全 文 ：高等植物具有非常灵敏精细的光感受系统和
信号转换系统, 以感应光信号的方向、光质和能
量,并调节其生长发育[1~3].光受体可分为 4种类型:
光敏色素(phytochrome)、隐花色素(cryptochrome)、
趋光素 (phototropin)和超级色素 (superchrome). 其
中, 隐花色素和趋光素都能吸收蓝光, 属于蓝光
收稿日期: 2013-04-11; 修回日期: 2013-05-26
基金项目: 国家自然科学基金资助项目（31171176）; 湖南省自然科学基金资助项目（11JJA002）; 湖南省青年骨干教师项目（521298864）
作者简介: 曾婷（1988-）, 女, 湖南邵阳人, 硕士研究生, 主要从事生物化学与分子生物学研究; *通讯作者: 刘选明（1963-）, 男, 湖南邵阳
人, 湖南大学生物学院教授, 博士生导师, 主要从事植物生化分析、发育分子生物学研究, Tel: 0731-88822606, E-mail: xml05@hnu.edu.cn.
拟南芥转录因子 HB22与 CRY1相互作用研究
曾 婷, 何志敏, 段桂芳, 赵小英, 唐冬英, 刘选明*
（湖南大学 生物学院, 化学生物传感与计量学国家重点实验室, 中国湖南 长沙 410082）
摘 要： 通过酵母双杂交的方法, 从拟南芥转录因子库中筛选出了 6 个与 CRY1 相互作用的转录因子. 为了测
定其中的 HB22 与 CRY1 相互作用的强度, 采用了 ONPG 与 CPRG 两种方法对其 β-半乳糖苷酶活性进行了分
析. 结果显示在蓝光光强为 50 μmol/m2s, 孵育时间为 4 h 的情况下, 蓝光与暗处理情况下的 β-半乳糖苷酶活性
比值分别为 1.668 和 2.18. 进一步设置蓝光处理时间及光强梯度实验数据显示, 在蓝光光强为 50 μmol/m2s 孵
育时间为 3 h 时, 二者相互作用强度达到最高. 说明 HB22 与 CRY1 的相互作用具有蓝光响应. 对蓝光处理不
同时间的野生型 col-4 与 cry1 缺失突变体的材料进行 HB22 基因的定量 PCR 分析, 发现拟南芥 cry1 缺失突变
体中该基因的表达量比野生型中高 , 在蓝光处理 2 h 时 , 缺失突变体中表达量为野生型中的 6 倍左右 . 说明
CRY1 可能介导蓝光抑制 HB22 基因表达.
关键词: 酵母双杂交; CRY1; 转录因子; 蓝光响应; 蛋白质相互作用
中图分类号: Q71 文献标识码: A 文章编号: 1007-7847（2013）03-0223-07
Research on the Interaction Between CRY1
and Transcription Factor HB22 in Arabidopsis
ZENG Ting, HE Zhi-min, DUAN Gui-fang, ZHAO Xiao-ying, TANG Dong-ying,
LIU Xuan-ming*
(College of Biological Sciences, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, Hunan University, Changsha
410082, Hunan, China)
Abstract：Yeast two-hybrid system was performed to screen CRY1 interaction proteins in Arabidopsis tran-
scription factors library, and six proteins were obtained. The interaction intensity between CRY1 and HB22,
which is one of the six proteins, were measured by using ONPG and CPRG assay with β-galactosidase The
result showed that the ratio of β-galactosidase activity in blue light or in the dark is 1.668 or 2.18 respec-
tively when irradiated with blue light (50 μmol/m2s ) for 4 h. Their interaction irradiated with blue light for
different time or with different fluence rates were further analyzed by CPRG. It was found that their interac-
tion was the strongest when incubated under 50 μmol/m2s blue light for 3 h . The mRNA level of HB22 was
then detected by real-time fluorescent quantitative PCR. It expressed higher in cry1 mutant than in col-4,
and 6 times higher than in col-4 when treated with blue light for 2 h. The results demonstrated that CRY1
may mediate blue light inhibition of HB22 gene expression.
Key words: yeast 2-hybrid analysis; CRY1; HB22; signal transformation of blue light; protein-protein interaction
（Life Science Research，2013，17（3）：223～229）
第 17 卷 第 3 期 生命科学研究 Vol．17 No．3
2013 年 6 月 Life Science Research Jun. 2013
DOI:10.16605/j.cnki.1007-7847.2013.03.015
生 命 科 学 研 究 2013 年
受体. 蓝光影响植物生长和发育, 植物的蓝光反
应包括抑制下胚轴伸长、刺激子叶扩展、调节开花
时间、向光性弯曲、气孔开放、引导昼夜节律时钟
和调节基因表达[4]. 拟南芥中存在 3个隐花色素基
因 CRY1、CRY2和 CRY3[5].隐花色素蛋白 CRY1和
CRY2均有可能参与拟南芥的向光性反应, 并介
导拟南芥中蓝光诱导的抑制植株下胚轴伸长的反
应. CRY1是一种可溶性蛋白, 存在于胞质内, 在
光刺激下与细胞膜发生相互作用诱发信号转导[6].
隐花色素除了调节蓝光诱导的茎伸长抑制反
应, 还参与幼苗去黄化反应, 开花的光周期调节、
生物钟及花色素苷合成酶基因表达调节等[7~9]. 突
变体分析表明, CRY1和 CRY2既有截然不同也
有部分重叠的功能. 在低强度的蓝光照射下, 光
形态建成是受 CRY1和 CRY2的活性调控, 但在
高强度的蓝光照射下则主要受 CRY1调控[10].
转录因子是一类可以直接结合或者间接作用
于基因启动子而形成具有 RNA聚合酶活性的动
态转录复合体的蛋白质因子,通过和顺式作用元
件的互作而对基因的表达起抑制或增强的作用[11].
CIB1是最新鉴定得到的一个与 CRY2在蓝光条
件下特异性相互作用的转录因子. 在 CRY2存在
的条件下, CIB1通过促进成花素基因 FT的表达
参与调节植物开花[12]. 因为 CRY1和 CRY2的同源
性极高, 且在植物体内的功能有较多的重叠, 因
而推测 CRY1介导的蓝光信号转导通路中, 也很
有可能存在与 CRY1相互作用的转录因子, 参与
调节拟南芥中包括去黄化、下胚轴伸长、子叶张开
等一系列光形态建成的生理生化反应.
本研究利用酵母双杂交技术, 以 CRY1为诱
饵蛋白, 从拟南芥的转录因子蛋白库中筛选其互
作蛋白, 为其后续的功能研究奠定基础.
1 材料与方法
1.1 材料
酵母双杂交系统为 GAL4系统. 诱饵质粒载
体是 pDEST32, 转入的菌株是 AH109; 猎物质粒
载体是 pDEST22, 转入的菌株是 Y187. 实验中所
用的两种菌株和质粒 pDEST32、pDEST32-CRY1、
E.coli DH5a菌株均为实验室保存. 已转入拟南芥
转录因子库的酵母菌库为美国林辰涛实验室提
供 . 拟南芥野生型 Col-4, 以及 cry1 突变体
（CRY1-304）为本实验室保存. Hepes、PEG 3350、
Tween 20、ONPG与 CPRG均购自 Sigma 公司, 其
他分子生物学常用试剂购自上海生工生物工程股
份有限公司. Taq DNA polymerase、酵母质粒提取
试剂盒与琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒购于天根
生物公司, 质粒小提试剂盒与 PCR纯化试剂盒购
于安比奥生物公司, Fermentas内切酶购于长沙海
洋生物公司.
1.2 酵母的转化与自激活检测、3-AT浓度的确定
采用醋酸锂转化法将质粒 pDEST32-CRY1
转化入 AH109 菌株, 通过对 3-氨基-1, 2, 4 三唑
(3-Amino-1, 2, 4Triazole, 3-AT) 浓度梯度缺陷型
平板上酵母的生长情况来确定抑制 His基因基础
表达的 3-AT水平, 观察有无自激活作用. 具体转
化方法如下:
将酵母接种于 YPD 液体培养基中, 30 ℃下
振荡培养过夜. 以最终 OD600大约等于 0.5的细胞
密度转种于 YPD培养液中扩大培养. 采用 30 ℃,
200 r/min 振荡培养至 OD600约为 2 时停止培养.
收集细胞, 把细胞悬浮在 100 mmol/L 醋酸锂中,
30 ℃条件下孵育 10 min. 去上清后将细胞悬浮于
100 mmol/L醋酸锂中. 将 1 μL单链载体 DNA样
品沸水浴 5 min, 快速在冰水中冷却. 振荡细胞悬
浮液, 取 50 μL 样品加到已标记好的离心管中,
离心沉淀细胞 , 去上清 . 按下列顺序依次加入:
PEG（50% W/V）100 mmol/L醋酸锂,单链载体 DNA
（10 g/L）, 水和质粒 DNA（0.1~10 μg）将反应管置
30 ℃恒温 30 min.置 42 ℃水浴中热激 30 min. 去
上清. 悬浮细胞. 将转化混合液涂布到选择性平
板上, 30 ℃, 70 μmol/m2s的蓝光培养或黑暗条件
下培养.
1.3 双杂交系统对拟南芥转录因子文库的筛选
和阳性克隆的确定
AH109菌株基因组中既不能产生 Gal4, 又不
能合成 Leu、Trp、His, 因此, 酵母在缺乏这些营养
的培养基上无法正常生长. 当两种载体所表达的
融合蛋白能够相互作用时, 功能重建的反式作用
因子能够激活酵母基因组中的报告基因 His、
LacZ等, 从而通过功能互补和显色反应筛选到阳
性菌落. X-gal是 β-半乳糖苷酶( β-galactosidase)的
显色底物, 在 β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色
产物. 将菌体涂布于 SD/-His-Leu-Try+100 mmol/L
3-AT平板上,待菌落生长到一定程度后,挑取部分
新鲜菌体于灭菌后的滤纸上,先用液氮处理 1 min,
再置于室温 1~2 min,反复冻融几次后用 2.5~5 mL
Z buffer/X-gal溶液浸没滤纸, 并置于 30 ℃培养箱
224
第 3 期 曾 婷等：拟南芥转录因子 HB22与 CRY1相互作用研究
中. 8 h之内, 阳性克隆的菌体颜色会变为蓝色,
而对照不变色; 8 h之后的实验结果不可靠.
将成功转入 pDEST32-CRY1 的 AH109 菌株
分别与已经成功转入拟南芥转录因子 cDNA文库
的酵母菌库一一进行融合反应. 然后涂布于 SD/-
Leu-Try平板上, 设立正对照和负对照. 将成功融
合的菌体在 1.2 中确定的 3-AT 浓度的 SD/-His-
Leu-Try平板上进行点板, 并进行 X-gal滤纸显色
反应, 以期获得能同时激活 3个报告基因的阳性
克隆. 提取阳性克隆的质粒, 转化大肠杆菌 DH5α
感受态, 经氨苄抗性筛选, 提取猎物质粒.
将猎物质粒与 pDEST32-CRY1 回转酵母
AH109, 将表型结果为阳性的猎物质粒送去测序,
然后利用 TAIR 网址上的 BLAST 工具对测序结
果进行分析.
1.4 β-半乳糖苷酶活性分析
ONPG可被 β-半乳糖苷酶水解为半乳糖和黄
色的邻-硝基苯酚（ONPG）, 在 410~420 nm波长
可以检测吸光度. 因此可以通过培养液颜色的变
化测知 β-半乳糖苷酶的活性 . 为了同时检测
HB22 与 CRY1 的相互作用是否具有蓝光响应 ,
设置实验中 4 组实验组为 pDEST22-HB22/
pDEST32-CRY1、pDEST32-CRY1/pDEST22、pDES-
T22-HB22/pDEST32、pDEST22/pDEST32, 分别设
置黑暗对照组. 蓝光强度为 50 μmol/m2s, 孵育时
间为 4 h. 挑取克隆于 SDⅡ液体培养基中, 30 ℃
过夜培养, 再转入 YPDA液体培养基中, 在蓝光
照射下扩大培养至 OD600=0.5～0.8. 液氮破碎细胞
后用 Z Buffer与 β-巯基乙醇处理并开始计时, 同
时设置空白对照, 用于分光光度计调零. 迅速加
入 ONPG后, 置于 30 ℃培养. 当管内出现黄色时,
加入碳酸钠终止反应 , 记录反应时间 (elapsed
time). 测算上清液的 OD420, 计算实验结果:
β-galactosidase units = 1 000 × OD420 /(t×V×
OD600). (1)
Where: t= elapsed time(/min) of incubation
V=0.1 mL × concentration factor*
OD600 = A600 of 1 mL of culture
The concentration factor is 5.
以邻-硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）为
底物检测酶活性, 其检测动力学范围为 6个数量
级. 氯酚红-β-D-半乳吡喃糖苷（CPRG）是另一个
可用比色法检测酶活性的底物 , 其灵敏度比
ONPG高近 10倍. 为了得到更准确的分析, 同时
进行 CPRG的分析方法, 作为 ONPG方法的验证
对照. 该方法中是用 Buffer1处理酵母细胞, 加入
Buffer 2 之后开始计时, 反应至黄色液体开始变
红的时候加入氯化锌终止反应, 记录反应时间(e-
lapsed time). 其余的操作处理与 ONPG的方法一
致. 测算上清液的 OD578, 计算实验结果:
β-galactosidase units = 1 000 × OD578 /(t×V×
OD600). (2)
Where: t= elapsed time( /min) of incubation
V=0.1 mL × concentration factor*
OD600=A600 of 1 mL of culture
The concentration factor is 5.
为了进一步探究 HB22与 CRY1蓝光下相互
作用的条件, 设置光强强度梯度为 0 μmol/m2s、25
μmol/m2s、50 μmol/m2s; 蓝光孵育时间梯度为 1 h、
2 h、3 h、4 h. 以期找出相互作用最强时的光强强
度和蓝光孵育时间. 实验方法同 1.2.4.
1.5 实时荧光定量 PCR 法检测蓝光对 HB22 基
因表达的调节
为研究蓝光对 HB22 基因表达的调节, 将拟
南芥野生型 col-4与 cry1缺失突变体的种子灭菌
并于 4 ℃黑暗处理 4 d后, 分别均匀分散播种在
MS固体培养基表面,置于 22℃黑暗培养室中生长.
种子于黑暗生长 6 d后立即转入 22 ℃蓝光
培养室中生长, 将材料置于 40 μmol/m2s 蓝光下
培养 0 、0.5 、1 、2 、4 、8 、12 、24 h后迅速收取材
料, 置于液氮里速冻. 储存于-80 ℃冰箱中.
对所有材料分别提取总 RNA, 去除 DNA 后,
进行 cDNA第一链的合成. 从 TAIR ( http: //www.
arabidopsis.org)网站检索 HB22 的 CDS序列, 采用
Primer 5 软件对目的基因的定量 PCR 引物进行
设计 , 序列送由上海生工合成 . 实时荧光定量
PCR 反应体系为 10 μL: DEPC 水 3.3 μL, SYBR
Green Mix 5 μL, 正反引物（10 μmol/L）各 0.1 μL,
ROX（5×）0.5 μL, 以及 cDNA模板 1 μL. 其中的
ROX为被动参考染料. 实时荧光定量 PCR 的反
应程序为: 95 ℃预变性 10 min, 95 ℃变性 30 s,
56 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 20 s, 反应 45个循环.
Actin2的表达水平被作为均一化内参. 所有检测
样品均设置 3个重复实验.
2 结果
2.1 CRY1 的自激活及毒性鉴定
为了检测 pDEST32-CRY1 表达的融合蛋白
225
生 命 科 学 研 究 2013 年
对实验中选用的酵母细胞有无毒性作用, 我们对
菌落以及菌液浓度进行分析. 将 pDEST32质粒和
pDEST32-CRY1分别转化 AH109感受态细胞, 接
种于 SD/-Try平板上, 长出的克隆菌落大小、颜色
正常. 挑取单克隆于 SD/-Try 中, 在 30 ℃、230 r/
min 条件下过夜培养. 测得转入 pDEST32-CRY1
的酵母菌液和转化入 pDEST32的对照组酵母菌
液的 A600均大于 0.8, 这表明 BD融合蛋白对酵母
AH109无毒性作用.
为了鉴定 CRY1蛋白是否具有自激活作用,
将 转 入 pDEST32-CRY1 和 pDEST22, 或 者
pDEST32 和 pDEST22 的酵母培养在含不同浓度
3-AT的 SD/-His-Try-Leu营养缺陷平板上, 结果发
现转入 pDEST32和 pDEST22的酵母在所有实验
平板上都不能生长 , 而转入 pDEST32-CRY1 和
pDEST22的酵母在不含或者含较低浓度 3-AT（0~
100 mmol/L）平板上均能生长, 当浓度高于 100
mmol/L 时酵母的生长受到抑制（图 1）, 说明
pDEST32-CRY1有自激活作用, 因此确定采用 100
mmol/L的 3-AT浓度作为后续研究的筛库浓度.
0 mmol/L
B D B D B D B D
10 mmol/L 50 mmol/L 100 mmol/L
pDEST32-CRY1/pDEST22
pDEST32/pDEST22
2.2 CRY1 相互作用蛋白的筛选和阳性克隆的
鉴定
将分别转入了 pDEST32-CRY1 和转录因子
质粒的酵母细胞一一融合 , 设置转入空载
pDEST32的酵母作为对照组, 同时设置黑暗组作
为蓝光实验组的对照, 全部接种于含 SD/-Try-Leu
平板上, 发现酵母生长状况良好（图 2）. 说明酵母
细胞融合成功, 可以进行下一步的筛选实验. 随
后, 将融合成功的酵母细胞接种于含 100 mmol/L
3-AT 的 SD/-His-Try-Leu 平板上生长 , 筛选得到
116个克隆. 对这些克隆进行 X-gal蓝色滤纸显色
实验, 发现其中有 6 个克隆变蓝, 说明这 6 个酵
母细胞中转入的转录因子和 CRY1可能发生了相
互作用, 因此初步确定这 6 个克隆为阳性克隆
（图 2）. 按照安比奥酵母质粒提取试剂盒说明书
提取阳性酵母质粒, 经扩繁得到 pDEST22猎物质
粒, 随后对其中的 6#C4克隆（后经测序确定其为
转录因子 HB22）与 CRY1的相互作用进行了定量
分析.
2.3 HB22与 CRY1的相互作用分析
为了进一步验证 HB22与 CRY1的相互作用
及强度, 采用 ONPG方法对 HB22与 CRY1的相
互作用进行了定量分析. 实验结果显示, 蓝光和
黑暗培养条件下 , 在转入 pDEST22-HB22/pDE-
ST32-CRY1 的酵母中都检测到了 β-半乳糖苷酶
酶活性（图 3）, 说明 HB22与 CRY1存在相互作
用. 此外, 蓝光培养酵母中 β-半乳糖苷酶酶活性
为黑暗培养酵母的 1.668倍（图 3）, 说明蓝光处
理可增强二者之间的相互作用 , 推测 HB22 与
CRY1之间的相互作用可能具有蓝光响应. 为了
得到二者相互作用强度更精确的数据, 我们采用
了灵敏度比 ONPG 高近 10 倍的 CPRG 方法对
HB22 与 CRY1 的相互作用进行了分析 . 实验结
果显示, 蓝光与黑暗组的酶活比值为 2.18（图 4）,
进一步证明 HB22与 CRY1存在相互作用, 而且
蓝光的处理会增强二者之间的相互作用.
2.4 HB22与 CRY1的相互作用的蓝光响应分析
为了进一步探究 HB22与 CRY1相互作用对
蓝光的响应, 设置光强强度梯度和蓝光孵育时间
梯度实验, 以期找出相互作用最强时的光强强度
和蓝光孵育时间.实验结果显示在孵育时间为 4 h
的情况下, 50 μmol/m2s光强下的相互作用强度大
于 25 μmol/m2s(图 5).
在光强为 50 μmol/m2s 的情况下, 相互作用
的强度从 1～3 h是一直增加的, 但是到 4 h时已
经呈现下降的趋势了（图 6）. 以上数据表明 CRY1
图 1 CRY1 蛋白的自激活鉴定
字母 B: Blue; 字母 D: Dark.
Fig.1 Test of pDEST32-CRY1 for auto-activation
Letter B: Blue; Letter D: Dark.
226
第 3 期
与 HB22相互作用的强度与蓝光强度和孵育时间
有关, 初步确定二者相互作用最强的蓝光孵育光
强为 50 μmol/m2s, 蓝光孵育时间为 3 h.
2.5 蓝光对 HB22基因表达的调节
为研究蓝光对 HB22 基因表达的调节 , 将
cry1缺失突变体和野生型拟南芥幼苗培养在黑暗
条件下, 6 d后转移到蓝光下处理不同时间, 收集
材料用于实时荧光定量 PCR 分析. 实验数据显
示, 该基因受瞬时蓝光诱导, 且在拟南芥 cry1缺
失突变体中表达量比野生型中高, 在蓝光处理 2
h时, 缺失突变体中表达量为野生型中的 6倍左
右（图 7）. 说明 CRY1可能介导蓝光抑制 HB22
基因表达.
3 讨论
蓝光信号转导涉及隐花色素与其他蛋白之间
图 4 CPRG 法对 HB22 与 CRY1 相互作用分析
Fig.4 Analysis of the interaction between HB22 and
CRY1 by CPRG method
图 2 诱饵蛋白和筛选出的阳性克隆相互作用的验证
字母 B: Blue; 字母 D: Dark.
Fig.2 Assay of the interaction between the bait and the positive clones
Letter B: Blue; Letter D: Dark.
SD／-Try-Leu
B D
SD／-His-Try-Leu
+100 mmol/L3-AT
X-gal
B D B D
pDEST22-3#A9/pDEST32-CRYI
pDEST22-3#E2/pDEST32-CRY1
pDEST22-6#C4/pDEST32-CRY1
pDEST22-7#A12/pDEST32-CRY1
pDEST22-9#F4/pDEST32-CRY1
pDEST22-11#G1/pDEST32-CRY1
pDEST22/pDEST32
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
pDEST22-HB22/
pDEST32-CRY1
pDEST32-CRY1/
pDEST22
Blue
Dark
β-
ga
la
ct
os
id
as
e
un
its
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
pDEST22-HB22/
pDEST32-CRYI
pDEST32-CRY1/
pDEST22
Blue
Dark
β-
ga
la
ct
os
id
as
e
un
its
pDEST22-HB22/
pDEST32
pDEST22/
pDEST32
图 3 ONPG 法对 HB22 与 CRY1 相互作用分析
Fig.3 Analysis of the interaction between HB22 and
CRY1 by ONPG method
曾 婷等：拟南芥转录因子 HB22与 CRY1相互作用研究 227
生 命 科 学 研 究 2013 年
图 6 不同蓝光孵育时间下 CPRG 法对 HB22 与 CRY1 相互作用的分析
蓝光光强为 50 μmol/m2s.
Fig.6 Analysis of the interaction between HB22 and CRY1 by CPRG method of different time
The light intensity is 50 μmol/m2s.
的直接相互作用. 隐花色素是类光解酶黄素蛋白,
且多为核蛋白 . 拟南芥的两个隐花色素基因 :
CRY1和 CRY2的 C端对他们的功能起决定性作
用[13], 能介导光调节基因的表达. 研究表明, 拟南
芥中 CRY1是调节光诱导类黄酮生物合成基因如
CHS表达的主要蓝光受体. CRY1的活性、存在形
式和亚细胞定位均受光的调控, CRY的许多功能
是通过与其他光受体共同作用实现的[14].
转录因子 (transcription factor, TF), 也称反式
作用因子 (trans-acting factor), 是位于细胞核内能
够与基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性
相互作用, 从而调控目的基因以特定的强度并在
特定的时间与空间表达的蛋白质分子[15]. 高等植物
的转录因子不仅在植物体的生长发育和形态建成
等生理活动中发挥重要的调控作用, 而且还与植
物体的次生代谢和抗逆反应密切相关[16]. HB22从
属于同源亮氨酸拉链（HDZip）转录因子家族, 该
家族成员在植物中种类繁多. HDZip家族基因在
植物发育过程中, 参与感应外部信号来调节植物
的生长, 其在花卉组织中都有表达而 HB22在老
花中表达量是最高的[17].
β-半乳糖苷酶的活性检测结果显示出 HB22
与 CRY1可能存在一定的相互作用, 且其作用强
度受到蓝光的影响. 实时荧光定量分析结果表明,
CRY1可能介导蓝光负调节该基因的表达. 以上
实验结果均显示出二者的相互作用关系, 但为了
进一步揭示二者之间相互作用的机制等信息, 则
需要更多方面的验证实验如体外的 GST-pull
down以及体内的荧光蛋白显色实验.
隐花色素信号转导是植物生长和发育过程的
图 7 实时荧光定量 PCR 法检测蓝光对 HB22 基因表达
的调节
Fig.7 Real-time fluorescent quantitative PCR method to
detect HB22 gene expression regulation under blue light
for different times
70
60
50
40
30
20
10
0
β-
ga
la
ct
os
id
as
e
un
its
0 1 2 3 4
pDEST22-HB22/pDEST32-CRY1
pDEST22-HB22/pDEST32
pDEST32-CRY1/pDEST22
pDEST22-/pDEST32
14
12
10
8
6
4
2
0
co14
Re
la
tiv
e
ex
pr
es
s
qu
an
tit
y
of
H
B2
2
0 0.5 1 2 4 8 12 24
cry1
图 5 不同强度蓝光下 CPRG 法对 HB22 与 CRY1 相互作用的分析
蓝光孵育时间为 4 h.
Fig.5 Analysis of the interaction between HB22 and CRY1 by CPRG method under different light intensity
The time irradiated with blue light is 4 h.
0
10
20
30
40
50
60
β-
ga
la
ct
os
id
as
e
un
its
pDEST22-HB22/pDEST32-CRY1
pDEST22-HB22/pDEST32
pDEST32-CRY1/pDEST22
pDEST22-/pDEST32
0 25 50
Light intensity/(μmol/m2s)
t/h
t/h
228
第 3 期
有机组成部分, 尽快鉴定出与光受体功能和调节
有关的所有基因是一项非常重要又紧迫的任务.
相信通过传统的蛋白质相互作用的分析方法, 并
充分利用生物信息学和基因组学、蛋白质组学等正
在飞速发展起来的相关知识和工具,在不久的将来
我们会逐步达到这个目标,并深入到更加复杂的问
题中去,即各个信号转导及通路是如何相互影响和
相互作用并最终影响植物的生长和发育的？
参考文献（References）:
[1] SULLIVAN J A , DENG X W. From seed to seed: the role of
photoreceptors in Arabidopsis development [J]. Developmental
Biology, 2003, 260 (2): 289-297.
[2] CAMPBELL T J, LI Scum E.Plant photobiology 2001: a thou-
sand points of enlightenment from receptor structures to eco-
logical adaptation[J]. Plant Cell, 2001, 13(8): 1704-1710.
[3] PEPPER A E, SEONG Kim M, HEBST S M, et al. A new set
of Arabidopsis mutants with exaggerated developmental re-
sponses to available red, far-red, and blue light[J]. Plant Phys-
iology, 2001, 127(1): 295-304.
[4] BRINGS W R CHRISTIE J M. Phototropins 1 and 2: Versatile
plant blue-light receptors[J]. Trends in Plant Science, 2002, 7
(5): 204-210.
[5] BRUDLER R, HITOMI K, DAIYASU H, et al. Identification of
a new cryptochrome class: structure, function, and evolution[J].
Molecular Cell, 2003, 11(1): 59-67.
[6] SARAH B, RINGo W, TILMAN K, et al. Single amino acid
substitution eveals latent photolyase activity in Arabidopsis
cry1[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2012, 51(37):
9356-9360.
[7] 朱春利, 张桂荣, 蔡爱军. 植物隐花色素结构与功能研究进
展[J].基因组学与应用生物学(ZHU Chun-li, ZHANG Gui-rong,
CAI Ai-jun, Plant cryptochrome research progress on the
structure and function[J]. Genomics and Applied Biology), 2009,
28(1): 174-178.
[8] 汪启明, 屠小菊, 唐冬英, 等. 拟南芥 18srRNA参与隐花色
素介导的信号转导途径的研究[J]. 湖南大学学报(自然科学
版) (WANG Qi-ming, TU Xiao-ju, TANG Dong-ying, et al. A
study of 18srRNA involved in cryptochrome-mediated signal-
ing in Arabidopsis [J]. Journal of Human University ( Natural
Sciences) ), 2010, 37(12): 66-71.
[9] 张继红, 邓克勤, 汪启明, 等. 拟南芥蓝光受体 CRY2的功
能及其介导的光形态建成[J].生命科学研究. (ZHANG Ji-hong,
DENG Ke-qin, WANG Qi-ming, et al. Function and photo-
morphogenesis of Arabidopsis blue-light photoreceptor CRY2[J].
Life Science Reserch), 2010, 14(1): 85-89.
[10] BANERJEE R, BATSCHAUER A. Plant blue light receptors[J].
Plant, 2005, 220(3): 498-502.
[11] 李洁.植物转录因子与基因调控[J]. 生物学通报(LI Jie. Plant
cryptochrome research progress on the structure and function
of plant transcription factors and gene regulation[J]. Biology Re-
port), 2004, 39(3): 9-11.
[12] LIU H, YU X, LI K, et al. Photo excited CRY2 interacts with
CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidop-
sis[J]. Science, 2008, 5907(322): 1535-1539.
[13] YANG Hong-quan, WU Ying-jie, TANG Rong-hang, et al. The
C termini of Arabidopsis cryptochromes mediate a constitutive
light response[J]. Cell, 2000, 103(5): 815-827.
[14] YANG Hong-quan, TANG Rong-hang, CASHMORE A R. The
signaling mechanism of Arabidopsis CRY1 involves direct in-
teraction with COP1[J]. Plant Cell, 2001, 13(12): 2573-2587.
[15] 刘强, 张贵友, 陈受宜, 等. 植物转录因子的结构与调控作
用[J]. 科学通报(LIU Qiang, ZHANG Gui-you, CHEN Shou-yi,
et al. The structure and function of plant transcription factors[J].
Chinese Science Bulletin), 2000, 45(14): 1465-1474.
[16] BUCK M J, ATCHLEY W R. Phylogenetic analysis of plant
basic Helix-Loop-Helix proteins[J]. Journal of Molecular Evolu-
tion, 2003, 56(6): 742-750.
[17] TAN Q K, IRISH V F. The Arabidopsis zinc finger-home-
odomain genes encode proteins with unique biochemical prop-
erties that are coordinately expressed during floral develop -
ment[J]. Plant Physiology, 2006, 140(3): 1095-1108.
曾 婷等：拟南芥转录因子 HB22与 CRY1相互作用研究 229