全 文 ：DOI:10.11931/guihaia.gxzw201606027
铁皮石斛 RCA2 基因克隆与生物信息学分析
蒋素华1，张燕1，王默霏1，王洁琼2，崔波1*
(1.郑州师范学院生物工程研究所，河南 郑州 450044；2.河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002)
摘要：核酮糖 1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶是光合碳同化作用的关键酶，它对调节铁皮石斛
Rubisco 活性和光合速率具有直接的作用，对其进行基因等方面的研究，会对改变植物光合
速率打下良好基础。该文以一年生铁皮石斛叶片为试验材料，采用 RT-PCR 和 RACE 技术
成功克隆了 Rubisco 活化酶（RCA）基因，并对其进行生物信息学分析。分析结果显示 RCA
基因全长 1730 bp，命名为 RCA2(GenBank 登录号 KT205842)，其中 5’-UTR 81 bp 、3’-UTR
326 bp，开放阅读框 1323 bp，编码 440 个氨基酸，分子质量为 48.53 KDa，等电点为 6.19，
包含 P-loop NTPase 超家族基因结构。氨基酸多重序列比对发现 RCA2 核苷酸序列与蝴蝶兰
的相似性高达 87%。RCA2 编码蛋白为亲水性蛋白；亚细胞定位于叶绿体基质；蛋白质二级
结构分析，α螺旋占 30.68%，延伸链占 25.45%，不规则折叠占 43.86%。RCA2 编码蛋白质
的功能预测发现，RCA2 在中间代谢起到了一个非常重要的角色。该研究发现对铁皮石斛光
合作用关键酶 Rubisco 的分析可为其光合作用特性的发掘提供理论基础，并为提高温室大棚
栽培效率提供理论依据。
关键词：铁皮石斛，RCA2 基因，克隆，生物信息学分析
中图分类号：Q949.71+ 8.43 文献标识码：A
Cloning and Bioinformatics Analysis of RCA2Gene in
Dendrobium Officinale
JIANG Su-Hua1,ZHANG Yan1,WANG Mo-Fei1, WANG Jie-Qiong2,CUI Bo1
(1. Institute of Bioengineering, Zhengzhou Normal University, Zhengzhou 450044, China;2.College of Life Sciences, Henan Agricultural
University, Zhengzhou 450002,China)
Abstract: Ribulose-1,5-bisphosphosphate carboxylase/oxygenase was
a key enzyme of photosynthetic carbon assimilation,it had direct adjustive effect on the
Dendrobium Officinale Rubisco activity and photosynthetic rate, laid a good foundation to change
plant photosynthetic rate by studying the gene.
The RCA gene was cloned from leaf of annual Dendrobium officinale using RT-PCR and RACE,
and was analyzed by bioinformatics. The results showed that the full length cDNA of RCA was
1730 bp length, the cloned RCA gene was named RCA2( GenBank accession No. KT 205842). It
was contained a 5-untranslated region (5-UTR) (81 bp), 3-UTR (326 bp)，and an opening
reading frame (ORF) (1323bp), which can be translated into a 410-amino-acid putative peptides
with a molecular weight of 48.53 kDa and a theoretical pI of 6.19，with a domain of
P-loop_NTPase super-family. Multiple sequence alignment results showed that the homology of
                                                              
收稿日期：2016-06-27 接受日期：2016-08-25
基金项目：河南省教育厅重点科研项目（14B180036）；郑州市科技发展计划项目（20150448）；郑州市重大科技专项
（141PZDZX038）。[Supported by Henan Province Office of Education key scientific research project（14B180036）；
Supported by project of scientific development of Zhengzhou（20150448）；Supported by major science and technology programs
of Zhengzhou（141PZDZX038）.]
作者简介：蒋素华（1983-），女，河南漯河人，硕士，讲师，主要从事花卉分子生物学研究，E-mail: jiangsuhua2006@163.com。
*通讯作者：崔波（1962- ），博士，教授，主要从事植物分子生物学研究，E-mail: laocuibo@163.com。 
网络出版时间：2016-10-21 09:37:52
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1134.Q.20161021.0937.002.html
nucleotide sequence between the RCA2 and the reported Phalaenopsis genes was 87%.
RCA2protein was belong to hydrophilic protein，Sub-cellular localization was in the chloroplast.
The RCA2 protein secondary structure components showed that a-helix(h), extended strand(e),
and random coil (c) accounted for 30.68%, 25.45%, and 43.86%. RCA2 encoding protein function
prediction found that RCA2 plays a very important role in intermediary metabolism This study of
the key enzyme-photosynthesis Rubisco in Dendrobium officinale could offer a theoretical basis
for the research of the photosynthetic characteristics, and provided the basis for improving the
efficiency of greenhouse cultivation.
Key words: Dendrobium officinale, RCA2 gene, Gene cloning, bioinformatics analysis
铁皮石斛（Dendrobium officinale）属于兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）多年
生的草本植物，铁皮石斛含石斛多糖、石斛碱、双苄酚类、菲酚类等多种药效成分，是石斛
属药用植物中最为珍稀名贵的种，具有滋阴清热、润肺止咳、益胃生津、明目强身等作用
(Zhang et al, 2000)。
核酮糖 1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶 (Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase /oxygenase，
Rubisco)是存在于叶绿体内的一个双功能酶，同时催化卡尔文循环中最初固定 CO2 的反应
以及光呼吸作用中的第一步反应，因此该酶处于光合碳还原和碳氧化两个方向相反但又相互
关联的循环交叉点上，对净光合速率起着决定性的影响，因此，提高 Rubisco 活力是提高光
合作用的重要途径(潘瑞炽等，2004)。因铁皮石斛原生地的生境破坏和常年的滥采乱挖，野
生资源遭到严重的破坏，濒临灭绝，已列入中国珍稀濒危保护植物的名录，还因为石斛不能
够栽培在土壤里，北方地区必须栽培在树皮、木块、锯末等做的栽培床或者是石头上，所以
冬天多数需要盖温棚等设施，投资较大，加上石斛种植的技术要求高, 目前市场尚未完全打
开等原因，发展速度还不是很快（张明等, 2010）。随着生物技术的发展，许多粮食作物如大
麦（Rundle &Zielinski，1991）、水稻(To et al,1999)、大豆（Yin et al，2014）等植物的 RCA
基因被克隆，目前研究报道的 RCA 基因很少有涉及药用观赏植物，最近仅见朱明库（2013）
等对羽衣甘蓝 Rubisco 活化酶基因 BoRCA 的克隆、生物信息学及表达分析的研究，袁秀云
（2016）等对蝴蝶兰 Rubisco 活化酶基因 PhRCAα 的序列特征及在低温胁迫下的表达分析
的研究，祝钦泷（2011）等对彩叶草 Rubisco 活化酶基因 SsRCA 进行了组织表达特异性和
光诱导表达特性研究，曾淑华等(2012)已从铁皮石斛中克隆了光合碳途径关键酶磷酸烯醇式
丙酮酸羧化酶基因，关于开展铁皮石斛 RCA 基因研究显得尤为必要。该研究为了提高石斛
的质量，提高石斛光合效率，揭示铁皮石斛光合作用机理自然成了铁皮石斛研究领域的重要
问题，该研究利用 RACE 技术克隆出铁皮石斛 RCA2 全长基因，并进行生物信息学分析，
为进一步研究铁皮石斛光合作用调节机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
铁皮石斛原产地为贵州，现在种植于河南省郑州市郑州师范学院兰花工程技术研究中心
智能日光温室，植物材料为一年生铁皮石斛。
1.2 试验方法
1.2.1 RNA 提取选取一年生铁皮石斛叶片，液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱备用。叶片总 RNA
提取采用多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒（Tiangen 公司）；采用 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定
RNA 的完整性；采用 Quawell Q5000 微量紫外可见分光光度计测定其 A260/A280 值及其浓度。
1.2.2 RCA2 基因全长的克隆以提取的叶片总 RNA 为模板，用反转录试剂盒合成单链
cDNA。根据 GENBANK 上已知植物的 RCA 保守区，利用 DNAMAN 和 Primer 5.0 生物软
件设计兼并引物（表 1），扩增 RCA 保守片段。PCR 反应体系为 20.0 μL：10×PCR buffer 2.0
μL、dNTP Mix 2.0 μL、上游引物 RCA-F1( 10 μmol·L-1) 1.0 μL、下游引物 RCA-R1( 10
μmol·L-1)1.0 μL、模板 cDNA 1.0 μL、rTaq 酶 ( 5 U·μL-1 ) 0.2 μL，加灭菌双蒸水至总体积 20.0
μL；反应程序为 94℃预变性 5 min；94℃变性 40 s，56 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 40 s，35 个
循环；最后 72 ℃延伸 10 min。切胶回收目的片段，连接 pGEM-T Easy 载体，转化大肠杆
菌 DH5α，挑选阳性克隆送至上海英潍捷基生物技术公司测序，获得 RCA 基因的保守区序
列。再根据获得的保守区序列，分别设计 5端和 3 端特异性巢式引物（表 1），以叶 cDNA 为
模板，用巢式 PCR 方式分别扩增 RCA 的 5 端和 3 端序列，按 Clontech 公司 SMARTerTM
RACE 扩增试剂盒操作说明进行反应，回收扩增目的产物，克隆到 pGEM-T Easy 载体上，
转入大肠杆菌 DH5α菌株，进行测序和拼接。
1.2.3 ORF 的扩增根据 DNAMAN 软件拼接得到 RCA 基因序列全长，利用 Premier 5.0 设
计 1 对特异引物 RCA-F2 和 RCA-R2（表 1），用于完整开放阅读框（ORF）的扩增。PCR
扩增程序为 94℃预变性 5 min，94 ℃变性 45 s，58 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，进行
35 个循环，72 ℃延伸 15 min。ORF 片段连接到 pGEM-T Easy 载体上，转化大肠杆菌 DH5α，
测序进行 ORF 序列验证。
1.2.4 生物信息学分析利用 ORFfinder 进行开放阅读框的预测；利用 NCBI 上的 BLAST
进行基因相似性的分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)；利用 DNAMAN 进行氨基酸序列
比对分析；利用 ProtScale 程序(http:// expasy.org/tools/protscale.html)分析蛋白质亲疏水性；
利用 TargetP 软件(Using PLANT networks)和 PSORTll(http://psort.hgc.jp/form.html)进行亚细
胞定位的分析；利用 Protfun(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）分析预测 RCA2 蛋白质
结构功能和功能分类；利用 ExPASy 网站上的 GOR 进行蛋白质二级结构预测；利用 ExPASy
网站上的 SWISS-MODEL 进行蛋白质三级结构的预测分析。
表 1 PCR 引物
Table 1 PCR primers
引物名称
Primer name
引物序列
Sequence
用途
Purpose
RCA-F1
RCA-R1
5-GAYGACCAGCAGGACATAACCA-3
5-TTGTTGACGGTGTACTGGGTG-3
保守片段扩增
Conserved fragm ent cloning
GSP1
GSP2
5-TGTGCTGCCTCTTCATCAATG-3
5-ACCACCCAGTACACCGTCAA-3
3端 RACE 引物
The3end RACE primer
GPS3
GPS4
5-ATACTGACGAAGACCTTGGCTGAT-3
5-CACCCTTTCCTCTGGTTATGTCCT-3
5端 RACE 引物
The 5end RACE primer
RCA-F2
RCA–R2
5-CCTCACCTTCAGCTATGGCC-3
5-CGCTAACCATAGAAAGAACCAGTCT-3
RCA 编码区克隆
RCA ORF cloning
2 结果与分析
2.1 RCA2 基因全长克隆
叶片总 RNA 提取后经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，检测结果显示，28S 和 18S
条带清晰，OD260/280 值 1.96，浓度为 210.56 ng·μL-1。
以铁皮石斛叶片总 RNA 反转录的 cDNA 为模板，以兼并引物 RCA-F1 和 RCA-R2 进行
保守区片段 PCR 扩增，得到一个 503 bp 保守片段（图 1-B），根据设计的 3 端和 5 端特异
引物，采用 RACE 技术，扩增获得 3′端目的片段(图 1-D)和 5 端目的片段（图 1-C）。利
用生物软件 DNAMAN 进行序列拼接得到该基因的全长为 1730 bp，利用 ORFfinder 分析，
共有 9个ORF，该基因最长的ORF共计 1323bp, 包含 81 bp 的 5′-UTR、326 bp 的 3′-UTR,
编码 440 个氨基酸，将该基因命名为 RCA2，GenBank 登陆号为 KT205842。利用引物 RCA-F2
和 RCA-R2 扩增获得 1323 bp ORF 片段（图 1-A），连接到 pGEM-T Easy 载体上测序验证，
得到的阳性质粒命名为 pGEM-RCA2。













A B C D









2.2 RCA2 基因全长的生物信息学分析
2.2.1 RCA2 核苷酸及编码蛋白序列的理化性质
利用 blastp 和 DNAMAN 对 RCA2 氨基酸序列进行比对分析，发现该基因包含 P-loop
NTPase Superfamily 结构域，分别为“WGGKGQGKS”（A 区）和“GKMCCLFINDLD”(B 区)，
属于 P-loop NTPase 超家族基因（图 2）。理化性质分析该蛋白的分子质量为 48.53 KDa，等
电点为 6.19。将该基因全长核苷酸序列在 NCBI 上进行 blastn 相似性比较，结果表明基因均
为 RCA 基因，且与蝴蝶兰（Phalaenopsis）的相似性高达 87%。氨基酸序列比对分析，发现
其氨基酸序列与蝴蝶兰、葡萄、荷花的相似性分别为 89%、84%、85%（图 3）。

图 2 RCA2 蛋白的功能域分析
Fig.2 Function domain analysis of RCA2protein
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图 1 RCA2 基因扩增结果
Fig.1 Amplification results of gene RCA2
A：开放阅读框扩增；B：保守片段扩增；C：5′RACE 扩增；D：3′RACE 扩增；M：Marker 2000
1：ORF 扩增产物；2：保守片段；3：3′RACE 产物；4：5′RACE 产物
A: Amplification products of ORF; B: Conserved region amplification; C: Amplification products of 3 RACE; D: Amplification products of 5
RACE; M: Marker 2000
1: Amplification products of primers ORF; 2: Conserved region; 3: Amplification products of 3 RACE; 4: Amplification products of 5 RACE

图 3RCA2 的氨基酸序列比对
Fig.3 Alignment of the predicted amino acid sequence ofRCA2
2.2.2 RCA2 编码蛋白质的亲疏水性分析
利用 ProtScale 分析蛋白的亲疏水性发现， RCA2 蛋白质序列具有较高的亲水性，其中
第 69 位的 Thr 亲水性最强（-3.078），第 162 位 Leu 的疏水性最强（2.122）（图 4）。


图 4 RCA2 蛋白的亲疏水性预测
Fig .4 The hydrophilic-hydrophobic property prediction of RCA2 protein


70 Dendrobium officinale 铁铁铁铁
68 Phalaenopsis hybrid cultivar 蝴蝴蝴
67 Vitis vinifera 葡葡
67 Nelumbo nucifera 荷荷
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140 Dendrobium officinale 铁铁铁铁
138 Phalaenopsis hybrid cultivar 蝴蝴蝴
137 Vitis vinifera 葡葡
137 Nelumbo nucifera 荷荷
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210 Dendrobium officinale 铁铁铁铁
208 Phalaenopsis hybrid cultivar 蝴蝴蝴
207 Vitis vinifera 葡葡
207 Nelumbo nucifera 荷荷
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280 Dendrobium officinale 铁铁铁铁
278 Phalaenopsis hybrid cultivar 蝴蝴蝴
277 Vitis vinifera 葡葡
277 Nelumbo nucifera 荷荷
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350 Dendrobium officinale 铁铁铁铁
348 Phalaenopsis hybrid cultivar 蝴蝴蝴
347 Vitis vinifera 葡葡
347 Nelumbo nucifera 荷荷
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420 Dendrobium officinale 铁铁铁铁
418 Phalaenopsis hybrid cultivar 蝴蝴蝴
417 Vitis vinifera 葡葡
417 Nelumbo nucifera 荷荷
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440 Dendrobium officinale 铁铁铁铁
473 Phalaenopsis hybrid cultivar 蝴蝴蝴
473 Vitis vinifera 葡葡
473 Nelumbo nucifera 荷荷
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2.2.3 RCA2 编码蛋白质的亚细胞定位
蛋白的亚细胞定位与该蛋白所执行的功能是密切相关的，用 TargetP 和 PSORT II 软件进
行亚细胞定位分析，TargetP 预测结果显示 RCA2 蛋白定位于叶绿体基质，可信度为 3（图
5-A），用 PSORT II 预测蛋白显示，RCA2 蛋白定位于叶绿体基质、线粒体基质间隙、叶绿
体类囊体膜、叶绿体类囊体腔，RCA2 蛋白主要存在于叶绿体基质。（图 5‐B）。 
 
 
 
 
 
 
 
图 5 RCA2 蛋白亚细胞定位
A：TargetP 软件预测结果 B：PSORT II 软件预测结果
Fig. 5 RCA2 protein sub-cellular localization.
A: TargetP prediction B: PSORT II prediction
2.2.4 RCA2 编码蛋白质的功能预测与分析
利用 Protfun software of CBS 分析预测 RCA2 蛋白质结构功能和功能分类，可能有意义
的功能包括中间代谢、脂肪酸代谢、翻译、辅酶因子的生物合成和能量代谢等，他们的几率
分别是 5.484、4.387、4.048、3.639、3.098。这表明 RCA2 在中间代谢起到了一个非常重要
的角色，在脂肪酸代谢、翻译中起到了重要作用，在辅酶因子的生物合成和能量代谢中也起
到了关键作用。
2.2.5 RCA2 编码蛋白质的二级、三级结构预测
采用 ExPASy 网站上的 GOR 进行蛋白质二级结构预测，结果表明，α 螺旋占 30.68%，
延伸链占 25.45%，不规则折叠占 43.86%（图 6）。用 ExPASy 网站上的 SWISS-MODEL
Workspace 预测蛋白质的三维结构以 4w5w.1.A（SMTL id）为模板进行建模，该模板以 X-RAY
2.90 Å 方法产生，与 RCA2 蛋白一致性为 86.02%（图 7）。
10 20 30 40 50 60 70
| | | | | | |
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Certainty= 0.644(Affirmative)
< succ>
mitochondrial matrix space ---
Certainty= 0.570(Affirmative)
< succ>
chloroplast thylakoid membrane
--- Certainty=
A
### targetp v1.1 prediction results
##################################
Number of query sequences: 1
Cleavage site predictions not included.
Using PLANT networks.
Name Len cTP mTP SP other Loc
RC
seq1 440 0.683 0.173 0.047 0.051 C
KDRWGGLAYDQSDDQQDITRGKGMVDSLFQAPMGDGTHVAVMNSYEYLSKGLRTYNLDNTVDGFYIAPAF
hccccceeeccccchhhhhhcccceeeeeccccccceeeeeecchhhhcccceeecccccccceeechhh
MDKLVVHITKNFMTLPNIKVPLILGVWGGKGQGKSFQCELVFAKMGINPIMMSAGELESGNAGEPAKLIR
hhhhhhhhhhccccccccceeeeeeeccccccccceeeeeeeeeccccceeeeeccccccccccchhhhh
QRYREAAEIIKKGKMCCLFINDLDAGAGRMGGTTQYTVNNQMVNATLMNIADNPTNVQLPGLYNKQENAR
hhhhhhhhhhhhccceeeeecccccccccccceeeeeecceeeeeeeeeecccccccccccccccccccc
VPIIVTGNDFSTLYAPLIRDGRMEKFYWAPTREDRIGVCIGIFRTDNIAQEDIVKLVDTFPGQSIDFFGA
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LRARVYDDEVRKWIEDVGVDRVGKRLVNSREGPPTFEQPKMSLEKLLEYGNMLVQEQENVKRVQLADKYL
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SEAALGDANEDAMKTGSFYG
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将质粒 pGEM-RCA2 经限制性内切酶 XbaI 和 SalI 消化后回收 1724bp 小片段；
3 讨论与结论
该研究通过 RT-PCR 和 RACE 技术方法，成功克隆了铁皮石斛 RCA2 基因（GenBank 登
录号 KT205842）全长 1730 bp，开放阅读框 1323 bp，编码 440 个氨基酸；核苷酸序列分析
结果表明，RCA2 核苷酸序列与蝴蝶兰（Phalaenopsis）的相似性高达 87%，其编码蛋白属
于P-loop NTPase Superfamily家族基因。蛋白理化性质分析该蛋白的分子质量为48.53 KDa，
等电点为 6.19，为亲水性蛋白，RCA2 编码蛋白质的亚细胞定位于叶绿体基质；编码蛋白质
的功能包括中间代谢、脂肪酸代谢、翻译、辅酶因子的生物合成和能量代谢等，蛋白质三级
结构预测模型与 RCA2 蛋白一致性为 86.02%，这些生物学参数为进一步研究 RCA2 蛋白的
酶学性质及其在铁皮石斛中的光合作用机理奠定了理论基础。
Rubisco 作为光合速率的限制性因子，近些年已成为提高植物光合效率的研究目标之
h：α螺旋，e：延伸链，c：不规则折叠
图 6 铁皮石斛 RCA2 蛋白的二级结构预测
h: Alpha helix, e: Extended strand, c: Random coil
Fig .6 Prediction of second stucture for protein of RCA2 fromDendrobium officinale
图 7 铁皮石斛 RCA2 蛋白的三级结构预测
Fig .7 Prediction of 3D stucture for protein of RCA2 fromDendrobium officinale
一，而 RCA 对维持 Rubisco 的净光合速率及初始羧化活力均有重要调节作用（张国等，
2005） RCA 自被 Salvucci(2005)等在拟南芥中报道以来，一直是农业生物工程研究关注的
焦点。当 RCA 基因表达量降低时，植物的光合速率随之下降，生长也变慢, 因此通过调控
RCA 的表达提高光合作用，最终实现植株产量的增加，将会有广泛及良好的前景(Chen et al,
2008; 李海霞等, 2010)。Rubisco 活化酶能维持并调节植物 Rubisco 的活性，使 Rubisco 的
活性位点因为与磷酸糖类物质的结合而导致活性降低的不利影响得到最大程度的抑制，且能
够降低 Rubisco 去氨基甲酰化时所需 CO2 的浓度，显著提高 Rubisco 的活性，因此对调节
植物光合速率有着直接作用 (PORTIS, 2003；Salvucci et al, 2004; Zhang et al, 2002)。铁皮石
斛是药用观赏植物，其 RCA 基因的分子克隆、生物信息学的研究，为研究其他药用观赏植
物 RCA 基因的结构及功能提供了参考和借鉴价值，并为进一步研究 Rubisco 活化酶在铁皮
石斛光合作用中的功能和分子调控机理奠定了基础，其进一步的相关研究工作正在进行中。
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