全 文 ：第 39卷第 6期　　　　　　　　　　 　　　　　上海师范大学学报(自然科学版) Vol.39, No.6
2 01 0年 1 2月　　　　　　　　　　 JournalofShanghaiNormalUniversity(NaturalSciences) Dec., 20 1 0
荧光显微术在鉴别拟南芥花粉壁发育
相关基因功能中的应用
高菊芳 , 杨太为
(上海师范大学 生命与环境科学学院 , 上海 200234)
摘　要:花粉在发育过程中 ,其壁中的不同成分具有自发荧光或诱发荧光的特性 ,荧光显微术
利用此特性来鉴别花粉壁中的化学成分.拟南芥野生型花序的树脂半薄连续切片用苯胺蓝水
溶液染色后 ,在紫外光激发下 ,胼胝质发出黄绿色荧光 ,孢粉素发出黄色或黄棕色荧光 ,纤维素
发出蓝色荧光.利用荧光的方法快速简便 ,分辨率高 ,适用于大规模筛选花粉壁发育相关基因
时对不同基因的功能进行快速鉴别和分类.用该方法鉴别出了几个与胼胝质合成 、胼胝质降
解 、孢粉素沉积模式以及花粉内壁纤维素合成相关的遗传位点.
关键词:荧光显微术;花粉壁发育;基因功能鉴别
中图分类号:Q336;Q756　　文献标识码:A　　文章编号:1000-5137(2010)06-0615-08
　　　　　　　　　　
收稿日期:2010-07-20
基金项目:上海师范大学校基金项目(SK200828);国家自然科学基项目(30530100, 30970268).
作者简介:高菊芳(1962-), 女 ,上海师范大学生命与环境科学学院副教授;杨太为(1985-), 男 ,上海师范大学生
命与环境科学学院硕士研究生.
　　孢粉素和纤维素都具有自发荧光 ,在紫外光激发下 ,孢粉素为黄色荧光 ,纤维素为蓝色荧光[ 1] .另
外 ,利用苯胺蓝对胼胝质的专性反应 ———在紫外光激发下发出黄绿色荧光 ,检测胼胝质的方法已有大量
文献报道[ 2-3] .因此荧光显微术可用来鉴定细胞壁的成分 、研究细胞壁的形成与再生 、以及细胞壁在植
物发育过程中和在环境影响下性质的变化.
花粉壁发育是一个重要而复杂的生物学过程 ,已有的研究表明花粉壁的发育起始于减数分裂完成
后的四分体时期 ,并且与绒毡层的分泌功能密不可分 [ 4-8] .近年来 ,通过正向和反向遗传学的方法已分
离到多个参与花粉壁形成的关键基因 ,其中 DYSFUNCTIONALTAPETUM1(DYT1)、TapetalDevelopment
andFuncyion1(TDF1)、ABORTEDMICROSPORES(AMS)、AtMYB103和 MALESTERILE1(MS1)是已克隆
的编码调控绒毡层功能分化的转录因子基因 ,这些基因的突变使绒毡层细胞的分泌功能丧失 ,造成小孢
子不能从四分体中释放[ 9-15] ,或释放不久就提前降解[ 16-18] .
小孢子原外壁的正常形成对花粉外壁的正确构建非常重要.CaloseSynthase5 (CalS5)、DEFEC-
TIVEINEXINEFORMATION1 (DEX1)、NOEXINEFORMATION1 (NEF1)和 RUPTUREDPOLLEN
GRAIN1(RPG1)是已克隆的与胼胝质合成以及原外壁形成有关的基因 ,这些基因突变后 ,因原外壁的
缺陷造成突变体虽能合成孢粉素 ,却不能正常沉积 [ 19 -23] .
花粉外壁的主要成分孢粉素是聚合的酚类物质和长链脂肪酸衍生物 [ 24] .拟南芥 MALESTERILE2
(MS2)、CYP703A2和 Acyl CoASynthetase5(ACoS5)是已克隆的参与孢粉素合成的基因 ,其突变体的小
孢子表面都缺乏孢粉素形成的外壁 [ 25 -27] .
当小孢子开始有丝分裂时 ,会在细胞膜与外壁中间分泌一层致密的物质 ———内壁.目前对花粉内壁
形成及其调控的分子机制所知甚少 ,由于 3个涉及初生壁纤维素合成酶基因的突变体都是雄性不育突
　　 上海师范大学学报(自然科学版) 2010年　
变体 ,其花粉壁也不正常 ,因此认为小孢子表面纤维素的沉积对于花粉壁的发育来说是至关重要的 [ 28] .
本文作者用荧光显微术观察了拟南芥野生型花粉壁发育过程中壁的荧光变化 ,确定了 6个发育关
键期花粉母细胞或小孢子细胞壁的荧光色彩和强度 ,并用 6个已知功能的花粉壁发育相关基因的敲除
突变体加以验证.在此基础上 ,鉴别出了几个与胼胝质合成 、胼胝质降解 、孢粉素沉积模式以及花粉内壁
纤维素合成相关的遗传位点.
1　材料与方法
1.1　植物材料
拟南芥(Arabidopsisthaliana)分别以 Landsbergeracta(Ler)和 Columbia(Col)为遗传背景 ,文中所有
突变体均为雄性完全不育或部分不育突变体 ,遗传分析表明表型由单个基因控制 ,具体信息如下:
dyt1-2突变体是从 EMS诱变的拟南芥中筛选得到的雄性不育突变体 ,图位克隆和互补实验证实突
变的基因是 DYT1(At4G21330)[ 10] .
rpg1突变体是从 T-DNA插入突变体库中筛选得到雄性育性严重下降的突变体 ,等位分析和遗传互
补证明了 At5G40260敲除导致突变表型[ 23] .
ms1-2突变体是从转座子插入突变体 pst01709种子中筛选所得雄性不育突变体 ,表型与文献 [ 16]
报道的相同.
cals5-1突变体是从 T-DNA插入突变体 SALK 009234种子中筛选得到的 T-DNA纯合插入突变体 ,
表型与文献 [ 19]报道的相同.
dex1-3突变体是从 T-DNA插入突变体 CS3827种子中筛选得到的雄性不育突变体 ,表型与文献
[ 20]报道的相同.
ms2-2是从 T-DNA插入突变体 CS1632种子中筛选得到的雄性不育突变体 ,表型与文献 [ 25]报道
的相同.
ms188突变体是 MYB103(At5G56110)基因敲除的雄性不育突变体 [ 15] .
花粉壁发育缺陷突变体 dpwd-1(defectiveinpolenwaldevelopment)、dpwd-2 、dpwd-3 、dpwd-4 、
dpwd-5和 dpwd-6是从 SALKT-DNA插入突变体库种子中筛选得到雄性完全不育或部分不育突变体 ,扫
描电镜观察证实其花粉壁发育异常.
植物种植方法同文献 [ 15] .
1.2　方　法
1.2.1　细胞壁成分胼胝质和孢粉素的观察
拟南芥野生型和突变体花序在卡诺固定液(无水酒精∶冰醋酸 =3∶1)固定 1 h, 95%酒精洗涤后 ,
100%酒精脱水 ,环氧丙烷置换后 , spurr树脂渗透和包埋 ,修块后用玻璃刀在 PowertomeXL(RMC产品)
超薄切片机上连续半薄切片 ,片厚 1 μm.切片展平干燥后用 0.1%苯胺蓝(AnilineBlue)水溶液染色 10
min,盖上盖玻片后在 Olympus荧光显微镜下用紫外光激发观察并拍照.
1.2.2　细胞壁成分纤维素的观察
制片方法同上 , 0.1%苯胺蓝水溶液染色 2-4h后观察和拍照.
1.2.3　成熟花粉扫描电镜观察
分离野生型和各突变体 13期花药 ,开裂面朝上置于扫描电镜制样台上 ,空气干燥 2 d后喷金观察.
2　结果与讨论
2.1　苯胺蓝染色可鉴别花粉壁中的不同化学成分
花粉壁发育的经典细胞学研究表明 ,按照 Sanders[ 29]的划分标准 ,在花药发育的第 6期 ,花粉母
细胞壁中胼胝质的合成对以后的花粉壁发育至关重要.图 1A显示的是野生型花药发育第 6期药室
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　第 6期 高菊芳 ,杨太为:荧光显微术在鉴别拟南芥花粉壁发育相关基因功能中的应用 　　
中的花粉母细胞 ,从图中可以看到花粉母细胞胼胝质壁已经形成 ,发出黄绿色荧光.图 1B显示的是
野生型花药发育第 7期药室中的四分体 ,从图中可以看到四分体中小孢子外形饱满 ,主要由胼胝质
组成的小孢子细胞壁结构完整 ,棱角分明 ,发出黄绿色荧光.在花药发育的第 8期 ,小孢子从四分体
中释放出来 ,细胞表面除萌发沟以外 ,都沉积了孢粉素.图 1C显示的是花药发育第 8期药室中的小
孢子 ,从图中可以看到小孢子表面覆盖有一层黄绿色的荧光物质 ,在某些部位出现淡蓝色的 `浅沟
样结构.根据刚释放小孢子壁的结构特点 , “浅沟 ”样结构处为萌发沟所处的位置.因此 ,黄绿色荧光
可判断为原外壁中纤维素蓝色荧光和孢粉素黄色荧光的混合产物 ,而萌发沟处因无孢粉素沉积 ,故
只有原外壁中纤维素发出的蓝色荧光.在花药发育的第 9期 ,花粉外壁中的孢粉素网格结构已初步
形成 ,图 1D显示的是花药发育第 9期药室中的小孢子 ,从图中看出此时小孢子表面被一层较厚的黄
色荧光物质 ,即花粉外壁的主要成分孢粉素包裹.图 1E显示的是花药发育第 10期药室中的小孢子 ,
小孢子表面发出黄棕色荧光的物质也是孢粉素.在花药发育的第 11期 ,小孢子细胞核完成两次有丝
分裂 ,形成一个营养核和两个生殖核 ,其花粉壁中的内壁也发育完成 ,花粉内壁的主要成分是纤维素
类物质.图 1F显示的是花药发育第 11期药室中的花粉粒 ,可以看到 ,在外壁孢粉素层的内侧 ,有一
层致密的发蓝色荧光的物质包围着花粉粒 ,这层发蓝色荧光的物质就是花粉内壁中的纤维素.
胼胝质发出黄绿色荧光 ,孢粉素类物质发出黄色荧光 ,纤维素发出蓝色荧光.mmc:花粉母细胞 ,
tds:四分体 , msp:小孢子, PG:花粉粒(标尺 =10μm)
图 1　野生型花粉壁发育过程中化学成分变化的鉴别
　　综上所述 ,在花粉壁发育的不同时期 ,其壁中的不同化学成分与苯胺蓝水溶液反应后发出不同波长
的荧光 ,其中胼胝质发出黄绿色荧光 ,孢粉素类物质发出黄色或黄棕色荧光 ,纤维素发出蓝色荧光.因
此 ,根据花粉壁发育缺陷突变体花粉壁发育过程中的荧光色彩和强度的变化 ,可以分析花粉壁发育相关
基因的功能.
2.2　根据花粉壁发育过程中的壁成分的荧光变化 ,区分花粉壁发育相关基因的功能类别
2.2.1　胼胝质合成和沉积相关基因
胼胝质的适时合成与正确沉积是花粉壁发育过程中的一个极其关键的环节.CaloseSynthase5
(CalS5)在小孢子母细胞中有高表达并对小孢子母细胞胼胝质合成起关键作用 [ 19] .DYT1是一个在花药
发育第 5和 6期强烈表达的 bHLH家族转录因子 [ 9] , DEFECTIVEINEXINEFORMATION1(DEX1)基因是
一个控制花粉外壁发育过程中孢粉素沉积的关键基因[ 20 -21] .dpwd-1(defectiveinpolenwaldevelopment)
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A和D:野生型;B和 E:cals5-1;C和 F:dex1-3;G和J:dyt1-2;
H和 K:dpwd-1;I和 L:D:dpwd-2.mmc:
花粉母细胞 , tds:四分体 , msp:小孢子(标尺 =10 μm)
图 2　野生型和胼胝质合成与沉积缺陷突变体花粉壁发育的比较
和 dpwd-2 是 从 SALK T-
DNA插入突变体库种子中
筛选得到的由单个隐性基
因控制的雄性完全不育突
变体 ,其对应基因目前正在
克隆之中.图 2是野生型 、
cals5-1 突变体 、dex1 -3突
变体 、dyt1-2突变体 、dpwd-1
突变体和 dpwd-2突变体第
6期以及第 7期花药横切.
与野生型花粉母细胞表面
较强的黄绿色荧光(图 2A)
相比 , cals5-1突变体的花粉
母细胞表面几乎无黄绿色
荧光(图 2B), dex1 -3突变
体的花粉母细胞表面黄绿
色荧光较弱(图 2C), dyt1-2
突变体的花粉母细胞表面
黄绿色荧光分布不均匀
(图 2G), dpwd-1 突变体的
花粉母细胞表面也没有黄
绿色荧光(图 2H),但 dpwd-
2突变体花粉母细胞具有较
强的浅绿色荧光(图 2I).野
生型第 7期此时药室中的
四分体 ,不仅四周有较强的
黄绿色荧光 ,而且小孢子之
间棱角分明的分隔带也发
出强 烈 的 黄 绿 色 荧 光
(图 2D).cals5-1 和 dex1突
变体药室内的四分体 ,其四
分体四周的黄绿色荧光缺
乏或较弱 ,但小孢子细胞之间分隔处具有较弱的黄绿色荧光(图 2E)或较强的黄绿色荧光(图 2F), dyt1-2
突变体四分体中小孢子之间分隔处黄绿色荧光同样较弱(图 2J).令人感兴趣的是 , dpwd-1突变体的花粉
母细胞表面虽没有黄绿色荧光 ,但其四分体中小孢子之间却形成了浅绿色的分隔带(图 2K),而 dpwd-2突
变体四分体四周虽具有较弱的浅绿色荧光 ,但小孢子之间却没有形绿色或黄绿色的分隔带(图 2L).
胼胝质与苯胺蓝水溶液反应后 ,能发出黄绿色荧光 ,上述结果表明 cals5-1突变体的花粉母细胞壁
中的胼胝质不能形成 ,但四分体小孢子之间细胞板中的胼胝质能够形成 ,但强度减弱;dex1-3突变体的
花粉母细胞壁中的胼胝质含量减少 ,而四分体小孢子之间细胞板中的胼胝质能够正常形成;dyt1-2突变
体的花粉母细胞虽能形成胼胝质壁 ,但胼胝质在细胞表面的分布不均匀 ,其四分体小孢子之间的胼胝质
含量也减少.上述结果表明负责花粉母细胞胼胝质壁合成的基因与负责四分体小孢子之间胼胝质壁合
成的基因是不同的 , CalS5和 DEX1的功能可能主要是负责花粉母细胞时期胼胝质的合成 ,而 DYT1的
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　第 6期 高菊芳 ,杨太为:荧光显微术在鉴别拟南芥花粉壁发育相关基因功能中的应用 　　
功能可能与胼胝质的正确沉积有关.对 dpwd-1突变体和 dpwd-2突变体突变基因的克隆将有助于对这
一问题的深入了解.
2.2.2　孢粉素合成和沉积相关基因
AtMYB103是在花药发育 7期主要在绒毡层细胞强烈表达的 MYB家族转录因子 ,具有调控胼胝质
降解 、孢粉素合成等多种功能[ 15] , MS2基因编码一个脂酰还原酶并在绒毡层特异性表达 ,其突变体的小
孢子完全没有外壁结构 ,说明其孢粉素合成或分泌受到抑制 [ 25] .MS1基因编码 PHD同源家族转录因
子 [ 16、 17] .基因芯片分析结果表明 , MS1调控了下游一批与绒毡层发育和花粉壁合成有关的基因[ 18] .
DEX1是一个具有钙结合结构域的未知蛋白 ,并可能与细胞壁相结合[ 20] .dex1突变体的小孢子母细胞
在四分体时期无法形成正常的网纹状原生壁 ,结果小孢子发育期间孢粉素不能 “按图索骥” ,只能随机
沉积在小孢子细胞膜上.伴随外壁构建的缺陷 ,突变体的小孢子也进而降解[ 21] .RPG1蛋白是一个定位
于细胞膜的 MtN3 /saliva基因家族蛋白 ,原位杂交结果显示 RPG于减数分裂时期在花粉母细胞和绒毡
层细胞特异表达 ,透射电镜观察结果表明其突变体小孢子原外壁发育异常 [ 23] .
图 3A-D是野生型 、ms188突变体 、ms2突变体和 ms1-2突变体第 8期药室横切.野生型此时的小孢
子从四分体中释放出来 ,细胞表面覆盖一层浅黄色荧光物质 ,并且该荧光物质形成网格样结构以及 3条
明显的 “沟”(图 3A).而 ms188突变体药室中的四分体周围的胼胝质荧光仍然存小孢子没能从四分体
中释放(图 3B).ms2突变体药室中的小孢子能从四分体中释放出来 ,但小孢子表面被一层发蓝色荧光
的物质包围(图 3C).ms1-2突变体药室中的小孢子能从四分体中释放出来 ,但浅黄色的荧光物质在小
孢子表面的分布是不均匀的 ,并且没有形成网格样结构(图 3D).图 3E-H是野生型 、dex1-3突变体 、rpg1
突变体和 dpwd-3突变体第 9期花药横切.野生型此时小孢子的孢粉素外壁已完全形成 ,发出黄棕色荧
光(图 3E),而 dex1-3突变体 、rpg1突变体和 dpwd-3突变体此时的小孢子表面被散乱分布的暗黄色或棕
色荧光物质包裹 ,与野生型孢粉素黄棕色荧光不完全相同.
A和 E:野生型;B:ms188;C:ms2;D:ms1-2;F:dex1-3;G:rpg1;H:dpwd-3.mmc:花粉母细胞 ,
tds:四分体 , msp:小孢子, PG:花粉粒(标尺 =10μm)
图 3　野生型与孢粉素合成与沉积缺陷突变体花粉壁发育的比较
　　上述结果表明不能合成孢粉素的突变体 ,如 ms188突变体和 ms2突变体 ,在其花药发育第八期药室
中缺乏孢粉素发出的黄色荧光.而原外壁发育有缺陷的突变体 ,如 dex1-3突变体和 rpg1突变体 ,其花粉
外壁物质孢粉素虽能合成 ,但因沉积模式的改变 ,从而影响了其荧光波长.因此 , dpwd-3突变体花粉原
外壁的发育也可能是异常的.
2.2.3　花粉内壁纤维素合成相关基因
当花药发育到第 11期 ,小孢子开始有丝分裂 ,并且在细胞膜与外壁中间分泌一层致密的物质———
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　　 上海师范大学学报(自然科学版) 2010年　
内壁.相对于对花粉外壁形成分子机理的认识程度 ,人们对花粉内壁形成的分子机理还是缺乏深入的
了解.
图 4显示的是野生型 、dpwd-4突变体 、dpwd-5突变体和 dpwd-6突变体成熟花粉的外貌(A-D)和花
药发育第 11期的横切片(E-H).从图中可以看到 ,野生型拟南芥的成熟花粉 ,外形饱满 ,其网格纹饰包
括柱状层和顶盖层(图 4A),内壁由致密的纤维素层(蓝色荧光)组成(图 4E).虽然 dpwd-4突变体 、dp-
wd-5突变体和 dpwd-6突变体的成熟花粉都能形成孢粉素组成的外壁 ,但外形塌陷干瘪(图 4B-D).dp-
wd-4和 dpwd-5突变体花粉外壁内侧蓝色荧光很弱 ,说明花粉内壁纤维素成分很少(图 4F、G).而和 dp-
wd-6突变体花粉外壁内侧黄绿色荧光较强 ,说明其内壁成分含有较多胼胝质成分 ,而纤维素含量则较
少(图 4H).简言之 , dpwd-4突变体 、dpwd-5突变体和 dpwd-6突变体成熟花粉的内壁中 ,纤维素成分的
含量大大减少 ,造成内壁不如野生型的致密和具有刚性 ,使突变体花粉壁的透气性较野生型的强 ,因此
其花粉外貌塌陷干瘪 ,不像野生型的那样饱满.
A和 E:野生型;B和 F:dpwd-4;C和 G:dpwd-5;D和 H:dpwd-6.mmc:花粉母细胞 ,
tds:四分体 , msp:小孢子 , PG:花粉粒(标尺 =10μm(E-H))
图 4　野生型与花粉内壁纤维素合成缺陷突变体花粉壁发育比较
　　上述结果表明 DPWD-4 、DPWD-5和 DPWD-6的功能与花粉内壁纤维素的合成相关.
3　结　论
人们对花粉壁发育过程的认识得益于透射电子显微镜技术 ,尽管本文作者所采用的树脂半薄切片
荧光显微术在分辨率上不如透射电镜技术 ,但仍然具有以下优点:
(1)固定剂为无水乙醇与醋酸 3∶1混合的卡诺固定剂 ,与透射电镜所采用的戊二醛和锇酸相比具
有毒性低 、价格低廉 、固定时间短等特点.
(2)包埋方式为整个花序整体包埋 ,区分花药发育时期可以在连续切片上根据花苞的大小以及在
花序上的位置加以辨别 ,避免了透射电镜需要对花苞事先分类再分别包埋等繁琐步骤 ,减少了工作量.
(3)透射电镜技术主要根据电子密度区分细胞膜和细胞壁中的蛋白质 、脂类和多糖 , 不能区
分脂或多糖的类别.而荧光显微镜技术根据不同化学物质具有不同波长的自发荧光或诱发荧光 ,
能够较为准确地区分同一类别的生物大分子中的不同亚类 ,例如胼胝质与苯胺蓝染色后发出黄绿
色荧光 ,而纤维素发出蓝色荧光 ,并且可以通过对比荧光强度的变化进行半定量分析.
鉴于荧光显微术的上述优点 ,该方法特别适用于大规模筛选花粉壁发育相关基因中对突变体的花
粉发育进行快速观察 ,并对突变基因的功能进行简单分类 ,为进一步研究指明方向.利用本方法鉴别出
了 6个与胼胝质合成 、孢粉素沉积以及花粉内壁纤维素合成相关的遗传位点 ,对这些花粉壁发育缺陷突
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变体的深入研究 ,将加深对花粉壁发育分子机理的理解.
致谢　感谢杨仲南教授 ,作者的实验工作在上海师范大学植物功能基因实验室完成.感谢 ABRC和
RIKEN提供突变体种子.
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Applicationoffluorescencemicroscopyindistinguishthefunctionsofpolen
waldevelopmentrelatedgenesinArabidopsis
GAOJu-fang, YANGTai-wei
(ColegeofLifeandEnviromentSciences, ShanghaiNormalUniversity, Shanghai200234, China)
Abstract:Thefluorescencemicroscopyisabletodistinguishthechemicalcomponentsinthepollenwalbecausethediferent
componentsofthepolenwallhavethepropertiesofautomaticorevokedfluorescence.Whensequentialtransverseanthersections
ofwildtypeinflorescencewerestainedwithanilineblue, thefluorescenceofcalosewasyellow-greenish, thefluorescenceof
sporopoleninwasfromlightyellowtobrown, andthefluorescenceofcellulosewasblue.Thismethodhastheadvantageofrapid,
simple, andhighresolve.Itcanbeappliedtolargescalescreeningpolenwaldevelopmentrelatedgenesfordifferentiatingand
classifyinggene′sfunction.Severalgeneticlocirelatedtocallosesynthesisanddissolve, orsporopoleninpaternformation, orcel-
lulosesynthesisinintinewerediscoveredbyusingthismethod.
Keywords:fluorescencemicroscopy;pollenwaldevelopment;genefunctiondistinguish
(责任编辑:顾浩然)
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