全 文 ：分子植物育种，2010年，第 8卷，第 5期，第 846-852页
MolecularPlant Breeding, 2010, Vol.8, No.5, 846-852
研究论文
AnArticle
碱茅 Put-HVA1基因的克隆及在酵母和拟南芥中的表达
刘小立 1 柳参奎 1* 高野哲夫 2
1东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心,哈尔滨, 150040; 2东京大学亚洲生物资源环境研究中心,东京, 1880002,日本
*通讯作者, shenkuiliu@ nefu.edu.cn
摘 要 本研究从碱茅(Puccinellia tenuiflora) cDNA文库中分离得到 Put-HVA1基因，其开放读码框(ORF)
长 534 bp，共编码 177个氨基酸，其预测分子量约为 18.167 kD，理论等电点约为 7.80。氨基酸序列比较结果
表明，Put-HVA1氨基酸序列与水稻、玉米的 HVA1蛋白氨基酸序列的同源性分别为 69%和 56%。另外，将
Put-HVA1基因构建到酵母表达载体 pYES2和植物双元表达载体 pBI121上，并分别转化至酵母(INVSc1)和
拟南芥(Arabidopsis thaliana)。对 pYES2-Put-HVA1转化酵母进行盐碱、氧化胁迫、渗透胁迫及干旱处理，结果
表明：重组酵母提高了对盐碱、氧化、渗透胁迫及干旱等逆境的适应能力。对部分转基因株系进行了抗盐性
试验，表明转 Put-HVA1基因拟南芥在 150 mmol/LNaCl和 5 mmol/LNaHCO3胁迫下长势优于野生型拟南
芥，表现出一定的耐受性。
关键词 碱茅, HVA1,酵母,拟南芥,逆境
Cloning of a LEA Related Gene HVA1 fromAlkali Grass and its Expression
in Yeast and Arabidopsis
LiuXiaoli 1 Liu Shenkui 1* Tetsuo Takano 2
1 Alkali Soil Natural Environmental Science Center, Northeast Forestry University, Harbin, 150040; 2 Asian Natural Environment Science Center
(ANESC), University of Tokyo, Tokyo, 1880002, Japan
* Corresponding author, shenkuiliu@nefu.edu.cn
DOI: 10.3969/mpb.008.000846
Abstract We cloned the full sequence of cDNA sequence of HVA1 gene from alkali grass (Puccinellia tenuifolra)
in this study. The HVA1 gene is 1 176 bp in length. It has an open reading frame (ORF) of 534 bp, encoding a pro-
tein of 177 amino acid residues, with protein molecular weight of 18.167 kD and isoelectric point of 7.80. Com-
parison of the deduced amino acids sequence of HVA1 porcine with those of rice and corn revealeded that the
amino acidshomology 69%and 56%, respectively. At the same time, we constructed Put-HVA1 gene to pBI121
vector, and transformed the recombinant plasmid pBI121-Put-HVA1 into Arabidopsis. The recombinant yeast IN－
VSc1 (harboring pYES2-Put-HVA1) and control INVSc1 (harboring empty pYES2) were treated with salt, droug-
ht, osmosis and oxidation stresses. The results revealed that the recombinant yeast cells have a higher stress resis-
tance than control cells. It also proved that the HVA1 from alkali grass has the ability of salt, drought, osmosis and
oxidation resistance. Transgenic Arabidopsis over-expression the Put-HVA1 gene shown greater salt tolerance than
wild-type plants in the 1/2MS mediumwith 150 mmol/LNaCl and 5 mmol/LNaHCO3.
Keywords Alkali grass (Puccinellia tenuifolra), HVA1, Yeast, Arabidopsis thaliana, Stress resistance
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基金项目：本研究由国家林业局 948项目(2008-4-29)和黑龙江省杰出青年科学基金(JC200609)共同资助
LEA (late-embryo genesis-abundant protein)蛋白
最初是在棉花中被发现的，是在正常性种子发育后
期、伴随脱水干燥过程形成的一类低分子量蛋白，它
广泛存在于高等植物中，已先后在小麦(Curry et al.,
1991)、大麦 (Hong et al., 1988)、番茄 (Godoy et al.,
1994)、大豆(Hsing et al., 1992)和胡萝卜(Franz et al.,
1989)等近二十种高等植物(Dure et al., 1989)发育种
子中检测到。LEA蛋白出现在胚发育的晚期，随种子
的脱水程度上升而增加，在种子吸水萌动的几个小时
后消失。此外，离体胚和许多营养组织在外源ABA、渗
透或低温胁迫的诱导下也能产生特异的 LEAmRNA
和 LEA蛋白，表明 LEA蛋白虽是阶段发育专一的，但
可以被诱导，且无组织专一性，同时也表明 LEA蛋白
是一种与逆境相关的蛋白(Bray, 1993)。
以普遍存在的氨基酸序列域为基础，Lea蛋白通
常被分为 6组，碱茅 HVA1基因，属于第 3组 Lea蛋
白。HVA1基因属于第 3组 LEA蛋白基因，第 3组
LEA蛋白的基元序列可形成兼性 α-螺旋结构，提供
具有疏水条区的亲水表面，亲水的部分形成双聚体，
外层带电荷的部分在细胞处于缺水状态下中和浓度
过高的离子(Bakeret al., 1988)。此外，组成该蛋白的大
多数氨基酸残基为碱性、极性和带电荷具有亲水性的
氨基酸，这些高电荷氨基酸残基可以结合细胞内水分
子和过多的盐离子，避免干旱胁迫时细胞内高浓度离
子对细胞和细胞结构引起的损伤，同时也防止组织过
度脱水(IngramandBartels, 1996)。
很多研究报道 HVA1基因的表达与缺水、盐碱
及干旱胁迫相关。如 Xu等(1996)利用基因枪法将大
麦的 LEA基因 HVA1导入水稻(Oryza sativa)的悬浮
细胞系后，发现转基因水稻植株的抗旱和耐盐能力
大大提高，该基因的抗旱、耐盐功能在烟草(李楠等,
2007)和桑树(Lal et al., 2008)中也得到了实验证实。
Sivamani等(2000)将 HVA1基因的 cDNA导入到春
小麦(Triticum aestivum L.)中，结果表明，在缺水条件
下，转基因小麦的水分利用率和生物量均优于对照
组。Zhang等(2000)等发现大麦第三组 LEA蛋白基
因 HVA1可以提高该转基因酵母在 1 mol/L KCl 和
1 mol/LNaCl培养基上的长势。Rohila等(2002)将大
麦 HVA1基因转入水稻中，相比较野生型植株转基
因植株可以更好地保留叶片中的水分并且能减少细
胞中电解质的流失，这表明 HVA1基因可能可以保
护细胞膜防止其受到干旱的损伤。Maqbool等(2002)
的研究表明将 HVA1基因转入燕麦(Avena sativa L.)
可以提高转基因植株的抗盐抗旱能力。王俊丽等
(2003)用基因枪法将 HVA1 基因导入草莓(Fragaria
ananassa Duch.)的花药诱导的愈伤组织中，经过 4次
PPT除草剂的筛选培养，得到了抗性愈伤组织及再
生植株。陈火英等(2006)将 HVA1基因的 pBY520质
粒 DNA导入栽培番茄‘鲜丰’，实验数据表明转基因
植株具有一定的耐盐性。刘祥久等(2005)用开苞导入
法将抗旱耐盐基因 HVA1 DNA导入到稳定的玉米
自交系中，经过对其后代进行的抗旱性实验，发现各
自交系的抗旱性能都有所提高。Fu等(2007)通过两种
从 ABA-response complex (ABRC3)中分离出的 ABA
诱导型启动子，ABA1、ABA2 以及一个玉米 Ubi-1
组成型表达启动子连接下游报告基因在匍匐剪股颖
(Agrostis stolonifera) 中瞬时或固定表达 HVA1基因，
实验表明 T0代植株中，虽然在正常水份给予情况下，
逆境应答型相比于组成型表达量少，但在缺水情况
下逆境应答型表达呈现上调。实验结果还表明无论
是组成型表达还是逆境应答型表达都可以减少水份
缺乏对匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)的损伤。
本研究从碱茅(Puccinellia tenuiflora)中克隆到
LEA蛋白相关基因，因与已发现的大麦中的 HVA1
基因同源性较高，故命名为 Put-HVA1，并通过酵母
和拟南芥表达系统对该基因的功能进行了初步的解
析，以期为碱茅 Lea蛋白对逆境应答的研究奠定一
定基础。
1结果与分析
1.1碱茅 Put-HVA1基因的克隆及全序列分析
构建碱茅用碳酸盐处理 cDNA文库，经过规模
化序列分析，分离得到 Put-HVA1基因，其基因全长
为 1 176 bp，开放阅读框是 534 bp，编码了 177个氨
基酸，预测的分子量大小为 18.167 kD，理论等电点
是 7.80。
在蛋白质数据库中通过 BLAST对 Put-HVA1基
因编码的蛋白的氨基酸序列来进行同源性检索
(NCBI)，结果表明：Put-HVA1基因编码蛋白的氨基
酸序列与水稻(登录号: 4339480, Os05q0542500, 69%
同源性 )、玉米 (登录号 : 100280554, Loc100280554,
56%同源性;登录号: 542216, mlq3, 56%相似性)、拟
南芥(登录号: 841701, AT1G52690, 58%相似性)都具
有较高同源性(图 1)，这 4 个基因都属于 LEA蛋白
相关基因。
通过 PSORT (prediction of protein localization si-
tes)软件来预测 Put-HVA1基因编码的蛋白在细胞内
的存在位置，我们得到 4个结果，Put-HVA1基因编
码的蛋白可能存在于：(1)细胞质(可信度=0.650)；(2)
叶绿体基质(可信度=0.200)；(3)叶绿体类囊体膜(可
信度=0.200)；(4)叶绿体类囊体基质(可信度=0.200)。根
据得到的结果，Put-HVA1基因编码的蛋白存在细胞
质的可能性最大。据 TMHMM v.2 预测，Put-HVA1
编码的蛋白为一种非跨膜蛋白，这一特性与其它植
碱茅 Put-HVA1基因的克隆及在酵母和拟南芥中的表达
Cloning of a LEA Related Gene HVA1 fromAlkali Grass and Its Expression in Yeast and Arabidopsis 847
分子植物育种
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物中发现的 HVA1蛋白相一致。
1.2 pYES2-Put-HVA1载体的构建及 Put-HVA1 基
因在酵母 INVScI中的表达
pYES2是专门为检测重组蛋白在酵母中的诱导
表达而设计的酵母表达载体。该载体特异的诱导型
启动子 GAL1，在葡萄糖存在下抑制重组蛋白表达；
而在半乳糖存在时，启动子会高效表达重组蛋白。利
用酵母表达载体 pYES2，将 Put-HVA1基因构建到该
载体上，用 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切重组质粒 pYES2-
Put-HVA1，电泳检测插入片段的正确性，正确切下的
图 1碱茅 Put-HVA1基因所编码的氨基酸序列的差异比较
Figure 1 The difference comparision of amino acids sequences of Put-HVA1 from alkali grass (Puccinellia tenuifolra)
DNA片段大小约为 534 bp左右，证实获得重组质粒。
为检测重组质粒 pYES2-Put-HVA1在酵母中的
表达，实验将 pYES2-Put-HVA1酵母转化体分别在
YPD和 YPGAL培养基中进行培养，收集菌液，提取
酵母总 RNA并进行 Northern blot。经过 Northern杂
交检测显示，在含有 2%葡萄糖的 YPD培养基上生
长的 pYES2-Put-HVA1重组基因不能表达，而在含有
2%半乳糖的YPGAL诱导培养基中有较高表达(图 2)。
1.3 pYES2-Put-HVA1在酵母中表达及其抗逆性分析
酵母是单细胞真核生物并与植物有着类似的代
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碱茅 Put-HVA1基因的克隆及在酵母和拟南芥中的表达
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谢途径，遗传操作简单易行，同时，它能对外源蛋白
进行翻译后加工和修饰，具有不需要特殊培养基即
能够迅速生长等优点，是外源蛋白表达的合适宿主。
因此，本研究利用酵母表达体系开展了转化酵母对逆
境的耐性实验。将含有 pYES2-Put-HVA1和pYES2
的酵母菌(阴性对照)以不同浓度分别培养于上述不
同逆境处理的 YPGAL培养基中，进行抗逆性分析。
结果如图 3所示。正常情况下，含 pYES2-Put-HVA1
和 pYES2的酵母菌在无逆境处理的 YPD培养基上
生长情况相似。但在 0.6 mol/L、1.0 mol/LNaCl胁迫
下转 pYES2-Put-HVA1酵母长势明显好于转 pYES2
的酵母。说明 Put-HVA1的表达提高了酵母菌株在盐
胁迫下的存活能力。在干旱逆境(5%PEG)、氧化逆境
(3.6 mmol/L, 5.4 mmol/L H2O2)、渗透胁迫 (1 mol/L,
1.25 mol/LSorbitol)、及碳酸盐(12 mmol/L, 24 mmol/L
Na2CO3)碳酸氢盐(20 mmol/L, 30 mmol/L NaHCO3)等
逆境下，转 pYES2-Put-HVA1 均长势明显优于转
pYES2，这说明 Put-HVA1基因的表达对酵母在环境
胁迫中的生长发挥重要作用。这些结果暗示了
Put-HVA1在酵母中过量表达能够提高其对干旱、氧
化、盐逆境的耐性。
1.4转 Put-HVA1基因拟南芥植株鉴定及耐受性分析
经 50 mmol/LKan抗性继续筛选的 T1代植株叶
片 DNA以 CaMV35S启动子序列设计的上游引物
图 2 Northern杂交检测 Put-HVA1在酵母中的表达
注 : A: Northern 杂交检测 ; B: RNA; CK: 葡萄糖诱导表达
pYES2-Put-HVA1; 1:半乳糖诱导表达 pYES2-Put-HVA1
Figure 2 The expression of pYES2-Put-HVA1 in yeast was con-
firmed by Northern blot
Note: A: The result of Northern blot; B: RNA; CK: The expres-
sion of pYES2-Put-HVA1 in yeast incubated in YPD induction
medium; 1: The expression of pYES2-Put-HVA1 in yeast incu-
bated in YPGAL inductionmedium
图 3非生物逆境下 Put-HVA1基因的过量表达
注: Control:转化 pYES2-Put-HVA1和 pYES2的酵母菌在 YPD培养基上的生长状况(2~3 d; 30℃);其它图表示转化 pYES2-
Put-HVA1和 pYES2的酵母菌在添加 NaCl, PEG, H2O2, NaHCO3, Sorbitol或 Na2CO3等逆境处理的 YPGAL培养基上的生长状
况(2~3 d; 30℃)
Figure 3 Hyper-resistance of Put-HVA1-overexpressing cells to various abiotic stresses
Note: Control: Yeast cells contain pYES2-Put-HVA1 and pYES2 vector incubated in YPD medium, Growth was monitored for 2~3 d
at 30℃; The others represent yeast cells contain pYES2-Put-HVA1 and pYES2 vector incubated inYPGALmedium supplemented with
different concentrations of NaCl, PEG, H2O2, NaHCO3, Sorbitol orNa2CO3 as indicated, growth was monitored for2~3 d at 30℃
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分子植物育种
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5-CCCACAGATGGTTAGAGAGGCT-3，以及根据
Put-HVA1基因设计的下游引物 5-CTAGCGATCCC
TGGTGATCTTG-3进行 PCR扩增，经琼脂糖凝胶
电泳显示在约 534 bp处出现清晰条带(结果未列出)，
Put-HVA1基因已经完整地整合到拟南芥中。为了验
证转 Put-HVA1基因拟南芥的耐受性，我们随机选取
了纯合子比例很高的 T3代的 1、7和 11三个转基因
株系进行了初步的耐受性实验。首先，将野生型及转
基因植株种子同时置于 1/2MS培养基上发芽，7 d后
将幼苗分别转移到无任何添加 1/2MS培养基、含有
100 mmol/L、150 mmol/LNaCl的 1/2MS培养基以及
5 mmol/LNaHCO3的 1/2MS培养基上进行培养。结果
显示：在无处理的 1/2MS培养基上，野生型拟南芥长
势与 3个转基因株系长势无显著差异(图 4A)。但在一
定胁迫处理下两者的长势发生了变化，在 5 mmol/L
NaHCO3培养基中野生型拟南芥较转基因拟南芥相
比生长缓慢，根系较短(图 4B)。从图中可以看出转
Put-HVA1 基因植株对 NaCl 具有一定耐受性，在
100 mmol/L、150 mmol/LNaCl培养基上转基因植株
均优于野生型(WT)，以 150 mmol/ NaCl最为明显，该
培养基上野生型植株根长较短，生长缓慢 (图 4C;图
4D)。Put-HVA1基因在拟南芥中过量表达能够不同程
度的提高对 NaCl、NaHCO3逆境的耐性。
2讨论
从耐盐耐干旱植物中分离抗逆性功能基因是研
究植物抗盐机制，并且通过基因工程手段提高植物
耐受性的关键。碱茅(Puccinellia tenuiflora)是一种具
有很强的耐盐碱能力的植物，经人工种植的碱茅可
在 pH 10以上的碱斑地上正常生长发育，而且种植
碱茅对盐碱土壤具有改良作用，种草后土壤含盐量下
降，pH值降低(李艳波, 2008;王艳梅和李果珍, 2001)。
LEA蛋白是一种在胚胎发育后期高效表达的低分
子量蛋白，这个时期恰好是正常种子抵御极端干燥
脱水的阶段，所以 LEA蛋白的相关基因常常与耐旱
相联系。
本研究中，通过对转 Put-HVA1基因酵母在各种
逆境胁迫下的耐受性分析，发现在盐碱、干旱、氧化
及渗透胁迫等多重逆境下，Put-HVA1基因均可以提
高转基因酵母的生长能力。同时转 Put-HVA1基因拟
南芥的抗盐性试验结果表明，转 Put-HVA1基因拟南
芥在 150 mmol/LNaCl及 5 mmol/LNaHCO3胁迫下，
长势优于野生型拟南芥，表现出一定的耐受性。以上
结果表明，Put-HVA1与提高真核生物抗逆性有一定
的应答关系，为以后的研究奠定了一定的基础。以后
研究可以考虑在蛋白质水平上研究该基因的特性，以
期揭示 Put-HVA1基因提高生物抗逆性的机理。
虽然目前对 Put-HVA1基因是通过何种方式来保
护细胞免受逆境侵害的机理尚不清楚，但根据已知的
其它植物中类似 HVA1 基因的研究，我们推断，
Put-HVA1基因可能通过如下方式在植物遭受逆境胁
帮助细胞抵御外界损伤：
(1) HVA1 基因可能与保护膜的稳定性有关。
Rohila等(2002)和 Babu等(2004)将大麦 HVA1基因
转入水稻中，相比较野生型植株转基因植株可以更
好地保留叶片中的水分并且能减少细胞中电解质的
流失，这表明 HVA1基因可能可以保护细胞膜，防止
其受到干旱的损伤。
(2) HVA1基因可能通过结合某些离子来保护细
胞。细胞脱水的结果之一就是导致细胞内某些离子
的浓度变大，从而破坏细胞内某些大分子的结构和
功能。根据对 LEA3蛋白的结构的研究和预测，LEA3
极可能通过束缚某些离子来保护脱水细胞 (Dure,
1993; Danyluk et al., 1998)，Wise (2003)和 Tunnacliffe
等(2005)通过 POPP分析还表明，LEA3蛋白可能是
在液泡中磷酸化后结合 Ca2+。因此在今后的研究中，
我们还需要对上述推断进行更可靠的论证。
图 4 Put-HVA1基因的表达提高转基因拟南芥的耐受性
注: A: 1/2MS培养基; B: 1/2MS+5 mmol/LNaHCO3; C: 1/2MS+
100 mmol/LNaCl; D: 1/2MS+150 mmol/LNaCl;WT:野生型拟
南芥; 1,7,11:转基因植株
Figure 4 Expression of Put-HVA1 gene increase the tolerance to
stress of the transgenic plants
Note: A: 1/2MS medium; B: 1/2MS +5 mmol/L NaHCO3; C:
1/2MS+100 mmol/L NaCl; D: 1/2MS+150 mmol/L NaCl; WT:
Wild type; 1,7,11: Transgenic plants
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3材料与方法
3.1植物材料与菌株
碱茅根的 cDNA文库(150 mmol/LNaHCO3处理,
由本实验室构建,数据尚未发表)，大肠杆菌(E. coli)
JM109、酵母表达载体 pYES2、植物表达载体 pB1121
(Clontech)、酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株 INVS－
cl (Clontech)、农杆菌菌株 EHA105 (Clontech)、各种限
制性内切酶购于 MBI；胶回收试剂盒 T载体购于
TaKaRa。
3.2碱茅 Put-HVA1基因的克隆及全序列分析
以文库 PGCAP10载体通用引物，上游引物(F)
5-ACTGCTCCTCAGTGGATGTT-3，下游引物(R)
5-CCCTCACTAAAGGGAGATCC-3为引物，以碱
茅根 cDNA 文库分离得到 PGCAP10-Put-HVA1 质
粒(S04106_xx_xx)为模板进行 PCR扩增，并克隆到
pMD18-T (TaKaRa)载体上。并送往公司测序。之后
利用生物学相关网站和软件，对碱茅 HVA1基因的
同源性进行预测。
3.3碱茅 Put-HVA1基因的表达载体构建及转化
利用 pT-Put-HVA1重组质粒进行 PCR，上游引
物：5-GGATCCATGGCCTCCAACCA-3，下游引
物：5-CTCGAGCTAGCGATCCCTGG-3，使 Put-HV-
A1的 ORF两端添加 BamHⅠ和 XhoⅠ酶切位点。连
接到 pYES2载体上，获重组质粒 pYES2-Put-HVA1。
同样以 pT-Put-HVA1重组质粒为模板，上游引物：
5-GGATCCATGGCCTCCAACCA-3，下游引物：
5-GAGCTCCTAGCGATCCCTGG-3，使 Put-HVA1
的 ORF两端添加 BamHⅠ和 SacⅠ酶切位点。连接到
pB1121载体上，获得重组质粒 pB1121-Put-HVA1。分
别转入相应宿主菌株 INVScI、EHA105。
3.4 Northern 杂交检测 Put-HVA1 基因在酵母 IN－
VScI中的转录表达
特异性探针的设计及合成：根据 Put-HVA1基因
碱基序列信息，设计特异性探针上游引物为 ATGGC
CTCCAACCAGAACCA，下游引物为 CTAGCGATC
CCTGGTGATCTTG。探针标记采用 DIGDNA PCR
labeling kit试剂盒进行标记。使用两次扩增法扩增。
酵母总 RNA的提取和 Northern blot分析：提取
酵母总 RNA，进行 RNA的变性电泳，转膜、杂交、洗
膜及信号检测。
3.5转 Put-HVA1基因酵母和拟南芥的抗性分析
分别取起始OD600约为 0.6的 pYES2-Put-HVA1
和载体 pYES2的 10-1、10-2、10-3、10-4和 10-5的酵母菌
液于 0.6 mol/L和 1.0 mol/LNaCl、5%PEG、3.6 mmol/L
和 5.4mmol/LH2O2、20mmol/L和 30mmol/LNaHCO3、
1mol/L和 1.25mol/LSorbitol、12mmol/L和 24mmol/L
Na2CO3的 YPGLA培养集中，30℃培养 1~2 d。观察
其生长状态。
根据孟德尔遗传规律，转基因植株在 T3代时，纯
合子比例已经很高，因此选取 T3 代种子播种于
1/2MS培养基中培养，至 4叶龄(7 d)时，将其移入分
别添加 100 mmol/L、150 mmol/L、175 mmol/L NaCl、
5 mmol/L NaHCO3及 10 mmol/L Na2CO3 1/2MS培养
基中，观察其生长势变化，进行转 Put-HVA1基因拟
南芥植株的抗盐碱性分析。
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