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论 文 第 50卷 第 17期 2005年 9月
www.scichina.com 1863
拟南芥 QRAP2基因的克隆、表达、DNA结合能力
及体外转录活性分析
魏 刚 雷 娟 巩 威 朱玉贤*
(北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室, 北京 100871. * 联系人, E-mail: zhuyx@water.pku.edu.cn)
摘要 通过对拟南芥 ATH1 基因芯片数据的分析, 从拟南芥中鉴定到一个受干旱胁迫高水平诱导的
cDNA片段, 并用 RACE方法获得了其全长 cDNA. PCR及定量实时 PCR分析表明, 该基因在经干旱、
紫外线照射、脱落酸、高盐以及水杨酸等胁迫条件处理后表达量均有显著提高, 特别是干旱处理后短时
间内表达量迅速提高, 3 h后即提高到对照样品的 430多倍. 通过多序列比对和系统进化分析, 我们将该
基因归于 DREB亚家族. 由于该基因编码蛋白含有典型的 AP2/EREBP DNA结合结构域, 并在 N端有
一段富含谷氨酰氨残基的区域, 所以将它命名为 QRAP2 (Glutamine-rich AP2). 凝胶阻滞实验结果显示,
QRAP2蛋白能够特异结合 DRE顺式元件序列但不能与mDRE和 GCC等非相关元件结合. 酵母单杂交
实验表明, QRAP2蛋白全长序列或其N端 112个氨基酸与GAL4 DNA结合结构域形成的融合蛋白表现
出转录激活功能, 而其 C端 135个氨基酸与 GAL4 DNA结合结构域的融合蛋白则没有表现出转录激活
活性. 现有资料的分析表明, QRAP2是 AP2/EREBP转录因子家族的新成员, 可能在干旱胁迫条件下参
与激活相关下游基因的表达.
关键词 QRAP2 胁迫 DREB 酵母单杂交 转录因子
干旱是影响植物生长发育的重要环境胁迫因子.
为了适应或抵抗干旱 , 植物会做出一系列适应性的
反应来减轻缺水带给细胞的伤害 . 近年来的研究表
明, 许多基因的表达受到干旱胁迫的诱导. 这些基因
的编码蛋白既包括水通道蛋白[1]、LEA蛋白[2]、蔗糖
合成酶[3]等功能蛋白, 也包括蛋白激酶[4]、磷脂酰肌
醇[5]、转录因子[6]等调控因子. 这些基因组成了复杂
的调控网络, 并通过一系列信号转导过程, 将干旱胁
迫这种非生物因子转变成对于某些或某类特定基因
的诱导表达或抑制 , 从而调节植物体内相关的生理
生化反应, 增强植物对胁迫的耐受性[7].
研究表明 , 许多干旱或低温应答基因如 kin1,
cor6.6, rd17, rd29A等基因的诱导表达与其启动子区
域含有的 DRE 元件有直接关联. DRE 元件或含有
DRE 核心序列(CCGAC)的元件可以在植物中传递对
干旱、低温已及高盐等胁迫条件的应答, 而这种应答
是不依赖于植物体在受到胁迫后自身产生的 ABA 的
作用[8~12]. rd29A(cor78/lti78)基因编码与 LEA蛋白非
常相似的亲水蛋白 , 可以保护细胞免受水分胁迫的
伤害 . 该基因的启动子区域同时存在依赖 ABA 的
ABRE 元件(ABA responsive element)和不依赖 ABA
的 DRE 元件, 实验证实该基因在干旱开始后几小时
内的快速诱导表达不依赖于 ABA, 而随后阶段的慢
性诱导表达却是依赖于 ABA的[8,9,13].
DREB是属于 AP2/EREBP家族的一类转录因子,
具有保守的 AP2/EREBP结构域, 能够与 DRE元件特
异性结合, 调控其下游基因表达[14~16]. 目前已在拟南
芥中克隆了多个编码 DREB 类转录因子基因 , 如
DREB2a, DREB2b和 CBF4等, 它们在干旱、低温、
高盐等胁迫条件下均有很显著的诱导表达特性[17~20].
DREB2a与DREB2b在原生质体瞬时表达系统中可以
特异诱导启动子区含有 DRE 元件基因的表达[19], 而
CBF4转基因过表达拟南芥能够在正常条件下表达含
有 DRE 元件的胁迫应答基因, 并在干旱、低温、高
盐等条件下显示了更强的耐受能力 [20]. 本文克隆了
拟南芥中一个富含谷氨酰胺的 DREB 类转录因子
QRAP2 基因. 研究发现该基因受干旱强烈诱导表达,
它所编码的蛋白能在体外与 DRE 序列特异性结合并
在酵母中显示了转录激活功能 , 我们推测该基因在
拟南芥干旱应答途径中具有重要作用.
1 材料与方法
(ⅰ ) 植物材料 . 哥伦比亚野生型拟南芥
(Arabidopsis thaliana, Columbia ecotype)于全自动培
养箱(Conviron 公司)中培养. 培养条件为 22℃, 光照







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强度 100 µE·m−2·s−1, 光照时间 16 h. 将处于 6~8片莲
座叶生长期的拟南芥植株分别进行冷、热、干旱、乙
烯、水杨酸、脱落酸、紫外线、NaCl条件下的处理, 具
体处理方法参照 Gong等人[14]的方法. 处理后的植株
保存于液氮中备用.
(ⅱ) 氨基酸多序列比对与系统发生分析. 氨基
酸多序列比对与系统进化树分析使用 Clustal W 1.8.3
软件[21]. 参与分析蛋白序列的编码基因的 AGI 号分
别为 : ANT, At4g37750; SMZ, At3g54990; SNZ,
At2g39250; RAV1, At1g13260; RAV2, At1g68840;
RAP2.1, At1g46768; TINY, At5g25810; DDF1,
At1g12610; DDF2, At1g63030; CBF1, At4g25490;
CBF2, At4g25470; RAP2.4, At1g78080; At2g20880,
DREB2B, At3g11020; ABI4, At2g40220; AtERF1,
At4g17500; AtERF2, At5g47220.
(ⅲ) RNA的提取. 使用 RNeasy Plant Mini Kit
(QIAGEN公司)提取拟南芥植株的总 RNA, 方法参照
QIAGEN公司产品使用手册.
(ⅳ) RACE 方法获得全长 mRNA 序列. 根据
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)预测的 QRAP2
的 ORF 序列设计 RACE实验所用的基因特异引物序
列为: FP1, 5′-TGAGCAACGACAAGACCCGACAAT-
3′; FP2, 5′-GGAAAGCGAGCTGCATGATTCAAAC-
3′; RP1, 5′-GGCTGTGGCGTTTCAGGTTCTTTCT-3′;
RP2, 5′-CCTTGCATTGTCGGGTCTTGTCGTT-3′. 以
5 µg 经干旱处理 3 h后提取的拟南芥总 RNA为起始
材料, 使用 GeneRacer试剂盒(Invitrogen公司)获得 5′
和 3′端分别连接上特殊接头序列的 cDNA模板, 具体
操作方法按照 Invitrogen 公司产品使用手册进行 .
PCR扩增采用 50 µL 反应体系, 5′ RACE扩增第 1轮
使用带有接头序列的 cDNA 作为模板, GeneRacer 5′
引物和 RP1作为引物; 然后以第 1轮扩增产物作为模
板进行套式 PCR, 引物采用 GeneRacer 5′套式引物和
RP2. 3′ RACE扩增方法类似, 2轮 PCR的引物分别为
GeneRacer 3′引物与 FP1, GeneRacer 3′套式引物与
FP2. PCR反应条件为: 94℃ 预变性 2 min; 94℃ 30 s,
65~68℃ 30 s, 72℃ 90 s, 共 30个循环; 72℃ 10 min,
4℃ 保存. 循环中退火温度根据所选引物而定. 所得
5′和 3′ 套式 PCR 扩增产物经 1.2% 琼脂糖凝胶电泳
检查, 分别经回收纯化后克隆至 pGEM-T easy 载体
中测序.
(ⅴ) RT-和定量 Real-time RT-PCR(QRT-PCR)分
析 . 分别提取各种条件下处理的拟南芥材料的总
RNA 3 µg进行反转录反应. 实验采用 Invitrogen 公
司的 SuperScriptTM First-Strand Synthesis System for
RT-PCR 试剂盒, 生成的第 1 链 cDNA 用作 RT-PCR
的模板. 用 UBQ10 作为对照来平衡 cDNA 模板的用
量. PCR扩增产物经 1.2%琼脂糖凝胶电泳检查. QRT-
PCR 使用 SYBR green PCR 试剂盒(Applied Biosys-
tems公司)标记反应产物, PCR分析仪器为 DNA En-
gine Opticon-Continuous Fluorescence Detection Sys-
tem (MJ Research公司).
(ⅵ) QRAP2的原核表达及纯化. 以 pGEX-4T-1
为原核表达载体 , 设计引物(ORFP1, 5 ′-AGTAGG-
ATCCATGGACTTTGACGAGGAG-3′; ORFP2, 5′-CA-
CGCTCGAGTCAAAAGAAAGGCCTCA-3 ′), 扩增
QRAP2的全长读码框, 分别在引物两端引入 BamHⅠ
和 XhoⅠ酶切位点, 构建可表达 GST-QRAP2 融合蛋
白的载体. 以干旱处理的拟南芥总 RNA 样品反转录
后的第 1链 cDNA为摸板, PCR扩增目的片段. 产物
经纯化后用 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切后连入
pGEX-4T-1, 测序正确后用于原核表达. 将重组质粒
pGEX-4T-1-QRAP2转入大肠杆菌BL21, 挑取转化的
单克隆菌株, 接入 LB培养基中, 37℃, 240 r/min振荡
过夜. 将所培养菌液按 1︰50转接入 2×YPD培养基,
37℃, 240 r/min 摇床培养约 2 h, 当菌液 A600 达到
0.6~0.8时, 加入 IPTG至终浓度为 0.4~1 mmol/L进行
诱导, 菌体继续在 37℃, 240 r/min培养 4~6 h后离心
收集菌体, 冰浴中超声波破碎菌体, 离心后的上清液
用于重组蛋白的纯化 . GST-QRAP2 融合蛋白经
Glutathione Sepharose 4B(Amersham Pharmacia Bio-
tech)纯化, 具体方法参照产品说明书.
(ⅶ) EMSA. 取 50 ng已纯化的表达蛋白, 加入
1 µg 非特异性封闭探针 poly(dA- dT), 2 µL 5×结合缓
冲液 (125 mmol/L HEPES-KOH, 50% 甘油 , 200
mmol/L KCl, 2.5 mmol/L EDTA, 5 mmol/L DTT, pH
7.9), 混匀后加入 1 pmol 32P标记探针, 最终总反应体
系为 10 µL. 所用探针序列为: GCC, TAAGAGCCG-
CCACT; DRE: ATACTACCGACAT; DRE-2: ATAC-
TGCCGACAT; mDRE: ATACTACTTATAT. 混匀反
应物后, 在室温下结合 2 h 后进行 6% 非变性 PAGE
电泳, 电泳缓冲液为 0.5×TBE(45 mmol/L Tris-borate,
1 mmol/L EDTA). 电泳后的凝胶经干胶后放入磷屏
曝光 24 h, 结合活性根据 Typhoon 9210 (Amersham
Pharmacia Biotech) 所检测的同位素信号强度定量.
(ⅷ) 酵母单杂交转录激活活性分析. 按照 Ye







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等人 [22]改进的方法进行转录激活活性分析 . 将含有
pG221质粒的酵母菌株 EGY48接进 50 mL SC-Ura培
养基中, 30℃, 250 r/min培养 16~18 h, 至平台期(A600
> 1.5). 1:10转接使得最终 A600 = 0.2~0.3. 30℃, 230
r/min 培养 3 h, 使得最终 A600 = 0.4~0.6. 取菌液 50
mL室温 1000×g离心 5 min; 弃上清, 30 mL ddH2O重
悬, 室温 1000×g离心 5 min, 弃上清, 加入 1.5 mL 预
冷的 1×TE/LiAc重悬制得酵母感受态细胞. 将 0.1 µg
待转化 pYF503质粒及 0.1 mL 酵母感受态细胞混匀,
加入 0.6 mL PEG/LiAc 溶液, 200 r/min, 30℃培养 30
min, 加入 70 µL DMSO, 轻轻颠倒混匀, 42℃热激 15
s, 冰上放置 1~2 min, 14000 r/min离心 5 s. 弃上清,
加入 0.5 mL 1×TE 溶液重悬, 取 100 µL 涂在 SC-
Ura-Trp 培养基上 30℃培养 2~3 d. 将长出的酵母菌
落在 SC-Ura-Trp+Xgal显色平板上划线, 30℃培养 2 d
后观察显色情况.
2 结果与讨论
2.1 QRAP2的克隆及序列分析
根据对拟南芥 ATH1芯片数据的分析, 发现一个
干旱处理后表达量提高 10 倍以上的 cDNA, 将其命
名为 QRAP2. 通过 RACE 方法, 获得该基因的全长,
1218 bp. 在该 cDNA起始密码子 ATG上游 21 bp处
出现了一个终止密码子, 可读框下游 876 bp 后出现
终止密码子, 推测编码一条含 292氨基酸残基的多肽.
序列已递交到GenBank数据库, 登录号为DQ011579.
该基因的 AGI 号为 At4g28140. 多序列比对结果显
示, QRAP2编码蛋白含有一段典型的 AP2/EREBP保
守结构域(图 1(a)), 该结构域在氨基酸水平上与多个
已报道的拟南芥 AP2 家族转录因子具有很高的相似
性(图 1(b)). 系统进化树分析表明, QRAP2 在氨基酸
水平上与DREB亚家族转录因子更为接近, 而与AP2
和 RAV 2个亚家族则距离相对较远(图 1(c)).
2.2 QRAP2 mRNA的转录水平检测
RT-PCR与QRT-PCR结果表明, QRAP2在未处理
的拟南芥植株中表达量极低, 而在经干旱、紫外线照
射、ABA(脱落酸)、NaCl 以及 SA(水杨酸)等处理后
表达量分别提高了 431, 128, 102, 65, 4倍(图 2(b)). 我
们进一步研究了 QRAP2 在不同干旱处理时间下的表
达状况, 发现该基因在干旱处理 30 min 时表达量即
提高了 32倍, 短时间内表达量急剧升高, 在 3 h时表
达量升高到对照样本的 400 多倍, 而接下来 QRAP2
的表达量开始逐渐下降, 并在 24 h 后降为对照样本
的 7倍(图 3(b)). 对照 CBF1, CBF2, CBF3, DREB2A
等已报道的 DREB 亚家族成员在受到干旱, 低温等
胁迫条件下的表达情况 , 发现这类基因都具有同
QRAP2 相似的表达模式, 即短时间内表达量迅速提
高, 在 2~5 h 内达到最高值, 而后表达量逐渐下降,
并在 24 h 以后降至本底或略高于本底水平[19,23]. 另
外 , Takahashi 等人 [24]应用 cDNA 微阵技术检测到
At4g28140 在甘露醇(造成与干旱相似的渗透压胁迫)
和高盐胁迫下有很强的诱导表达(表达量提高 5 倍以
上), 与本研究中 QRAP2 表达谱的 RT-PCR研究结果
基本相符. Marathe 等人[25]同样用 ATH1 芯片检测到
At4g28140 在拟南芥受到植物病毒 CMV-Y侵染后表
达水平下降到一半以下 , 推测该基因可能参与植物
防御反应.
2.3 原核表达的 QRAP2重组蛋白与 DNA结合特性
分析
与未诱导的已转入 pGEX-4T-1-QRAP2质粒的大
肠杆菌菌体总蛋白相比, 经 IPTG 诱导的菌体总蛋白
表达出一表观分子量约为 60 kD的蛋白条带, 相当于
QRAP2蛋白(理论分子量 33 kD)加上 GST 标签蛋白
(理论分子量 26 kD). 该蛋白主要存在于包涵体中,
小部分溶于上清. 通过Glutathione Sepharose 4B亲和
柱层析 , 从上清中纯化了该重组蛋白 . 用纯化的
QRAP2 重组蛋白进行 EMSA 实验, 实验结果表明
QRAP2与 DRE元件序列和 DRE2元件序列均有很强
的结合能力, 而几乎完全不能与 GCC 及 mDRE元件
序列(DRE 元件结合中心区 4 个碱基 CGAC 突变为
TTAT)相结合(图 4). DRE与 DRE2序列都含有核心序
列 CGAC, 这 4个碱基对于 QRAP2蛋白与 DNA的结
合至关重要. DREB和 ERF是 AP2家族中很相近的 2
个亚家族, 它们在 AP2/ERF 结构域上的细微差别使
得它们对于DRE和GCC元件具有明显不同的结合偏
好[16,26]. 因此, 本研究证明 QRAP2 属于 DREB 而不
是 ERF亚家族.
2.4 QRAP2转录激活活性分析
将表达 GAL4结合结构域与 QRAP2的融合蛋白
的质粒转入酵母中, 能够使 GAL4顺式序列调控下的
报告基因 LacZ 得到表达, 形成蓝色菌落(图 5), 表明
QRAP2具有转录激活活性. 通过对 QRAP2编码蛋白
序列的分析, 我们发现在 N端 67~107这一段区域中







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图 1 QRAP2 蛋白序列分析
(a) 根据氨基酸序列预测的 QRAP2的结构域框架图; (b) 部分拟南芥 DREB转录因子中 AP2/EREBP结构域多序列比对结果;
(c) QRAP2基因在拟南芥 AP2/EREBP家族系统树中的定位分析

谷氨酰胺残基含量高达 43.9%, 并有一串 8个连续的
谷氨酰胺残基. Gerber等人[27]发现富含谷氨酰胺残基,
特别是形成 6 个以上连续谷氨酰胺残基串的短肽具
有很强的转录激活活性. QRAP2 的转录激活活性也
很可能与这一段富含谷氨酰胺残基的区域有关 . 进
一步的实验证实了这一推测. 当 GAL4结合结构域与
QRAP2 N 端 112 个氨基酸残基融合表达时, 可以激
活 LacZ的表达; 而 GAL4结合结构域与 QRAP2 C端
113~292 位氨基酸残基融合表达时, 不能激活 LacZ
的表达.
综上所述, QRAP2是拟南芥中受干旱、紫外线照
射、脱落酸、高盐以及水杨酸等多种胁迫条件诱导的







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图 2 不同胁迫条件下拟南芥 QRAP2的表达谱分析
(a) 不同胁迫条件下 QRAP2 的 RT-PCR 结果; (b) 不同胁迫条件下
QRAP2的 Real-time RT-PCR(QRT-PCR)结果. 图中纵坐标为 QRAP2在
经胁迫条件处理的样本中的相对表达量与未处理样本(CK)中相对表
达量的比值


图 3 不同干旱时间处理后拟南芥 QRAP2的表达谱分析
(a) 不同干旱时间处理后QRAP2的 RT-PCR结果; (b) 不同干旱时间处
理后 QRAP2的 QRT-PCR结果. 图中纵坐标为 QRAP2不同干旱时间
处理下样本中的相对表达量与未处理样本(0 h)中相对表达量的比值

AP2/EREBP 转录因子家族新基因, 经干旱诱导后其
表达量在短时间内迅速升高超过 400倍, 而其编码蛋
白具有特异结合 DRE 元件和转录激活活性, 极有可
能作为转录因子在胁迫条件下参与激活下游相关应
答基因从而在植物抗逆过程中发挥关键性作用.
AP2/EREBP 家族转录因子的许多成员参与了植
物抗逆反应, 如已报道的 CBF 成员参与植物低温胁
迫反应, DREB2A, DREB2B参与植物干旱、高盐胁迫
反应, ABI4 参与 ABA依赖型的转录调控过程. 这些
基因大部分在正常条件下表达量较低 , 受到相应胁

图 4 QRAP2 蛋白与 DNA元件结合能力分析
1, GST 与 DRE 混和; 2, QRAP2 蛋白与 DRE 混和; 3, QRAP2 蛋白与
DRE2混和; 4, QRAP2 蛋白与mDRE混和; 5, QRAP2 蛋白与GCC混和


图 5 酵母单杂交鉴定 QRAP2转录激活活性
将图中所示的基因或基因片段分别克隆到 pYF503 中(GAL4 AD 为
GAL4 激活结构域, empty vector 表示无基因克隆到 pYF503 中), 转
入酵母中表达 N 端带有 GAL4 DNA 结合结构域的融合蛋白, 按文
献[22]所示方法进行分析

迫条件的诱导后表达 . 由于它们能够识别特定的
DNA 顺式元件并具有转录激活活性, 能激活相应的
效应基因从而作出对胁迫条件的应答. 大多数已研
究的转录调控因子基因在过表达植株中均能上调含
相应特定 DNA 启动子元件的效应基因的表达 , 如
AP2/EREBP家族转录因子 CBF提高转基因植物耐冷
性就是通过诱导 COR 基因高表达而实现的[28]. 本研
究表明 , 对此类转录因子基因功能的研究将有助于







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阐明植物胁迫应答的调控机理.
致谢 本工作为国家自然科学基金资助项目 (批准号 :
30221120261).
参 考 文 献
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(2005-05-08收稿, 2005-07-12收修改稿)