵母(假丝酵母)中鉴定 ,在 Candida tropicalis基因
华北农学报·2009 , 24(6):1-5
组中存在两个 FAO 基因 , 分别命名为 FAO1 和
FAO2
[ 1]。重组表达的 FAO1 、FAO2两者的特异底物和
Km值相差很大。 C.tropicalis FAO 双突变体在葡萄
糖和 1 ,11-十一烷二羧酸培养基上与野生型没有差
异 ,但不能在 octadecane培养基上生长 ,在以十六烷
作为唯一碳源培养基上生长时积累六烷醇[ 2] 。
FAO以及同源类似物基因也广泛存在于陆生植
物基因组中[ 3] 。拟南芥基因组中存在四个 FAO同源
类似物基因 ,分别命名为 AtFAO1(At1g03990), AtFAO3
(At3g23410 ), AtAFO4a (At4g19380 ), AtFAO4b
(At4g28570)。大肠杆菌重组表达AtFAO3蛋白具有长
链脂肪醇氧化酶活性[4] 。水稻基因组中同样包含 4
个FAO同源类似物基因 ,分布在不同的染色体上[ 3] 。
百脉根(Lotus japonicus)基因组中存在两个 LjFAO 基
因 ,在大肠杆菌中重组表达 LjFAO1蛋白具有长链脂
肪醇氧化酶活性[ 5] 。在冷胁迫条件下 ,百脉根 Lj-
FAO1 和拟南芥 AtFAO3 、AtFAO4b 的转录水平降低 ,表
明FAO可能在植物对非生物胁迫相应中起作用[ 5] 。
然而 ,FAO在植物响应环境胁迫中起的作用还知之甚
少。本研究表明 ,与野生型相比 ,拟南芥AtFAO3突变
体削弱了对病原细菌的抗性 ,这表明 FAO在植物对
生物胁迫的防卫反应中也起重要作用 。
1　材料和方法
1.1　植物材料及培养
拟南芥 (Arabidopsis thaliana)野 生型 Col-0
(CS1092)及 Atfao3 突变体(SALK-123878C)由 Ara-
bidopsis Resource Center(Ohio State University , Bothell ,
WA ,USA;http://www.arabidopsis.org)提供 。经本实
验室繁种保存于 4℃冰箱 。种子经表面消毒后播在
MS琼脂培养基上 。15 d后 ,小苗移至包含蛭石的基
质中 。培养条件为:温度为 18 ～ 22℃,光照为 25 000
lx ,营养生长时光周期为 10 h/14 h(光/暗)。
1.2　病原细菌接种 、抗病性检测
丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas sy-
ringae pv.tomato DC3000 , Pst DC3000)由美国康乃尔
大学植病系 Steven V.Beer教授提供 ,于本实验室保
存备用。接种时 , Pst DC3000 在 NB 培养液中于
28℃振荡培养 7 h ,在室温下 5 000 r/min离心 5 min
收集菌体 ,注射接种时 ,将菌液稀释至浓度为1×106
cfu/mL ,用 2 mL 无针头注射器注射至叶片细胞间
隙。接种完毕后保湿 ,3 d 后观察病情发展 ,拍照 。
于接种后 3 d 剪取重量相近的植物组织 ,分离回收
细菌 ,计测细菌在植物体内的繁殖量。操作如下:叶
片在 70%乙醇中表面消毒 30 ～ 40 s , 无菌水漂洗
2 ～ 3次 ,晾干;叶片放入研钵中研碎 ,加 0.5 mL无菌
水 ,以10倍梯度稀释 ,分别取5 μL 点于 king′s medi-
um B培养基上 ,置 28℃培养箱内培养 48 h ,计数菌
落 ,计算细菌在组织内的数量(cfu/g)。
1.3　氧胁迫处理
百草枯(Paraquat ,Sigma-Aldrich),10μmol/L 水溶
液加 0.03%Silwet L-77喷施整株叶片 ,分别于 2 ,6
hpt检测叶片内 ROS 的积累 ,并于 24观察叶片表
型 ,拍照 。
1.4　叶片 ROS含量原位以及定量检测
取完整叶片浸入2 mL 5 μmol/L DCFH-DA(Sigma-
Aldrich)溶液中 ,真空抽滤直至溶液完全浸润整个叶片
为止 ,37℃保温 10min ,在荧光体视镜下观察并拍照。
组织叶片内 H2O2 含量测定按参考文献[ 6] 进
行。测定 415 nm下钛-过氧化物的比值变化。用已
知浓度的 H2O2做标准曲线。H2O2提取:取 1.0 g 鲜
样 ,加 2 mL 冷丙酮 , 冰浴研磨成匀浆 ,转入离心管
中 ,用6 mL冷丙酮分2次清洗研钵 ,转入离心管中 ,
3 000 r/min , 4℃离心 10 min ,上清即为 H2O2 。H2O2
测定:吸取 1 mL 提取液 ,加入(用连续加样器)0.1
mL TiCl4(20%浓HCl),0.2 mL NH4OH ,混匀后 ,3 000
r/min ,4℃离心 10 min ,倒掉上清 ,用冷丙酮 2 mL 洗
涤沉淀 ,在漩涡仪上振荡 , 3 000 r/min , 4℃离心 10
min ,反复洗涤 3 次 , 弃倒上清 , 加 5 mL 2 mol/L
H2SO4溶解沉淀 ,悬浮 ,待溶解后测 A415 。对照:取
1.0 mL 丙酮 , 加入 0.1 mL TiCl4 , 0.2 mL NH4OH ,
8 000 r/min , 4℃离心 10 min ,倒掉上清 , 用 5 mL 2
mol/L H2SO4 溶解沉淀 ,作为阳性对照 。
1.5　基因表达分析
总 RNA的抽提采用 Trizol试剂(Invitrogen)按照
说明书操作 ,取 2μg 经 DNase Ⅰ处理的总 RNA ,用
M-MLV(Promega)合成 cDNA 第一链 ,具体操作步骤
详见其操作说明 ,以 cDNA作为 RT-PCR模板 。不同
基因的表达水平采用 RT-PCR方法检测 ,以在真核
生物中高度保守并组成性表达的 EF1α基因为内
参。 PR1 、PR2 、PAL 、FAO3 和 EF1α引物详见表 1。
PCR程序如下:95℃, 5 min;95℃1 min;58℃1 min;
72℃1 min;25 ～ 30循环;72℃ 10 min。用凝胶成像
系统测定 RT-PCR产物凝胶电泳溴化乙锭(EB)染色
信号 ,估计基因表达相对水平 。
1.6　拟南芥原生质体亚细胞定位
用AtFAO3特异性引物(表1)扩增其全长 CDS序
列 ,并 XbaⅠ和 BamH Ⅰ内切酶亚克隆至 pBI121GFP 植
物表达载体[ 7] ,完成 AtFAO3-GFP 融合蛋白的载体构
建。拟南芥原生质体提取以及转化步骤详见参考文
2　 华　北　农　学　报 24卷
献[ 8] 。AtFAO3-GFP 融合蛋白在GFP 荧光下观察并 拍照(Olympus DH2-RFL-T3荧光显微镜)。
表 1　本研究使用的引物
Tab.1　Primers for genes used in this study
基因名称
Gene name
登录号
Locus code
引物序列
Primer sequences
循环数
Cycles
PR-1 At2g14610 5′-GCTCTTGTAGGTGCTCTTGT-3′
5′-ACACCTCACTTTGGCACATC-3′ 28
PR-2 At3g57260 5′-GCTTCCTTCTTCAACCACAC-3′
5′-TTGCGTTTTCCACACTCGTC-3 28
PAL1 At2g37040 5′-GGAGTGGACGCTATGTTATG-3′
5′-CATTGACGCCATTCCAGATC-3′ 28
AtFAO3 At3g23410 5′-GCTCTAGAATGGATAAGTACAAAGTC-3′
5′-CGGATCCATGAGATAAACCAGTGGTCA-3′ 35
EF1α AF181492 5′-TTCATCCTTCGCAACCCCTT-3′
5′-GGTTTTGTCTGTGGTCATAC-3′ 30
2　结果与分析
2.1　AtFAO3蛋白亚细胞定位
AtFAO3蛋白具有长链脂肪醇氧化酶活性 ,其氨
基酸序列缺少内质网 KDEL 或 HDEL 定位序列 ,也
不含目前已知的氧化酶体 、叶绿体和线粒体定位信
号;但 DAS程序分析表明在其氮端 200个氨基酸残
基中包含许多跨膜区域[ 4] ,这表明 AtFAO3很可能
是一个与细胞膜结合的蛋白。为了明确 AtFAO3蛋
白在拟南芥细胞中的定位 ,用 AtFAO3 特异性引物
(表 1)从野生型拟南芥 cDNA 中扩增其 CDS 全长 。
AtFAO3 CDS连入 T 载体经测序正确后 ,利用 Xba I
和 BamH I两个酶切位点亚克隆到 pBI121-GFP 植物
表达载体[ 7] ,完成AtFAO3::GFP 融合蛋白植物表达
载体的构建 ,其酶切图谱见图 1-A。
A.121GFP-AtFAO3载体酶切图谱;B.拟南芥原生质体细胞中 AtFAO3
蛋白的亚细胞定位;AtFAO3与 GFP偶联的融合蛋白定位与原生质体
细胞的细胞膜;上图.AtFAO3-GFP 和GFP 转化原生质体细胞荧光照
片;下图.原生质体细胞白光照片。
A.Diagram of 121GFP-AtFAO3 digestedwith restriction enzyme;B.Localiza-
tion of AtFAO3 in Arabidopsis protoplast.AtFAO3 was fused with green fluo-
rescent protein(GFP)to yield AtFAO3-GFP protein.This chimeric protein was
localized in the cell membrane of protoplast.A fluorescence image of the pro-
toplast cells transformedwith AtFAO3-GFP andGFP is shown in the top pan-
els.And a bright image of shown in the bottom panel.
图 1　AtFAO3 亚细胞定位
Fig.1　Localization of AtFAO3 protein in vivo
利用 PEG 介导的原生质体瞬时表达方法[ 8] ,在
拟南芥叶片原生质体中瞬时表达 AtFAO3::GFP 融
合蛋白和GFP 蛋白 。图 1-B 显示 ,GFP 单个蛋白绿
色荧光出现在整个细胞中 ,而 AtFAO3::GFP 融合蛋
白的绿色荧光集中在细胞膜周围 ,这表明 AtFAO3
在拟南芥叶片原生质体细胞中定位于细胞膜。
2.2　AtFAO3 突变体体内活性氧含量降低
为了进一步研究 AtFAO3在拟南芥生长发育以
及对环境胁迫中的作用 ,从拟南芥研究中心(www.
arabidopsis.org)获得该基因插入纯合突变体 SALK-
123878C。根据 ATIDB(Arabidopsis thaliana Integrated
Database)提供的信息 ,得知 Atfao3(SALK-123878C)
突变体为反向插入 ,插入位点位于 Atfao3 基因组第
二个内含子 。在正常生长条件下 , Atfao3 突变体植
株与野生型在植株大小 、开花时间等表型上没有显
著差异(图 2-A)。由于长链脂肪醇氧化酶催化反应
能产生H2O2 ,因此我们检测 Atfao3 突变体与野生型
拟南芥(Col-0)植株叶片中 H2O2 含量 。检测结果表
明 , Atfao3 突变体植株叶片中H2O2 含量显著低于野
生型植株(图 2-B)。为了进一步明确 AtFAO3 在植
株体内活性氧含量中的作用 , 我们分别用百草枯
(Paraquat)处理 40 d Atfao3 突变体与野生型植株。
百草枯是一种广谱的除草剂 ,其作用机理是喷施植
物绿色部位后迅速诱导植株体内活性氧的爆发 ,从
而破坏植株的细胞结构 ,最后导致植株萎蔫死亡。
用百草枯处理植株后 ,用对活性氧敏感的 DCFH-DA
荧光染料来检测植株体内活性氧的含量 。结果表
明 , Atfao3 突变体植株处理百草枯后 ,在 2 hpt 和 6
hpt时 ,叶片中积累的活性氧含量显著低于野生型植
株(图 2-C)。百草枯处理 24 h 后 ,植株的症状也显
示出 Atfao3 突变体植株受体内氧胁迫伤害明显轻
于野生型植株(图 2-C)。这表明 ,AtFAO3在植株体
内活性氧代谢平衡中起重要作用 。
2.3　拟南芥 Atfao3 突变体减弱对病原细菌抗性
活性氧是植物响应环境胁迫(非生物胁迫或生
物胁迫)的重要信号分子 ,转录调控一系列防卫基因
6期 孙　枫等:拟南芥长链脂肪醇氧化酶 (AtFAO3)在抗病防卫反应中的作用分析 3　
的表达激活植物防卫反应[ 9] 。由于 Atfao3 突变体
植株体内活性氧含量显著低于野生型 ,推测 AtFAO3
可能在植物对生物胁迫的防卫反应中起作用 。用
P .syringae pv.tomato毒性菌株 DC3000接种野生型
及 Atfao3 突变体植株 ,解析 AtFAO3 在植株抗病性
中的作用。结果表明 ,接种 DC30003 d后 , Atfao3 突
变体植株叶片出现大面积水渍症状 ,而野生型叶片
水渍症状并不显著(图 3-A)。叶片中细菌繁殖数量
也表明 , Atfao3 突变体内细菌数量显著高于野生型
(图 3-B),这表明与野生型相比 , Atfao3 突变体对病
原细菌更敏感 ,削弱了植物对病原细菌的防卫能力 。
A.在正常生长环境中 , 3周大小 Atfao3 突变体与野生型拟南芥植株
表型;B.正常生长状态下 , Atfao3 突变体与野生型植株中叶片中
H2O2 含量测定;C.上图和中间:10μmol/ L 百草枯(Paraquat)处理后 2
h 或 6 h , Atfao3 突变体与野生型植株中叶片中活性氧含量;下图.百
草枯处理后 24 h , Atfao3 突变体与野生型植株症状。
A.Photographs of three-week-old Atfao3 mutants and wild-type(WT)Ara-
bidopsis plants under controlled conditions;B.Analysis H2O2 content in leaves
of Atfao3 mutants and WT;C.Top andmiddle:Accumulated ROS contents in
leaves of Atfao3 mutants and WT plants 2 or 6 hour post treatment(hpt)with
10μmol/L Paraquat;Bottom:Development of symptoms of leaf inWT and At-
fao3 mutants plants treatment with 10 μmol/ L Paraquat.Picture of treated
plants were taken at 24 dpt.
图 2　Atfao3 突变体植株体内活性氧含量低于野生型
Fig.2　Atfao3 mutant
displayed less ROS contents in leaves
　　利用 DCFH-DA原位染色检测植株叶片中的活
性氧含量表明 ,毒性病原细菌 DC3000接种 24 h后 ,
野生型植株体内的活性氧含量显著高于 Atfao3 突
变体(图 3-C)。防卫相关基因例如 PR1 、PR2 和
PAL1 的诱导表达 ,是植物防卫反应的分子标志[ 9] 。
用RT-PCR方法检测了 DC3000处理野生型和 Atfao3
突变体防卫反应基因 PR1 、PR2 、 PAL1 的表达情
况。如图 3-D所示 ,接种 DC3000 0 hpi , PR1 、PR2 和
PAL1 3个基因在两个品系间均没有显著变化;但 12
或 24 hpi后 , 3个基因在 Atfao3 突变体中的表达水
平明显低于野生型。以上研究结果表明 , Atfao3 突
变体植株减弱了对病原细菌的防卫能了 ,AtFAO3在
植物对生物胁迫的响应中起重要作用。
A.野生型(Col-0)和 Atfao3 突变体拟南芥接种Pst DC3000(OD600=
0.001)3 d后 ,叶片症状图片;B.植株体内细菌繁殖数量。野生型
(Col-0)和 Atfao3 突变体拟南芥接种Pst DC3000 ,检测 3 d叶片中细菌
数量 ,用每克叶片中菌落形成克隆的对数值来表示;C.野生型(Col-
0)和 Atfao3 突变体拟南芥接种Pst DC3000 24 h后 ,活性氧含量检测;
D.野生型(Col-0)和 Atfao3 突变体拟南芥接种Pst DC3000后 , RT-PCR
分析防卫基因(PR-1 , PR-2 , PAL)的表达。
A.Leaves disease symptom development inwi ld-type Col-0(WT), Atfao3 mu-
tants plants inoculatedwith Pst DC3000(OD600=0.001).Picture of whole
plant inoculated leaves were taken at 3 dpi;B.In planta Pst population.Loga-
rithmic numbers of bacteria recovered from leaves of plants at 3 dpi with Pst
DC3000 were quantified versus fresh weight(FW)of leaves and are shown as
mean SD(n=3 repeat);C.Observations on ROS in leaves of WT and Atfao3
mutants 24 h post inoculatedwith Pst DC3000;D.RT-PCR analysis of PR-1 ,
PR-2 and PAL expression in WT and Atfao3 mutants following inoculated
with Pst DC3000.Total RNA was isolated from inoculated leaves harvested at
indicated times after inoculation.Reverse transcription-polymerase chain reac-
tion(RT-PCR)was carried out using EF1αas a standard.
图 3　Atfao3 突变体削弱了对病原细菌的防卫能力
Fig.3　Atfao3 mutant undermined
defense against Pst DC3000
3　讨论
长链脂肪醇氧化酶(FAO)最初在能够利用烷烃
或长链脂肪酸为碳源进行生长的酵母中鉴定 ,该酶
参与酵母细胞中烷烃或脂肪酸的ω-氧化 ,把羟基氧
化成醛[ 1] 。之后 ,在拟南芥和豆科模式植物百脉根
中克隆到与酵母长链脂肪醇氧化酶同源性较高并且
催化功能类似的酶[ 4 ,5] 。最近的研究表明 ,FAO 在
植物响应环境胁迫中起重要作用 。拟南芥转录组学
芯片数据表明 ,环境中生物胁迫和非生物胁迫例如
冷处理影响 AtFAO3 和 AtFAO4b 的表达[ 11] 。百脉根
幼苗受冷胁迫处理后 , LjFAO1 在子叶和顶端分生组
织中表达受抑制[ 5] 。本研究表明 ,拟南芥 AtFAO3 T-
DNA 插入突变体 Atfao3 削弱了对病原细菌 Pst
4　 华　北　农　学　报 24卷
DC3000的抗性 。与野生型(Col-0)相比 , Atfao3 突变
体接种Pst DC3000后叶片中细菌繁殖数量增加 ,病
害症状加重 , 防卫反应基因表达减弱 , 这表明 At-
FAO3 正调控拟南芥对病原细菌防卫反应 。由于拟
南芥中含有 4个 FAO 基因 ,其他 FAO 基因是否在
植物对生物胁迫反应中起AtFAO3 类似的作用 ,还需
要更多的研究。
以H2O2为主要活性分子的活性氧作为植物细
胞中重要的信号分子 ,调控植株生长发育以及对环
境胁迫反应的各个信号传导途径[ 9] 。而 FAO氧化
烷烃或脂肪酸能产生 H2O2 ,因此检测 Atfao3 突变体
和野生型体内 H2O2 或活性氧的含量。研究结果表
明 ,无论在正常生长状态还是在氧胁迫或生物胁迫
压力下 , Atfao3 突变体叶片中 H2O2或活性氧含量都
低于野生型植株 。这表明 AtFAO3在拟南芥体内氧
化还原平衡中起重要作用。 Atfao3 突变体体内活性
氧含量减少伴随着对病原细菌抗性减弱 ,但这两者
的相互关系仍需更多的试验来证明。总之 , Atfao3
突变体植株防卫反应的研究表明 ,AtFAO3在植物对
病原细菌的防卫反应中起重要作用 。
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