全 文 ：欧洲山杨液泡膜Na+/H+反向运输体的性质鉴定 *
刘晶晶 2) 张旭家 1)**卢存福 2)**
(1)中国科学院生物物理研究所，生物大分子国家重点实验室，北京100101；
2)北京林业大学生物科学与技术学院，北京100083)
摘要 植物液泡膜Na+/H+反向运输体可将细胞质中的Na+转运到液泡内储存，以减少胞内Na+的毒性.但木本植物如杨树是
否有同样的机制目前还不清楚.以欧洲山杨的愈伤组织为材料，捣碎破碎愈伤组织细胞，经过差速离心和不连续蔗糖梯度离
心得到纯化的欧洲山杨液泡微囊.通过液泡V-ATPase建立质子梯度，该液泡能够利用此梯度调控Na+的转运，表明液泡膜
上存在Na+/H+反向运输体活性(表观米氏常数Km是11.4mmol/L). Na+ H+反向运输体的抑制剂——氨氯吡嗪咪能明显抑制转
运体的活性.该Na+/H+反向运输体也可以转运K+，但亲和能力比Na+低30%.该结果首次证明木本植物的液泡膜上存在
Na+/H+反向运输体.初步功能研究表明，愈伤组织在盐胁迫条件下，Na+/H+反向运输体活性明显下降，提示该机制可能与山
杨不耐盐有关.
关键词 欧洲山杨，Na+/H+反向运输体，V-ATPase
学科分类号 Q945.78，Q946.5
*国家自然科学基金重点项目(30430430).
**通讯联系人.
张旭家.Tel:010-64888517,E-mail:xjzhang@sun5.ibp.ac.cn
卢存福.Tel:010-62338346,E-mail:lucunfu@bjfu.edu.cn
收稿日期：2007-03-14，接受日期：2007-04-29
生物化学与生物物理进展
Progress in Biochemistryand Biophysics
2007,34(12):1303~1307
www.pibb.ac.cn
研究报告Research Papers
为了能够在盐生环境下生存，植物必需保持细
胞质内较低的Na+浓度，降低Na+的毒害.植物一方
面要降低Na+的吸收，同时还要将吸收的Na+外排或
使Na+区隔化到液泡内[1].通常情况下，植物细胞通
过在细胞质膜和/或液泡膜Na+/H+反向运输体
(antiporter)将细胞质中的Na+运送到细胞外或在液泡
中储存.液泡膜Na+/H+反向运输体(Nha)利用液泡
V-ATPase和/或H+-PPase产生的电化学势梯度使
细胞质中的Na+与液泡内的H+交换，导致Na+在液泡
内聚集，进而调节细胞内的pH值、细胞体积以及
胞内Na+的浓度，对植物耐盐性起重要作用[2].有研
究表明，将液泡膜Na+/H+反向转运蛋白基因
AtNHX1转化拟南芥[3]、油菜[4]、番茄[5]，该基因超
表达，可以使这些植物的耐盐性明显提高.
无论盐生植物还是甜土植物，在高盐环境下总
是尽力保持胞质内较低的Na+浓度，这就需要有质
膜和液泡膜上的Na+/H+反向运输体(Nha)来调节，所
以该蛋白质的功能、与植物耐盐性的关系及分子生
物学的研究成为近年来研究的热点问题之一.植物
中Na+/H+反向运输体(Nha)首先是在大麦质膜发现
的[6]，在众多盐生植物如盐角草[7]、大洋洲滨藜[8]、
车前属[9]、冰日午时花[10]也发现了类似的Nha，但
是木本植物中是否有Nha报道很少.最近，从耐盐
木 本 植 物——胡 杨 中 克 隆 出 它 的 Nha基 因
(PeNhaD1)[11]，但其细胞定位及生理功能都不清
楚.本工作以欧洲山杨(P. tremula)的愈伤组织为材
料，首次发现木本植物愈伤组织液泡膜上存在Nha
(PtNha)，该运输体的活性随培养基盐浓度升高而
降低，提示该机制可能与山杨不耐盐有关.
1 材料与方法
1.1材料
欧洲山杨愈伤组织为生物大分子国家重点实验
室保存，愈伤组织在固体培养基上继代培养.固体
培养基为MS培养基，附加1 mg/L二氯苯氧乙酸
(2,4-D)，0.1 g/L肌醇、30 g/L蔗糖和4.8 g/L琼脂，
pH5.8.每8天继代一次. NaCl处理愈伤组织是将
愈伤组织接种于含NaCl的固体培养基中培养7天.
1.2方法
1.2.1欧洲山杨愈伤组织液泡微囊的制备.参照刘
生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. 2007;34(12)
群录等[12]提取胡杨悬浮细胞液泡微囊的方法，将愈
伤组织置于预冷的组织捣碎机(Blender)中，按1∶2
(组织鲜重/g∶缓冲介质体积/ml)加入缓冲介质
(30mmol/LMES-TrispH8.0，250mmol/L蔗糖，
5mmol/LEDTA，10%甘油，500μl/Lβ-巯基乙醇，
200mmol/LDTT，0.1mmol/LPMSF，0.1%BSA，
1gPVP/100g组织细胞)，破碎细胞后用4层预冷纱
布过滤以除去细胞碎片.滤液经10000g(JA25.5)离
心25min，以弃去管底线粒体、细胞核和大的细胞
碎片.上清液经80000×g(Beckman45Ti)离心
45min，弃去上清，沉淀中加入重悬液(10mmol/L
MES-Tris，pH7.5，250mmol/L蔗糖，5%甘油，
1mmol/LEDTA， 1mmol/LDTT， 0.1mmol/L
PMSF)，然后将其铺在25%～50%不连续蔗糖密度
梯度上，经100000g(BeckmanSW40Ti)离心2h，
收集0%～25%界面上的膜微囊，用不含EDTA的重
悬液稀释5～8倍，160000g(Beckman70Ti)离心
45min.整个过程在40℃操作.沉淀(所纯化的液
泡膜微囊)重新悬浮于不含EDTA的重悬液，迅速放
入液氮中，-80℃冰箱中保存备用.
1.2.2 蛋白质含量测定.用Bradford试剂盒测定样
品的蛋白质含量.牛血清白蛋白为标准样品.
1.2.3 Nha活性的测定.Nha活性通过检测液泡内
H+浓度的变化(吖啶橙荧光猝灭)来测定[10,13].反
应 体 系 (500μl)含 有 10mmol/LMes-Tris，
pH7.5，250mmol/L山梨醇，5μmol/L吖啶橙
(Acridineorange)，50mmol/L氯化胆碱，3mmol/L
MgSO4，膜蛋白40μg.加入3mmol/LTris-ATP启
动反应.当荧光下降平稳后，反应体系中加入
Na2SO4启动Na+的转运.测定加入Na+15s后的初始
转运速率(Δ%Q·min-1)，Nha活性大小以Δ%表示.
抑制剂是在荧光下降平稳后启动Na+/H+之前加
入[13].荧光分光光度计(Hitachi4500)连续测定吖啶
橙的荧光猝灭.激发和发射波长分别为495nm和
525nm，狭缝宽度2.5nm，测定温度是25℃.
2 结果与讨论
2.1 欧洲山杨液泡微囊跨膜质子梯度的建立
因为液泡膜Nha需要利用液泡膜两侧的质子梯
度才能启动细胞质中的Na+与液泡内的H+交换，从
而使Na+在液泡内区隔化，因此我们通过液泡
V-ATPase转运质子，建立液泡膜两侧电化学势质
子梯度.如图1所示，系统中加入ATP后，荧光明
显淬灭，表明囊泡中H+浓度升高.为证明囊泡中H+
浓度的变化是由液泡V-ATPase转运质子所致，系
统中加入V-ATPase的专一性抑制剂(NO3-)，可以看
到没有明显的荧光淬灭(图1)，进一步证明我们所
观察到的荧光淬灭即为液泡V-ATPase转运质子的
结果.另外，GramicidinD能够消散生物膜两侧的
质子梯度，可以看到，荧光下降到最低并平稳后，
系统中加入GramicidinD，荧光迅速回到起始状态，
表明液泡内的H+通过GramicidinD扩散到液泡外，
液泡内外H+浓度一致，该结果证明ATP引起的荧光
淬灭是由V-ATPase转运质子引起，而非液泡泄漏，
说明我们纯化的液泡有很好的封闭性.
2.2 欧洲山杨液泡微囊上Nha活性的测定
在上面实验的基础上，研究Na+对液泡膜两侧
质子梯度的影响.用ATP启动液泡V-ATPase，导致
荧光淬灭，在荧光淬灭到最大且稳定后，系统中加
入不同浓度的Na+，可以看到荧光得到恢复，并且
恢复程度与Na+浓度成正比(图2).该结果表明液泡
内H+的外排与液泡外Na+相关，说明我们纯化的液
泡有Nha活性.另外，酶动力学分析表明，荧光恢
复的初始速率(Na+加入后15s)与Na+浓度呈饱和动
力学曲线，符合米氏方程.
利用Hanes-Woolf方程做图可以得到欧洲山杨
液泡膜上Nha的表观米氏常数Km是11.4mmol/L，
Vmax为200% Q/(min·mg-1)(图2)，该值与甜菜
Reactionswereperformedasdescribedin“Materialsandmethods”.
Thereactionmedium (500μl)contained10mmol/L Mes-Tris,
pH7.5,250mmol/Lsorbitol,5μmol/LAcridineorange,50mmol/L
cholinechloride,3mmol/LMgSO4,membraneprotein,inthepresence
(—)orabsence(-·-)of0.4mmvanadateor50mmnitrate(⋯).The
reactionwasstartedbyadditionofthe3mmol/LTris-ATP. — :
Na3VO4;-·-:CK;⋯:+KNO3.
Fig.1 V-ATPasedependentpHgradientformationin
vacuolarmembranevesiclesisolatedfromP.tremula
900
800
700
600
500
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300
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100
0
100 200 300 400 500 600
t/s
Fl
uo
re
sc
en
ce
ATP
GramicidinD
1304· ·
刘晶晶等:欧洲山杨液泡膜Na+/H+反向运输体的性质鉴定2007;34(12)
△pHwasformedinvesiclesasdescribedinFigure1.Whenthe△pH
reachedsteady,itwasdissipatedbytheadditionof50mmol/LNa2SO4
afteradditionof0.5mmol/L amiloride/50μmol/LMIA.-- :
+Amiloride;—:+MIA;⋯:CK.
Fig.3 EfectofPtNhainhibitorsondissipationofthe
ATPase-dependentpH gradientinvacuolarmembrane
vesiclesisolatedfromP.tremula
(Km=16.2mmol/L)[14]和水稻(Km=10.0mmol/L)[15]液泡
膜Nha相一致.
2.3 氨氯吡嗪咪抑制PtNha活性
为进一步证明欧洲山杨液泡膜存在Nha，研究
了有Nha抑制剂存在下，Na+对液泡膜两侧质子梯
度的影响.已有报道，由于Nha存在氨氯吡嗪咪的
结合位点，因此，氨氯吡嗪咪(Amiloride)及其类似
物作为Nha的竞争性抑制剂广泛用于该运输体的性
质研究[15].研究结果表明，氨氯吡嗪咪抑制冰日午
时花[10]、甜菜[14]等液泡膜Nha活性，而盐角草液泡
膜Nha活性则受到氨氯吡嗪咪类似物——异丁基氨
氯吡嗪咪(MIA)的抑制 [7].图3为在Nha的抑制
剂——氨氯吡嗪咪和异丁基氨氯吡嗪咪存在下，
Na+对欧洲山杨液泡膜两侧质子梯度的影响.
结果发现，0.5mmol氨氯吡嗪咪抑制约50%Nha
的活性(在氨氯吡嗪咪存在下，Na+导致的质子荧光
恢复受到明显抑制)，表明欧洲山杨液泡膜存在
Nha.但是异丁基氨氯吡嗪咪对PtNha影响很小，
说明PtNha更有利与Amiloride结合，这与冰日午时
花、大麦等液泡膜Nha相似.
2.4 PtNha的离子选择性
甜菜液泡Nha以相同的速率转运Na+和K+[16]，表
明其Nha对Na+和K+没有选择性.但最近的研究结
果显示，盐角草液泡膜Nha只能特异性运输Na+[7]，
不能运输K+，说明Nha对Na+和K+的选择性有物种特
异性.为此，我们研究了PtNha对Na+和K+的选择特
性(图4).结果表明，PtNha可以转运Na+和K+，初始
转 运 速 率 分 别 为 160% Q/(min·mg-1)和 117%
Q/(min·mg-1).可以看出欧洲山杨PtNha对Na+表现
出相对较高的亲和力，转运的初速率比转运K+快约
30%.
2.5 盐胁迫对PtNha活性的影响
Nha表达有组成型和诱导型，如冰日午时花和
甜菜中的Nha是组成型表达[10,16]，但在车前属、大
麦根部只有在盐诱导后才能检测到Nha的活性，属
△pH wasformedinvesiclesasdescribedinFigure1.Whenthe
△pHreachedsteady,itwasdissipatedbytheadditionofarangeof
Na2SO4concentrationsfrom8~100mmol/L.Traceswerealignedatthe
pointofadditionofNa2SO4.Theinitialratesofdissipationwere
determinedasdescribedin“Materialsandmethods”.Inset:The
Hanes-Woolfplotof[S]/Vvs[S].— :+50mmol/LNa2SO4;·-·:
+8mmol/LNa2SO4;--:+12.5mmol/LNa2SO4; ⋯ :+25mmol/L
Na2SO4.
Fig.2 DissipationoftheATPase-dependentpHgradient
asafunctionofNa2SO4concentrationinvacuolar
membranevesiclesisolatedfromP.tremula
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ATP
Na2SO4
◆
◆
◆
◆
◆
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
-0.2
s/
v
-50 501001502000
S/(mmol·L-1)
ExperimentalconditionswereasinFigure2exceptK2SO4(50mmol/L)
orNa2SO4(50mmol/L)wasused.—:+Na2SO4;--:+K2SO4.
Fig.4 DiferentafinityofPtNahforNa+andK+
800
600
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0
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Fl
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ce
ATP
Na2SO4/K2SO4
200 400 600 800 1000
t/s
1200
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生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. 2007;34(12)
于诱导型[16,17].由于PtNha在正常生长情况下就有
活性，因此其应为组成型表达.
为了研究PtNha在欧洲山杨受到盐胁迫中的作
用，将欧洲山杨的愈伤组织接种在含50mmol/L、
100mmol/L和150mmol/LNaCl培养基中，纯化液泡
膜后，研究PtNha活性与培养基盐浓度的关系(表
1).愈伤组织接种至含NaCl的培养基7天后，褐化现
象随着盐浓度的增加而逐渐严重，100mmol/L、
150mmol/LNaCl条件下愈伤组织细胞几乎已经停
止增殖.NaCl处理后，PtNha的Km随着NaCl浓度的
增加而增大，Vmax随着NaCl浓度的增加而减小，说
明NaCl处理可以降低PtNha对Na+的亲和力，其原因
可能是由于在盐处理下，PtNha表达量下降或活性
受到抑制，也可能是两者兼有，这方面的工作需要
进一步研究，相关工作正在进行中.另外，考虑到
欧洲山杨本身耐盐性比较弱，盐处理后PtNha活性
下降，而盐生植物冰日午时花经盐处理后，液泡膜
上Na+/H+反向运输体Vmax是对照的2.1倍[10]，盐角草
高盐处理后(Km=3.8mmol/L)液泡膜上Na+/H+反向运
输体对Na+的亲和力是低盐处理(Km=11.5mmol/L)的
3倍多[7],这可能预示着Na+/H+反向运输体在植物耐
盐过程中发挥重要作用.
综合上述实验结果，欧洲山杨液泡膜上存在
Nha，它可以使液泡膜外的Na+和K+与H+逆向交换，
但对Na+的亲和力更高.Amiloride可以抑制PtNha的
转运活性，MIA的抑制作用不明显.由于欧洲山杨
的耐盐性不高，所以，盐处理会降低PtNha的转运
活性，也说明了PtNha在植物抗盐性方面有一定的
作用.
参 考 文 献
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Na2SO4-induceddissipationof△pHinvacuolarmembranevesicles
isolatedfrom P.tremulagrownin50， 100， 150mmol/LNaCl.
ReactionswereperformedasdescribedinFigure2.Theinitialrateswere
measured,andweretransformedusingaHanes-Woolfplottodetermine
kineticparameters.
Table1 Km andVmax oftheNa+/H+ antiporterofthe
P.tremula
Control
50mmol/L
NaCl
100mmol/L
NaCl
150mmol/L
NaCl
Km/mmol/L 11.4 23.0 27.0 30.5
Vmax/%Q/(min·mg-1) 200 185 177 169
1306· ·
刘晶晶等:欧洲山杨液泡膜Na+/H+反向运输体的性质鉴定2007;34(12)
CharacterizationofTheNa+/H+AntiporterinTonoplastVesiclesFrom
Populustremula.cali*
LIUJing-Jing2),ZHANGXu-Jia1)**,LUCun-Fu2)**
(1)NationalLaboratoryofBiomacromolecule,InstituteofBiophysics,TheChineseAcademyofSciences,Beijing100101,China;
2)ColegeofBiologicalSciencesandBiotechnology,BeijingForestUniversity,Beijing100083,China)
Abstract TheNa+/H+antiporterinvacuolarmembranestransportsNa+fromthecytoplasmtovacuolesusingapH
gradientgeneratedbyprotonpumps,whichcouldreduceNa+ toxicity.Itisuncertainthatwhetherthewoody
plantshavethesamemechanism.Throughdiferentialcentrifugationandsucrosedensitygradientcentrifugation,
tonoplastvesicleswereisolatedfromPopulustremulacalibrokenbyblender.AfterestablishingpHgradientby
V-ATPase,Na+coulddissipatethepHgradient,whichindicatesthatthereisNa+/H+antiporterinthetonoplast
vesiclesfromPopulustremulacali(Km=11.4mmol/L).AmiloridecouldinhibittheNa+/H+antiporteractivity.The
antiportercouldtransportNa+andK+,theafinityforNa+ishigher.SaltstressdecreasedKmandVmax.
Keywords Populustremulacali,Na+/H+antiporter,V-ATPase
*ThisworkwassupportedbygrantsfromTheNationalNaturalSciencesFoundationofChina(30130190).
**Corespondingauthor.
ZHANGXu-Jia.Tel:86-10-64888517,E-mail:xjzhang@sun5.ibp.ac.cn
LUCun-Fu.Tel:86-10-62338346,E-mail:lucunfu@bjfu.edu.cn
Received:March14,2007 Accepted:April29,2007
1307· ·