全 文 ：彩叶凤梨离体培养中外植体消毒及防止褐化的研究
史华平1，王彦尊2，王计平2* (1．山西省农业科学院果树研究所，山西太谷 030815;2．山西农业大学农学院，山西太谷 030801)
摘要 ［目的］研究彩叶凤梨离体培养过程中外植体消毒及褐化的防止措施。［方法］以彩叶凤梨幼苗茎段作为外植体材料，研究其消毒
和褐化防止问题。［结果］减少培养基中无机盐浓度，外植体选用0． 1%升汞溶液消毒10 min，并在MS诱导培养基中添加200 mg /L的抗
坏血酸，能够有效防止褐化，而且不影响愈伤组织的进一步分化。［结论］研究结果为彩叶凤梨离体培养奠定基础。
关键词 彩叶凤梨;离体培养;外植体;消毒;褐化
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2015)03 －047 －03
Studies on Disinfection and Anti-browning during the Tissue Culture of Neoregelia carolinae
SHI Hua-ping1，WANG Yan-zun2，WANG Ji-ping2* (1． Pomology Institute，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taigu，Shanxi
030815;2． College of Agronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu，Shanxi 030801)
Abstract ［Objective］The aim was to study disinfection and anti-browning during the tissue culture of Neoregelia carolinae． ［Method］In this
experiment，with the seedling stems of Neoregelia carolinae as explants，study on the problems in disinfection and browning of Neoregelia caroli-
nae tissue culture was carried out． ［Ｒesult］Ｒesults showed that the explant browning could be alleviated by reducing the salt concentration of
medium and explants treated with 0． 1% HgCl2 for 10 min during in vitro culture． Ｒesults also showed that the medium supplemented with 200
mg /L Vc could prevent browning effectively，and did not produce bad effects on growth of Neoregelia carolinae explants．［Conclusion］The study
provided basis for tissue culture of Neoregelia carolinae．
Key words Neoregelia carolinae;Tissue culture;Explant;Disinfection;Browning
基金项目 山西省科技攻关项目(20130311019 － 2) ;国家自然科学基
金项目(31201266)。
作者简介 史华平(1974 － ) ，男，山西昔阳人，助理研究员，从事植物组
织培养技术研究。* 通讯作者，副教授，博士，从事植物生
理与分子生物学研究。
收稿日期 2014-12-05
彩叶凤梨(Neoregelia carolinae)又名赪凤梨、五彩凤梨，
为凤梨科彩叶凤梨属植物。原产于巴西，无明显休眠期，喜
温暖、湿润和阳光充足的环境，不耐寒，怕干燥和强光暴
晒［1］。我国彩叶凤梨的栽培时间不长，从 20 世纪 80 年代开
始进入引种阶段，至今仅有小批量的生产，主要集中在广东、
海南、福建和云南昆明等地。
彩叶凤梨通常以分株、播种繁殖为主，时间限制十分明
显，而且生长缓慢，繁殖率低，且苗不整齐，通过植物组织培
养技术可以大大提高其繁殖率［1 －2］，短期内获得大量整齐一
致的种苗，因此通过组织培养快速繁殖凤梨是一条很理想的
途径。然而，在离体培养过程中，首先遇到的是外植体严重
褐化而导致培养物死亡的问题，笔者针对该问题，对彩叶凤
梨离体培养过程中外植体消毒及褐化的防止措施进行了研
究。
1 材料与方法
1． 1 试验材料 以山西农业大学农学院组培试验室提供的
彩叶凤梨为材料，取其幼苗茎段作为外植体材料。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 外植体的处理与消毒。
1． 2． 1． 1 材料预处理。取彩叶凤梨幼苗，流水冲洗干净，切
下其茎段，在无菌条件下用 75%乙醇表面消毒 30 s，用消毒
剂消毒，最后无菌水清洗 6 ～8 次，用无菌滤纸吸干材料表面
水分后备用。
1． 2． 1． 2 表面消毒剂的筛选。分别用 2%、5% NaClO 及
0. 1%、0． 2%的 HgCl2 溶液按如下设置进行外植体消毒。①
2%的 NaClO消毒 10 min;②2%的 NaClO消毒 20 min;③2%
NaClO消毒 30 min;④5%的 NaClO消毒 10 min;⑤5%NaClO
消毒 20 min;⑥5%NaClO消毒 30 min;⑦0． 1%HgCl2 溶液消
毒 5 min ;⑧0． 1% HgCl2 溶液消毒 10 min;⑨0． 2% HgCl2 溶
液消毒 5 min;⑩0． 2%HgCl2 溶液消毒 10 min。每处理 20 个
外植体，重复 3次。
1． 2． 1． 3 外植体处理时间的确定。用 0． 1%HgCl2 溶液按以
下时间设置对茎段外植体进行消毒处理。①0． 1% HgCl2 溶
液消毒 3 min;②0． 1% HgCl2 溶液消毒 5 min;③0． 1% HgCl2
溶液消毒 7 min;④0． 1% HgCl2 溶液消毒 10 min;⑤0． 1%
HgCl2 溶液消毒 15 min。消毒的外植体接种于无菌培养基
上。培养基配方为 MS +6-BA 3． 0 mg /L + NAA 0． 1 mg /L，附
加 0． 6%琼脂和 3%蔗糖，pH 5． 6 ～ 5． 8。每处理 20 个外植
体，重复 3次。培养 20 d后，统计外植体污染率，死亡率，存
活率。
1． 2． 2 外植体褐化的防止。研究不同基本培养基及消毒剂
的种类和处理方法对外植体褐化的影响，每个处理接种 20
个，设 3次重复。
1． 2． 2． 1 不同消毒剂处理对外植体褐化的影响。取彩叶凤
梨的幼苗茎段，流水洗净后设 6 个处理:①在无菌条件下用
75%乙醇表面消毒30 s后，于0． 1%HgCl2 溶液消毒7 min;②
用 75%乙醇表面消毒 30 s 后，于 0． 1% HgCl2 溶液消毒 10
min;③用 75%乙醇表面消毒 30 s后，于 0． 1% HgCl2 溶液消
毒 15 min;④直接用0． 1% HgCl2 溶液消毒 7 min;⑤直接用
0. 1%HgCl2 溶液消毒 10 min;⑥直接用 0． 1% HgCl2 溶液消
毒 15 min。
1． 2． 2． 2 不同基本培养基对外植体褐化的影响。将基本培
养基设为 MS、1 /2MS、N6和 B5 4种类型，分别附加 6-BA 3． 0
mg /L及 NAA 0． 1 mg /L，分析不同培养基类型对彩叶凤梨外
植体褐化的影响。
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2015，43(3):47 － 49 责任编辑 李占东 责任校对 李岩
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2015.03.016
1． 2． 2． 3 不同浓度抗坏血酸处理对外植体褐化的影响。在
培养基中添加不同浓度抗坏血酸(Vc)，以没有任何防褐化
处理的外植体作为对照，筛选抗坏血酸防止外植体褐化的最
适浓度。
2 结果与分析
2． 1 外植体材料的处理
2． 1． 1 消毒剂对外植体消毒效果的影响。从表 1 可以看
出，2% NaClO处理 10 min的污染率达到 62． 1%，存活率为
34． 4%，而 5% NaClO处理 20 和 30 min的存活率达到 68%
左右;0. 1%和 0． 2% HgCl2 消毒 5和 10 min的存活率均保持
在 70%以上;表明 2种灭菌剂对彩叶凤梨幼苗茎段外植体消
毒效果之间存在显著差异，不同浓度 HgCl2 消毒效果均优于
NaClO，污染率降低，存活率提高。对存活率分析表明，处理
⑧是彩叶凤梨茎段外植体较适宜的消毒方法，即 0． 1%
HgCl2 消毒 10 min，外植体存活率高达 92． 6%。
表 1 消毒剂对茎段消毒效果的影响 %
处理 污染率 死亡率 存活率
① 62． 1 3． 5 34． 4
② 45． 2 2． 6 52． 2
③ 36． 0 3． 0 61． 0
④ 58． 2 4． 3 37． 5
⑤ 23． 5 8． 4 68． 1
⑥ 17． 6 14． 8 67． 6
⑦ 14． 2 11． 8 74． 0
⑧ 2． 0 5． 4 92． 6
⑨ 8． 3 5． 2 86． 5
⑩ 1． 8 18． 4 79． 8
2． 1． 2 处理时间对外植体消毒效果的影响。为了进一步确
定 0． 1%HgCl2 对外植体材料的最佳处理时间，分别设置了 5
个处理时间进行消毒，结果见表 2。由表 2可知，随着处理时
间的延长，外植体污染率逐渐降低，死亡率升高，说明较长时
间 HgCl2 处理会对外植体材料造成一定伤害。5个不同处理
时间中，0． 1%HgCl2 处理 3 min外植体的死亡率虽然是 0，但
外植体的污染率却达到 64． 5%，存活率也只有 35． 5%;而用
0． 1%HgCl2 处理 7 ～15 min，虽然外植体有一定的污染，但死
亡率较低，其存活率在 80%左右，结果表明，处理④即 0． 1%
HgCl2 消毒 10 min，外植体存活率高达 92． 6%，消毒效果最
好，是较适宜的外植体处理时间。
表 2 处理时间对外植体材料消毒效果的影响 %
处理 污染率 死亡率 存活率
① 64． 5 0 35． 5
② 14． 2 11． 8 74． 0
③ 8． 5 10． 3 81． 2
④ 2． 0 5． 4 92． 6
⑤ 2． 3 18． 1 79． 6
2． 2 外植体褐化的防止
2． 2． 1 不同表面消毒方式对外植体褐化的影响。由表 3 可
知，用 75%乙醇处理外植体材料，明显加剧了褐化程度，处理
后 1 d即出现中度褐化;0． 1%HgCl2 溶液消毒 10 或 15 min，
褐化现象也较明显，而用0． 1%HgCl2 溶液消毒7 min，外植体
褐化程度较轻，表明用 0． 1% HgCl2 溶液消毒处理对褐化的
影响较小。
表 3 不同表面消毒方式对外植体褐化的影响
处理
处理时间∥d
1 2 3 4
① + + + + + + + + + + +
② + + + + + + + + + + +
③ + + + + + + + + + + + +
④ + + + + + + + +
⑤ + + + + + + + + +
⑥ + + + + + + + + + + +
注:N．没有褐化，+ ．轻度褐化，+ + ．中度褐化，+ + + ．严重褐化。
2． 2． 2 不同基本培养基对外植体褐化的影响。过高无机盐
浓度会引起某些植物外植体中酚类物质氧化，引起褐变;培
养基的状态及硬度也会影响外植体褐化程度。以MS培养基
作为对照，分别附加相同激素成分，蔗糖 3%，琼脂0． 6%，pH
5． 6 ～5． 8。
表 4 基本培养基对外植体褐化的影响
培养基
处理时间∥d
1 2 3 4
MS + + + + + + + +
1 /2MS + + + + + + +
N6 + + + + + + +
B5 + + + + + + +
注:N．没有褐化，+ ．轻度褐化，+ + ．中度褐化，+ + + ．严重褐化。
由表 4可知，MS培养基比其他培养基褐化速度更快，而
其他 3种培养基之间则无明显差异。
2． 2． 3 不同浓度抗坏血酸对外植体褐化的影响。在 MS 培
养基中添加 50、100、200 和 300 mg /L抗坏血酸，对外植体褐
化有一定的抑制效果(表 5)，其中，较低浓度抗坏血酸在培
养初期有防褐作用(50 mg /L在 6d前，100 mg /L在 8d 前) ，
200和 300 mg /L抗坏血酸能够很好地防止彩叶凤梨外植体
褐化的产生。
防褐化剂对愈伤组织和不定芽的产生有不同的影响，所
以在添加抗坏血酸的培养基中培养茎段 20 d时，对不定芽和
愈伤组织的产生进行了记录，发现都有不定芽的产生，叶片
也有愈伤组织的产生，因此认为，在培养基中添加 200 mg /L
的抗坏血酸能够较好地防止褐化，且不影响分化。
表 5 不同浓度抗坏血酸对外植体褐化的影响
抗坏血酸浓度
mg /L
处理时间∥d
4 6 8 10 20
对照 + + + + + + + + + + + + + +
50 + + + + + + + + + + + + +
100 + + + + + + + + + + +
200 N N N + +
300 N N N + +
注:N．没有褐化，+ ．轻度褐化，+ + ．中度褐化，+ + + ．严重褐化。
3 结论与讨论
3． 1 外植体的选择及灭菌 外植体是植物组织培养的材
84 安徽农业科学 2015 年
料，其表面和内部常携带一些微生物，是组织培养过程的主
要污染源，外植体的消毒是植物组织培养能否成功的第一
步，在培养时常因消毒效果不佳而导致失败。外植体表面消
毒的关键是选择合适的消毒剂和消毒时间。因为消毒剂不
仅能杀死微生物，也会对外植体产生一定的伤害。不同植物
或同一植物不同外植体消毒方法不同，为达到满意的灭菌效
果，需要根据外植体的情况，选择合适的消毒剂，摸索出合理
的消毒时间，焦立为等［3］用臭氧对橡皮树带有顶芽的叶片进
行消毒，结果表明，臭氧用于外植体消毒灭菌的效果很好，接
种 20 d后，污染率为 0%，且顶芽(有鳞叶包被)接种后的成
活率极高;Abdul Qayyum Ｒao等［4］采用0． 1%HgCl2 对棉花种
子表面消毒时，种子在消毒液中浸泡 20 min，远远超出一般
时间范围，但仍不会对种子造成伤害。在使用消毒剂时，有
时只用 1种消毒剂对外植体进行消毒，有时是将 2种或几种
消毒液混合后对外植体进行消毒，刘香玲等［5］使用混合消毒
剂对水稻种子进行灭菌，将水稻种子去壳后，先用 70%乙醇
消毒 1 min，再用 0． 1%HgCl2 和 2% NaClO(1∶ 1)的混合消毒
液浸泡 20 min。该研究对彩叶凤梨幼苗茎段采用 0． 1%
HgCl2 消毒 10 min，其存活率可达92． 6%。
3． 2 外植体褐化及防止 外植体褐化是凤梨科植物等许多
植物离体培养过程中的常见问题，发生褐化现象会直接导致
培养物死亡，严重阻碍了快繁过程。影响褐化的因素很多，
也很复杂，植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态、外
植体消毒情况、培养方式等的不同，褐化程度也有所不同。
首先，接种时各种化学消毒剂对外植体的伤害会引起褐化。
消毒剂不同，消毒时间不同，外植体褐化程度也不同。乙醇
消毒虽然效果较好，但易对材料造成伤害，导致褐化，HgCl2
对外植体伤害较轻，且消毒时间越长，效果越好，但褐变越严
重［6］。在消毒时间方面，一般是消毒时间越长，褐化率越
高［7］，因而消毒时间应掌握在一定范围内才能保证较高的外
植体成活率。该研究用 0． 1%HgCl2 溶液消毒 7 min，外植体
褐化程度较轻，而 75%乙醇处理外植体材料，明显加剧了褐
化程度。
其次，培养基状态及过高的无机盐浓度也会引起外植体
褐变，如把核桃分别在固体、半固体和液体培养基上培养，半
固体培养基芽的诱导获得成功，而其他培养基上都发生了褐
变［8］。在金钱树愈伤组织诱导过程中，采用液体培养对防止
褐化有很好的作用［9］。在桑树组培中，降低无机盐浓度，将
MS培养基改为 1 /2MS培养基能减轻褐变，降低褐化率［10］。
刘兰英［11］在核桃组培中发现，将 DKW培养基的无机盐浓度
减少一半，核桃外植体褐变率由55． 8%降至32． 5%。该研究
结果表明 MS 培养基比 1 /2MS、N6 及 B5 培养基褐化速度
更快。
另外，在培养基中加入防褐化剂可以明显减少褐变发
生。防褐化剂一般分为 2 种:一种是吸收醌类物质的吸附
剂，如活性炭，它是一种吸附性较强的吸附剂，但其吸附作用
没有选择性，在吸附酚类氧化物的同时也吸附营养物质，研
究表明，活性炭能有效控制褐化和促进生长，但不利于分
化［12］;另一种是防止酚氧化的抗氧化剂，如 Na2SO3 和 NaH-
SO3，主要是影响酚类化合物与酶结合来有效防止褐化，抗坏
血酸(Vc)也属于抗氧化剂，是一种酚氧化酶抑制物，它可以
将该酶的 Cu2 +还原成 Cu +［13］。虽然 Na2SO3 的防褐化作用
最佳，但不利于不定芽和愈伤组织的发生，影响外植体培养。
彭筱娜等［14］研究表明，在培养基中添加 200 mg /L抗坏血酸
可以有效防止观赏凤梨褐化的产生。该试验同样采用 200
mg / L的抗坏血酸作为一种有益的防褐化添加物，也可以有
效防止彩叶凤梨茎段外植体褐化，促进外植体的培养。
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