全 文 ：林 业科 学研 究 ,
间接免疫荧光显微术检测泡桐
丛枝病原 的研究 ‘
田 国忠 张锡津 朱水方 张成良 罗 飞 黄文胜
摘要 以感染类菌原体 的泡桐组培苗为病原繁殖材料 , 采用差速离心和 不连续
密度梯度离心来提纯 作为免疫抗原制备兔抗血清 。 抗血清经健康汁液吸收后 , 作为第一抗
体 , 用异硫代氰酸荧光素 标记的羊抗兔免疫球蛋白作为第二抗体 , 进行间接免疫荧光显微镜
检查染病组织中的 特异性荧光 。 经与 染色技术比较 , 找出了适宜的徒手切片和减少非
特异性反应的途径 此技术具有灵敏度高 、特异性强和测定简便等特点 。 适用 于 组织定位 、组
培苗脱毒效果评估 、 病原株系鉴定和病害检疫等 。
关健词 泡桐丛枝病原 、 抗血清制备 、 间接免疫荧光显微术
引起泡桐丛枝病的类菌原体 病原的检测是研究这一病害的基础和关键问题 。 电镜 、
迪纳氏染色 、 染色等技术已被证明是确定植物感染 的 良好手段 , 。 而 的血
清学则具有更理想的专化性和特异性 一 ‘〕。 由于以往泡桐丛枝病原 纯化 、血清制备或测
定方法的局限 , 血清学检测效果尚不能满足种苗检疫 、 抗病材料筛选 、 组培脱毒效果评估及介
体传毒规律等研究的实际需求 , 本着进一步发挥血清学在泡桐丛枝病原检测上作用的 目的 , 本
研究首次采用感染 的泡桐组培苗为病原 的提纯材料 , 对以往的病原抽提程序加
以改进 , 用制备的抗血清通过 间接免疫荧光显微镜技术检测 , 证明检测灵敏度和特异性
进一步的提高 。
材料和方法
植物材料和病原
感染 的毛泡桐病组培苗 一 , · ·
来源于山东充州林科所测定林 , 以茎段培养方式扩大繁殖供做 提纯材料 , 培养条件同以
前试验 ‘ , 以 一 中林 号 ‘ 一 ’ 品系种子苗组织培养为健康对照 。
用于测试 的材料 包括 一 , 来 自江 西分宜 的 白花 泡桐
病组培苗 , 来自山东充州的揪叶泡桐 病组培苗 ,
一 一 收稿 。
田国忠副研究员 , 张锡津 、 罗 飞 中国林业科学研究院森林保护研究所 北京 朱水方 、张成良 、黄文胜农
业部植物检疫实验所 。
, 本研究为国家“八五 ”攻关项 目“泡桐 丛枝病 防治技术研究 ”部分内容。 此研究得到森保所昊燕 、 王贵成 、 戴莲韵 , 森环
所李文锢 、 成小飞 , 林业所王学聘 、韩 一凡和 李淑梅等同志的大力支援和帮助 , 在此表示 衷心的感谢 。
林 业 科 学 研 究 卷
一 来自山东充办的揪叶泡桐 ’ 病组培苗 , 一 来自江西
分宜的 白花泡桐病根生苗 , 经脱毒处理的 个无性系组培苗 , 即 中林 号 , 前李毛
泡桐 。 ‘ ’ , 兰考泡桐 亡 ‘ ’ , 宿县毛泡桐
‘ ’ , 一 为用 又
病组培苗脱毒 , 驯化并移栽到花盆中生长 的植株 , 以及中国林科院内处于休眠期 的病
与健株枝条 。
抗原制备
此 为参照 的 提纯方法加以改进的程序 〕 采收培养 一
的表现典型丛枝症状的病组培苗 , 去掉根 、 愈伤组织及粘附的培养基 , 称取 用剪刀截成
一 左右的横段 , 迅速浸泡于 抽提缓冲液「 甘露醇 , 抗坏血酸 ,
二 一吗啡琳丙磺酸 , 乙 二胺四 乙 酸 , 聚 乙烯毗咯烷酮
、 , 中 , 匀浆后于 ’ 下静置 一 , 然后用 层纱 布过滤 , 滤 液低速 离心
, , 上清液高速离心 , , 沉淀用悬浮液 甘露醇 ,
, 悬浮 先把悬浮液加在沉淀表面摇动 , 然后用粘有棉团的玻棒轻轻地擦拭未脱
下 的沉淀 。 悬浮液于 一下过夜 , 使 细胞充分分散 。 然后用不连续 P erc ol l 密度梯度
(15 % , 3 0 % , 5 0 % ) 离心 (20 000 9 , 2 0 m i n ) , 收集 30% 一5 0 % 梯度界面的黄绿色部分 , 用悬浮
液 稀释 2 倍 后进行超速离心 (10 0 00 9 , Z h ) , 合并沉淀于离心管底的 Pe rc ol l硬 垫之上 的
M L O , 根据 260 nm 和 280 nm 吸收值计算蛋白含量 。
1
.
3 抗血清制备和抗体吸收
用纯化的 M L O 抗原免疫家兔 , 第 1次耳静脉注射后 3 d 进行第 2 次耳静脉注射 , 然后每
周注射 1 次 , 第 4 和第 5 周采血 , 抗血清加 0. 05 % N aN 3分装后于一 20 ℃下保存备 用 ;用健康
组培苗经与病原同样抽提过程而得的样品免疫家兔获得健康血清作为对照 。
取 45 9 新鲜健康组培苗(Z H 一 1 ) , 加 90 m L 抽提液经差速离心后的沉淀用 P B S , p H 7 . 4 悬
浮 , 并定容至 8 m L , 然后进行细胞超声破碎处理(300 m A , 5 m i n) , 加入 10 拼g / m L 的苯甲基
磺酞氟 PM S F 以抑制蛋 白酶活性 , 然后分装冷冻保存备用 。
取抗血清和以上健株抽提液按 1 : 1(V /V )比混合 , 于 37 ‘C 下孵育 3 h , 再于冰箱中静置 2
h , 然后离心 (10 00 0 rpm . , 10 m i n ) , 按抗血清与健株汁液 2 : 1 和 4 : 1 比例再次进行以上吸
收 处理 , 吸收后血清用 (N H 4)25 0 4 沉淀 Ig G , 然后于 4 ‘C 下对磷 酸缓冲液(pH 7.O , 含 0.13 M
N aC I)透析 48 h 后备用 。
1
.
4 间接免疫荧光显微镜镜检程序
此为对 da R oc ha 等方法川的修改程序 。 即用锋利的双面刀 片对待测组织 (茎 、 叶柄或叶
脉 )进行徒手切片 , 切片厚度为 10 一 50 拼m , 然后迅速移入含 1 m L 的 95 % 的预伶乙醇 (4 C )
的具盖小试管中 , 固定 15 一30 m in , 然后用 o.02 M P B S 一 N a CI 中冲洗 3 次 , 每次 5一 10 mi n , 然
后将吸收后的抗血清用缓冲液稀释 10 倍 , 每样品中加入 2 0 拌L 稀释抗血清 , 于 37 『C 下孵育 1
h , 然后于室温下用 PB S 一吐温 20 (P B S 中含 0. 05 % 吐温 20 )洗涤 3 次 , 每次 10一Zo n、i n , 再加
入商品化的异硫代氟氰酸荧光素 F IT C 标记的羊抗兔 IgG (军事医学科学院微生物 流行病所
研制)200 拼L (稀释 10 倍)于 37 C 下孵育 l一Z h 。 最后用 pB S 冲洗 3次 , 每次 10~ 20 m in , 然后
将切片置于荧光显微镜下镜检[‘。〕。
期 田国忠等:间接免疫荧光显微术检测泡桐丛枝病原 M LO 的研究
1 · 5 D A P I 染色方法
参见金开漩等[l] 的方法 。
2 结果和讨论
2.1 间接免疫荧光显微镜镜检结果 及与
D A PI染色技术的比较
间接免疫荧光显微镜镜检结果显示 , 病
组织横切片的韧皮部区域具强度不等的亮绿
色荧光斑(图版 I ) , 与用 D A PI 染色对比 , 证
明为筛管具 M LO 部位 , 而在健株对照切 片
中则不具此特异性荧光 。而且在多数情况下 ,
F I T C 荧光强度和密度与 D A PI 染色 的荧光
一样能反映 M L O 的浓度高低(见表 1) 。 由健
株对照抽提液制备的抗血清处理后的病苗或
健苗组织切片皆不出现韧皮部特异性荧光 。
在对休眠病枝的病原检测结果发现 , 用
D A P I 染色技术从休眠期(n 月至次年 4 月)
的病枝中检测到 M L O 的机率很低 , 而且存
在模棱两可的情况 , 而用免疫荧光法镜检时 ,
表 1 间接免疫荧光显微镜与 D A PI 染色技术
检测泡桐组织中 M L O 结果
植 物组织切片 韧皮部特异性荧光 强度F IT C 荧光强度 D A PI 荧光强度
C 85一 0 2 8 D + + + ~ + + + + + 十 + +
C 8 5 一 0 2 8 1 ) o 十 + + +
Q 4 D + + + +
C 8 5 一 O 3 4 D + + + + + +
F D + + + + + +
F D
一
1 十 + + 十 + ~ + + + +
Z H 一 一
Z卜{一 1 一 一
Q H 一 一
C 12 5 H 一 一
C 4 4 3 H 一 l 一 一
X U H 一 一
休眠病枝 一 1 + + + ( 一 )
休眠病枝 一 2 + 一
休眠枝 一 1 一 _
休眠枝 一 2 一 _
注 :休眠 枝 1 为 2 月份取 样 , 休眠枝 2 为 3 月份 取样 ;
“ + 一 + + + + ”示 M I O 特异荧光 由弱至强 , “ + ( 一 )" 示
M 以)荧光不 明显 , “一 ”示 M I O 荧光 。
则在休眠期各月份中休眠丛枝条的多数切片都观察到少量但易于鉴定的 M L O 特异荧光 (图
版 I 一 4 ) 。 在纵切片中则可观察到两个筛管之间的筛板上及周围的 M LO 一 FI T C 特异荧光 。 这一
结果与离体休眠病枝于温箱中进行萌芽试验 出现丛枝症状的结果相 吻合(待发表 ) 。 这表明
M L O 不仅可以在泡桐根部越冬 , 也可以在丛枝部位 越冬并于次年生长季节继续增殖而重新
弓l起症状 。
对经温度处理和茎尖培养脱毒的 4 个无性系 ZH 、 Q H 、 C 1 25 H 、 X U H 及 ZH 一 1 的继代培养
苗 , 用免疫荧光显微镜多次抽样镜检 皆表现为阴性反应 , 即病原 M L O 已被完全脱除 , 这与用
D A P I染色及电镜检查结果相一致〔’·’。〕。
从表 1 中还可发现 , 虽然抗血清可以用于检测所有来源的泡桐丛枝病原 M L O , 但来 自江
西分宜的病组培苗 FD 一 M L O 的 D A PI 和 FI T C 荧光强度似 乎有差别 。 由于制备抗血清的
M L O 抗原来自山东充州 , 可能与江西分离物存在株系差异 , 这有待于进一步研究证实 。 但免
疫荧光显微镜能够用于不同 M L O 株系划分及研究与其它植物上 M L O 的亲缘关系 , 则是电
镜 、 D A PI 染色等检测方法所不具有的优点 , 因而可以做为病原 M LO 分类和鉴定的手段 〔川 。
2
.
2 影响检测灵敏度和特异性的因素
2.2.1 切 片和 固定 徒手切片虽为基层单位的推广 、应用创造了条件 。 但厚薄不易掌握 。 虽
然免疫荧光技术和 D A PI 染色技术一样是根据切片组织的特异性荧光来判断病原的存在与
否 , 但由于两者的原理差异较大 , 因而切片方式和厚度对检测结果影响较大 。试验结果发现 , 当
病组织被沿筛管方向纵切片时 , 用 D A PI 染色后可清晰地观察到充满 M L O 荧光的线形筛管
分子 。 但用免疫荧光技术时则特异性荧光很弱或无特异性荧光 。 而且在横切 片时 , 当切片厚度
林 业 科 学 研 究 9卷
薄 (20 一 10 拌m )时 , 韧皮部出现的特异性的免疫荧光也大大低于用 D A PI 染色发出的 M LO
荧光 。 当切片厚度在 100一 40 0 拌m 范围时 , 两种测定方法的结果基本一致 。 由于以上现象多出
现在幼嫩的组培苗切片 , 故在过去的研究报道中未被注意 。 对出现这一现象的原因可能是 :即
D A PI染料为小分子化合物 , 可以渗透到具完整质膜的细胞 (包括完整筛管分子);而抗体为大
分子蛋白质 , 不能穿透质膜包围的筛管分子 , 只能与被切断或破损的筛管中的 M L O 发生特异
性结合 , 所以在纵切片或很薄的横切片中 , 筛管中的 M LO 最 易在固定和冲洗过程中脱离切片
而造成特异性荧光衰退 。 为了使抗体能进入完整细胞 , 可以用预冷乙醇(一 10 ℃ , 6 一8 m in) , 将
切片干燥处理或用 0.5 % ~ 0. 1% 的 T rit on X 一 1 0 处理来增加质膜的通透性 。 由于在植物休眠
期 , 枝条中筛管充满大量的脐服质〔’2〕, 造成 M LO 的移动性降低 , 因而切片厚度和切片方式对
病原检测影响也减小 。
本试验采用 95 % 乙醇固定切片证明是可行的 , 但 固定时间似乎超过 15 m in , 切片应在较
低的温度下操作效果更理想 。
2
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2
.
2 杭体纯度 本试验采用含 M L O 浓度高的组培苗为病原繁殖和抽提材料 , 因而抗原产
量较满意 。 加之经过 Per co U 密度梯度离心 , 因而与常规差速离心纯化方法相 比 , 寄主叶绿体 、
线粒体及其它细胞器成分大大降低 。 对密度梯度离心纯化后的病组织抽提抗原与健康对照抽
提物测定紫外吸收值 (A 26o/280) , 并计算蛋白质含量 , 结果显示病与健株抽提物的蛋白含量
比值为 1. 92 , 而仅经一次差速离心后抽提物的比值却低于 1. 0( 为 0.69) , 即健株抽提物的总
蛋白含量高于病株抽提物 , 这是因为健组培苗叶绿体含量明显高于病苗 , 而差速离心不能很好
地将 M L O 与叶绿体分离的缘故 。 可见经 Pe rc ol l密度梯度离心对提高 M LO 抗原纯度具有重
要作用 。
由于制备的抗血清中仍含有寄主抗原产生的非特异性抗体 , 所以还需用健株汁液吸收才
能使抗血清具有理想的检测效果 。试验结果显示 , 少量多次地用健株汁液吸收非特异抗体 比一
次吸收效果好 。 由于健株汁液 中存在的蛋白水解酶会降解血清蛋 白 , 因而在吸收过程或在健株
汁液中加入 P M S F 可以减缓血清效价下降 。 试验结果还表明 , 经吸收后的抗血清与再经硫酸
按沉淀的 IgG 用免疫荧光显微术测定病原 M LO 的特异性和灵敏度无明显差别 。 因而从简化
测定程序考虑 , 直接用抗血清进行测定即可获得满意的效果 。
2
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2
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3 冲洗方法 当抗原抗体反应后的冲洗时间和次数不足时 , 常在整个切片中出现非特异
性结合的荧光 。 所以抗原抗体反应后的冲洗次数不应少于 3 次 , 每次静置时间不少于 10 m in 。
在抗体与组织中 M L O 反应后的冲洗液中加入 0.05 % 的吐温 20 , 可有效地封闭组织表面未被
结合的位点 , 减少荧光抗体与组织表面物质的非特异性结合 。 荧光抗体反应后的冲洗液可用
PBS , 也可用 PB S 加吐温 20 , 冲洗时间长于 30 m in 会更好地减轻背景荧光 。
3 结 论
(l) 感染 M L O 的泡桐丛枝病组培苗是病原提纯和血清学制备的 良好材料 , 具有 M L O 含
量高 、杂菌污染少 、 易于大量繁殖和不受季节限制等优点 。
( 2) 本试验制备的 M L O 抗血清用免疫荧光显微镜检查 , 灵敏度和特异性都很理想 , 测定
方法较简便 , 材料用量少 , 可以通过组装简易试剂盒在基层病害检疫和种苗检验中采用 。
( 3) M L O 血清具很强的专化性 , 通过免疫荧光显微术及其它血清学方法 , 可 以对泡桐及
期 田国忠等:间接免疫荧光显徽术检侧泡桐丛枝病原 M LO 的研究
与其它植物上的 M L O 的株系进行比较鉴定和亲缘关系研究 。
( 4) 在应用此技术检测病原 M L O 时 , 必须注意切片方式和厚度 、抗体纯度及冲洗缓冲液
和冲洗时间对测定结果的影响 。
参 考 文 献l 金开玻 , 田国忠 , 汪 跃 .组织化学技术快速检翻泡桐丛枝病研究.植物病理学报 , 19 89 , 19 ( 3) : 18 5 ~ 18 8.
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期 田国忠等:间接免疫荧光显徽术检侧泡桐丛枝病原 M LO 的研究
与其它植物上的 M L O 的株系进行比较鉴定和亲缘关系研究 。
( 4) 在应用此技术检测病原 M L O 时 , 必须注意切片方式和厚度 、抗体纯度及冲洗缓冲液
和冲洗时间对测定结果的影响 。
参 考 文 献l 金开玻 , 田国忠 , 汪 跃 .组织化学技术快速检翻泡桐丛枝病研究.植物病理学报 , 19 89 , 19 ( 3) : 18 5 ~ 18 8.
2 田国忠.D A P I染色技术及其在树木类菌原体病害研究中的应用.河南林业科技 , 19 90 , (3 ) : 25 ~ 2 7.
3 朱本明 , 陈作义 , 沈菊英 , 等.泡桐从枝病类菌原体分离纯化及抗血清制备 . 生物化学与幸物物理学报 , 19 86 , 18 (6 ) :
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侧元球 , 金开狡 , 汪 跃.泡桐丛枝病类菌原体的抽提及其抗血清制备.林业科技通讯 , 1 9 86 , ( 6) : 23 ~ 25 .
丁正民.泡桐丛枝病的实验诊断.上海农学院学服 , 19 87 , 3( 2 ) : 6 3 ~ 70 .
袁巧平 , 田国忠 , 黄钦才.泡桐丛枝病原 M LO 在寄主离体培养组织中的保存与增殖 .植物病理学报 , 1 9 94 , 24 ( 2) :
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张锡津 , 田国忠 , 黄钦才.温度处理和茎尖培养结合脱除泡桐丛枝病类菌原体(M L O ).林业科学 , 1 9 94 , 3 0 ( 1 ) : 34 ~
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