全 文 ：收稿日期:2005-10-26
基金项目:国家自然科学基金(30460018)
作者简介:徐　萍(1977-),女 ,河北吴桥人 ,博士 ,主要从事植物基因表达与调控的研究;王瑞刚、王水平为通讯作者。
拟南芥 VHA-c 基因在非生物胁迫响应中的作用
徐　萍1 ,刘瑞香2 ,曾卫军1 ,李国婧3 ,王瑞刚3 ,王水平1
(1.华东师范大学 生命科学学院 ,上海　200062;2.内蒙古农业大学 农学院 ,内蒙古 呼和浩特　010018;
3.内蒙古农业大学生物工程学院 ,内蒙古 呼和浩特　010018)
　　摘要:利用 RT-PCR技术检测 VHA-c 基因对高盐 、水和 ABA 胁迫的响应 , 结果表明所有的 VHA-c 基因都参与了
V-ATPase的抗盐胁迫反应;在响应水胁迫的反应中 VHA-c2 、 VHA-c4 和 VHA-c5 基因的表达量增加;在 ABA胁迫反应中
VHA-c1 , VHA-c2 , VHA-c3 和VHA-c4 基因的表达水平均提高 , 但是 VHA-c1 和VHA-c3 基因只在早期的ABA胁迫中增加其
表达量。
关键词:V-ATPase;c亚基;VHA-c 基因;非生物胁迫
中图分类号:S512.01　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2006)01-0019-04
Function of VHA-c Genes in Arabidopsis thaliana
in Response to Abiotic Stresses
XU Ping
1 , LIU Rui-xiang2 ,ZENG Wei-jun1 , LI Guo-jing3 ,
WANG Rui-gang3 ,WANG Shui-ping1
(1.School of Life Science , East China Normal University ,Shanghai　200062 ,China;
2.The Department of Agronomy , Inner Mongolia Agricultural University , Huhhot　010018 ,China;
3.School of Bioengineering , Inner Mongolia Agricultural University , Huhhot　010018 ,China)
Abstract:The expression of VHA-c genes was detected in Arabidopsis thaliana leaf under abiotic stresses condi-
tions.Results suggested that all VHA-c genes were involved in salt stress;mRNA levels of VHA-c2 , VHA-c4 and VHA-
c5 were enhanced under water stress;VHA-c1 , VHA-c2 , VHA-c3 gent and VHA-c4 were involved in ABA stress , though
mRNA levels of VHA-c1 and VHA-c3 were enhanced in response to early ABA stress.
Key words:V-ATPase;c subunit;VHA-c genes;Abiotic stresses
　　植物液泡 H+-ATPase(V-ATPase)是一类特殊的
膜结合转运蛋白 ,广泛分布于植物的液泡 、质膜以及
内质网 、高尔基体 、小泡等内膜系统[ 1] 。V-ATPase
利用水解ATP 产生的能量将质子泵入膜内 ,除了调
节细胞和细胞器的 pH 外 ,产生的跨膜能量可以用
于小泡在细胞中的转移;产生的质子电化学梯度可
以用于驱动离子和代谢物质的转运 ,从而影响膨压
和细胞的伸长和扩展[ 2] 。
V-ATPase 是一个由 13个亚基组成的多亚基复
合体酶 ,其分子量大约为 730 kDa 。组成V-ATPase的
13个亚基组成了两大亚复合体 ,即在膜的外周形成
球颈结构的V1 和位于膜内部的 V0 亚复合体 ,V1 主
要由 A ,B ,C ,D ,E ,F ,G ,H 8个亚基组成 ,V0 由 a , c ,
c″,d , e 5个亚基组成[ 3] 。许多植物的V-ATPase亚基
是由多基因家族编码的 ,如拟南芥V-ATPase 中组成
V0 亚复合体的B ,E ,G亚基和组成V1亚复合体的所
有亚基都是由 2个或 2个以上的基因编码的 ,而编
码 c亚基的基因多达 5个[ 4] 。多基因家族编码的亚
基在植物的生长发育过程中的作用目前还不清楚。
虽然很多证据已显示高盐 、干旱 、低温等环境胁迫下
V-ATPase调节自身的活性和改变亚基的表达以使
植物适应变化了的环境[ 5] ,但是不同的亚基基因在
华北农学报·2006 , 21(1):19-22
胁迫环境中的作用的研究还很少。
基于此 ,本文利用 RT-PCR的方法研究了拟南
芥中编码 VHA-c 亚基的 5个基因(VHA-c1 、VHA-c2 、
VHA-c3 、VHA-c4 、VHA-c5)在高盐 、水分胁迫以及
ABA处理中的表达变化 ,探讨了植物 V-ATPase 多基
因家族在植物生命中的作用及意义 。
1　材料和方法
1.1　植物材料
本试验所用拟南芥(Arabidopsis thaliana)为
Columbia野生型 ,在 20 ～ 22 ℃16 h/8 h光照下培养
生长 。
1.2　胁迫处理
将拟南芥种植于MS 平板上 ,生长 14 d 后移入
0.5×MS 液体培养基中生长 3 d , 再移入加有 250
mmol/L NaCl或 5%PEG 6000或 250 μmol/L ABA的
新鲜的 0.5×MS液体培养基中 ,对照也移入新鲜的
0.5×MS液体培养基中 ,分别在 2 ,6 ,12 ,24 h取处理
后的叶片 ,液氮中保存。
1.3　RT-PCR检测 VHA-c 基因在胁迫环境中的
表达
为检测 VHA-c 基因在胁迫环境中的表达情况 ,
提取拟南芥叶片总 RNA 。利用购自 Promega 公司的
反转录试剂盒(cat.3500)合成第一链 cDNA 。以 cD-
NA 为模板 PCR扩增 actin , rd29A和VHA-c 基因 。
用于扩增 actin , rd29A 和VHA-c 基因的引物分
别为:
actin :ACTIN-F:5′-TGGCATCA(T/C)ACTTTCTACAA-3′,
ACTIN-R:5′-CCACCACT(G/A/T)AGCACAATGTT-3′。
VHA-c1:VHA-c1-F :5′-TCCGACATGTCTACGTTCAG-3′,
VHA-c1-R:5′-TACCTTTGAGCAGTCTTGTG-3′。
VHA-c2:VHA-c2-F :5′-GACGAGCCATGGCTTCAAC-3′,
VHA-c2-R:5′-CCGATAAGAGAGAGAGATAC-3′。
VHA-c3:VHA-c3-F :5′-TGAGAGATGTCTACCTTCAG-3′,
VHA-c3-R:5′-GACTCCAAGAACCGCACTC-3′。
VHA-c4:VHA-c4-F :5′-AGAGCCAATGGCTTCTTCAG-3′,
VHA-c4-R:5′-ACTGAAAGGAGAAGCTACAC-3′。
VHA-c5:VHA-c5-F :5′-AGATCCGAGAAGATGTCTAC-3′,
VHA-c5-R:5′-GTTGATCGATAAGGAAGTAC-3′。
rd29A :RD29A-F:5′-CATCATGAGAATGGTGCGAC-3′,
RD29A-R:5′-TCAGGAGACTCATCAGTCAC-3′。
上述引物由上海生工生物公司合成 。
PCR反应程序为 94 ℃5 min , 94 ℃(30 s)、55
℃(30 s)、72 ℃(1 min), 25循环 , 72 ℃充分延伸 5
min 。扩增产物凝胶电泳 、成像。
2　结果与分析
2.1　 VHA-c 基因在盐胁迫下的表达
V-ATPase的一个重要作用就是为 Na+/H+反向
转运蛋白提供能量 ,将Na+运进液泡内[ 6] 。目前 ,很
多证据显示在盐胁迫中 V-ATPase 中亚基 c 的转录
量增加[ 7 ,8] ,但是每个 VHA-c 基因的转录量的变化
还不清楚 。为此我们利用 250 mmol/L 的 NaCl处理
处于营养生长期的拟南芥 ,在不同的处理时间检测
VHA-c 基因在叶片中表达的变化。为了证实胁迫处
理是否有效 ,同时PCR扩增了胁迫响应基因 rd29A ,
已知该基因可被 ABA 、干旱 、高盐 ,低温等胁迫诱
导[ 9] 。结果如图 1所示 ,经 250mmol/L的NaCl处理
后 ,检测到 rd29A 基因的表达量开始增加 ,这说明
本试验处理是有效的。
图 1　VHA-c 基因在盐胁迫下表达的 RT-PCR结果
Fig.1　Detection of VHA-cgenes mRNA expression in
Arabidopsis thaliana leaf under NaCl stress by RT-PCR
RT-PCR结果显示在盐胁迫 6 h后 5个 VHA-c
基因的表达量均开始增加 ,之后 VHA-c 基因一直处
于高表达的状态 。其中 VHA-c2 , VHA-c4 和 VHA-c5
基因的变化比 VHA-c1 , VHA-c3基因显著 。这些结果
说明在盐胁迫中所有的 VHA-c 基因都参与了抗盐
胁迫反应 ,而 VHA-c2 , VHA-c4 和 VHA-c5 基因可能
起主要作用。
2.2　VHA-c 基因在水分胁迫下的表达
目前 , V-ATPase 在干旱胁迫中的功能研究甚
20　 华　北　农　学　报 20卷
少。由于液泡的区室化对于细胞来说是非常重要
的 ,而其在细胞失水和离子浓度增加的情况下显得
更为重要。因此详尽的研究失水条件下 V-ATPase
的活性变化及其亚基基因表达水平是非常必要的 。
利用渗透剂 PEG 6000处理处于营养生长期的
拟南芥 ,分析在水分胁迫下 VHA-c 基因的表达情
况。结果如图 2所示 ,经PEG 6000处理后胁迫响应
基因 rd29A的表达量增加。
在PEG 6000处理的失水状态下 VHA-c 基因的
变化较小 , VHA-c1和 VHA-c3 基因的表达量未表现
出明显变化;VHA-c2和 VHA-c4基因在处理 6 h后表
达量开始增加 ,而后这两个基因一直处于高表达状
态 ;处理 12 h 后 ,检测到 VHA-c5基因表达量的增
加。这说明 VHA-c2和 VHA-c4基因在响应失水胁迫
中起主要作用。
图 2　VHA-c 基因在水胁迫下表达的 RT-PCR结果
Fig.2　Detection of VHA-c genes mRNA expression in
Arabidopsis thaliana leaf under water stress by RT-PCR
2.3　VHA-c 基因在外源 ABA条件下的表达
在植物处于低温 、高盐 、干旱等胁迫环境下 ,细
胞内源ABA水平发生改变 ,并调节胁迫响应基因的
表达 ,从而适应外界环境的变化 ,因此 ABA 常被认
为是逆境信号[ 10] 。本试验设置了 250 μmol/L 的
ABA对营养生长期的拟南芥进行处理 ,分析了 VHA-
c 基因在ABA处理下的表达情况 。
　　从图 3可见 , rd29A基因在 ABA处理后表达量
急剧增加 。 VHA-c1 和 VHA-c3 基因的表达水平在
ABA处理后 6 h也有所增加 ,并在处理 12 h后最为
明显 ,但在 24 h后却有所下降 ,二者相比 , VHA-c1基
因的变化更为显著 。除此而外 , VHA-c2基因表达量
在处理 6 h后有所增加;VHA-c4基因表达量在处理
2 h后即开始增加;而 VHA-c5基因表达水平并没有
明显变化 。
图 3　VHA-c 基因在 ABA 胁迫下表达的 RT-PCR结果
Fig.3　Detection of VHA-c genes mRNA expression in
Arabidopsis thaliana leaf under ABA by RT-PCR
3　讨论
植物的生长发育依赖于对 15种必需的营养元
素和代谢物质的吸收 、运输和定位 。此外为了生存 ,
植物还需要适应和忍受环境的改变[ 4] 。植物V-AT-
Pase为细胞的次级转运提供能量 ,维持溶质稳态 ,因
此在植物的生长中起着非常重要的作用。当植物处
于高盐 、干旱 、低温等逆境时 ,V-ATPase 通过调节自
身的活性使植物适应环境得以生存[ 1] 。植物V-AT-
Pase的许多亚基由多基因编码 ,这些基因在植物的
生长发育中的作用还没有详细的研究。本文利用
RT-PCR的方法初步研究了拟南芥 V-ATPase c 亚
基的 5个基因在非生物胁迫中的作用 ,对了解 V-
ATPase c亚基多基因家族功能及生物学意义具有重
要的理论意义 。
上述研究结果表明在盐胁迫中所有的 VHA-c
基因都参与了抗盐胁迫反应 ,而 VHA-c2 , VHA-c4 和
VHA-c5基因可能起主要作用。在水分胁迫中 , VHA-
c2和 VHA-c4 基因起主要作用 。 VHA-c1 , VHA-c2 ,
VHA-c3和 VHA-c4基因参与了 ABA 胁迫反应 ,但是
VHA-c1和 VHA-c3基因只在早期的ABA胁迫中起作
1期 徐　萍等:拟南芥VHA-c基因在非生物胁迫响应中的作用 21　
用。
目前的理论认为 ,不同的 V-ATPase亚基基因可
能在植物的不同组织和发育阶段表达 ,或在某些胁
迫环境中表达。Perera[ 11]的研究表明 VHA-c1 , VHA-
c2 , VHA-c3基因在拟南芥所有的营养器官和生殖器
官中都有表达 ,几乎检测不到 VHA-c4基因的表达 。
Ratajczak[ 12]报道 VHA-c3 基因在苗端和根端表达 。
基于过去的研究以及本研究结果 ,推测编码拟南芥
VHA-c亚基的 5个基因中 , VHA-c1基因在植物体中
是普遍表达的持家基因 ,维持植物正常的生命活动;
VHA-c2基因可能既作为持家基因在植物体中实时
表达 ,同时在胁迫环境中它又作为胁迫响应基因调
节自身的表达 ,使植物适应环境的变化;VHA-c3基
因主要在特异的组织如分生组织中表达 ,而 VHA-c4
和 VHA-c5基因主要在植物遇有不利于生长的环境
时才表达 ,在正常的生长条件下表达量很低 ,因此可
以认为 VHA-c4 和 VHA-c5基因是胁迫响应基因。
VHA-c 基因在植物中的作用以及它们如何相互
协调在植物体中发挥作用是值得深入研究的 ,也是
本项目的下一步工作 。
参考文献:
[ 1] 　Lǜttge U , Ratajczak R.The physiology , biochemistry and
molecular biology of the plant vacuolar ATPase[ J] .Adv Bot
Res , 1997 , 25:253-296.
[ 2] 　Dietz K J , Tavakoli N , Kluge C , et al.Significance of the V-
type ATPase for the adaptation to stressful growth conditions
and its regulation on the molecular and biochemical level
[ J] .J Exp Bot , 2001 , 52:1969-1980.
[ 3] 　Ratajczak R.Structure , function and regulation of the plant
vacuolar H+-translocating ATPase[ J] .Biochimica et Bio-
physica Acta , 2000 , 1465:17-36.
[ 4] 　Sze H , Schumacher K ,Muller M L , et al.A simple nomen-
clature for a complex proton pump:VHA genes encode the
vacuolar H+-ATPase[ J].TRENDS in Plant Science , 2002 ,
7(4):157-161.
[ 5] 　Dietz K J , Tavakoli N , Kluge C , et al.Significance of the V
-type ATPase for the adaptation to stressful growth condi-
tions and its regulation on the molecular and biochemical level
[ J].Journal of Experimental Botany , 2001 , 52:1969-1980.
[ 6] 　Apse M P, Aharon G S , Snedden W A , et al.Salt tolerance
conferred by overexpression of a vacuolar Na
+/H+antiport in
Arabidopsis[ J].Science , 1999 , 285:1256-1258.
[ 7] 　Dietz K J , Tavakoli N , Kluge C , et al.Significance of the V
-type ATPase for the adaptation to stressful growth condi-
tions and its regulation on the molecular and biochemical level
[ J].J Exp Bot 2001 , 52:1969-1980.
[ 8] 　Sze H , Li X , Palmgren M.Energization of the plant cell mem-
branes by H+-pumping ATPases:biosynthesis and regulation
[ J] .Plant Cell , 1999 , 11:677-689.
[ 9] 　Narusaka Y , Nakashima K , Shinwari Z K.et al.Interaction
between two cis-acting elements , ABRE and DRE , in ABA-
dependent expression of Arabidopsis rd29A gene in response
to dehydration and high-salinity stresses[ J].The Plant Jour-
nal , 2003 , 34:137-148.
[ 10] 　Bonetta D,McCourt P.Genetic analysis of ABA signal trans-
duction pathways[ J].Trends Plant Sci , 1998 , 3:231-235.
[ 11] 　Perera I Y , Li X , Sze H.Several distinct genes encode near-
ly identical 16 kDa proteolipids of the vacuolar H+-ATPase
from Arabidopisis thaliana[ J] .Plant Mol Bio , 1995 , 29:227
-244.
[ 12] 　Ratajczak R.Structure , function and regulation of the plant
vacuolar H+-translocating ATPase[ J] .Biochimica et Bio-
physica Acta , 2000 , 1465:17-36.
22　 华　北　农　学　报 20卷