全 文 ： 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (3): 411−418 · 411 ·



珍稀濒危药用铁皮石斛 HMGR 基因的克隆和特征分析
张 琳 1, 王继涛 1, 张大为 2, 张 岗 1, 2*, 郭顺星 2*
(1. 陕西中医学院药学院, 陕西省中药基础与新药研究重点实验室, 陕西 西安 712046;
2. 中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所, 北京 100193)
摘要: 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶 (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase, HMGR)
是甲羟戊酸途径中的第一个限速酶, 在植物细胞萜类物质合成代谢过程中发挥重要作用。但是, HMGR基因在珍
稀濒危兰科药用植物铁皮石斛类萜生物合成途径中的作用尚不清楚。本研究利用 RT-PCR 和 RACE 技术, 首次
从铁皮石斛中克隆到一个 HMGR基因, 命名为 DoHMGR1 (GenBank注册号 JX272632)。DoHMGR1基因 cDNA
全长 2 071 bp, 编码一条由 562个氨基酸组成的多肽, 分子量 59.73 kD, 等电点 6.18。DoHMGR1蛋白包含 HMGR
蛋白家族的 4 个保守结构域 (63～561、147～551、268～383、124～541) 和两个跨膜基序 (42～64、85～107)。
DoHMGR1 基因与多种植物 HMGR 基因相似性很高 (67%～89%), 与万代兰、水稻、玉米等单子叶植物亲缘关
系较近。DoHMGR1 基因具有组织表达特异性, 其转录本在石斛根和茎中表达量较高, 为叶中的 2.13 和 1.98 倍。
DoHMGR1基因的分子鉴定为进一步解析该基因在铁皮石斛萜类物质合成代谢途径中的分子调控作用奠定基础。
关键词: 铁皮石斛; 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A还原酶; 基因表达; 实时定量 PCR
中图分类号: R931 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2014) 03-0411-08
Molecular characterization of a HMG-CoA reductase gene from
a rare and endangered medicinal plant, Dendrobium officinale
ZHANG Lin1, WANG Ji-tao1, ZHANG Da-wei2, ZHANG Gang1, 2*, GUO Shun-xing2*
(1. Shaanxi Provincial Key Laboratory for Chinese Medicine Basis & New Drugs Research, College of Pharmacy,
Shaanxi University of Chinese Medicine, Xi’an 712046, China; 2. Institute of Medicinal Plant Development,
Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China)

Abstract: The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGR) catalyzes the conversion of HMG-CoA
to mevalonate in mavalonic acid pathway, which is the first committed step for isoprenoid biosynthesis in plants.
However, it still remains unclear whether HGMR gene plays a role in the isoprenoid biosynthesis in Dendrobium
officinale, an endangered epiphytic orchid species. In the present study, a HMGR encoding gene, designed
as DoHMGR1 (GenBank accession JX272632), was identified from D. officinale using the reverse transcription
polymerase chain reaction (RT-PCR) and rapid amplification of cDNA ends (RACE) methods, for the first time.
The full length cDNA of DoHMGR1 was 2 071 bp in length and encoded a 562-aa protein with a molecular
weight of 59.73 kD and an isoelectric point (pI) of 6.18. The deduced DoHMGR1 protein, like other HMGR
proteins, constituted four conserved domains (63−561, 147−551, 268−383 and 124−541) and two transmembrane
motifs (42−64 and 85−107). Multiple sequence alignment and phylogenetic analyses demonstrated that
DoHMGR1 had high identity (67%−89%) to a number of HMGR genes from various plants and was closely

收稿日期: 2013-10-28; 修回日期: 2013-12-04.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (31070300, 31101608); 教育部科学技术研究重点项目 (211177); 陕西省科技计划青年科技新星项目
(2012KJXX-44).
*通讯作者 Tel / Fax: 86-29-38185165, E-mail: zhanggang2006@gmail.com;
Tel / Fax: 86-10-62829619, E-mail: sxguo1986@163.com
DOI:10.16438/j.0513-4870.2014.03.020
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related to Vanda hybrid cultivar, rice and maize monocots. Real time quantitative PCR (qPCR) analysis
revealed that DoHMGR1 was expressed in the three included organs. The transcripts were the most abundant
in the roots with 2.13 fold over that in the leaves, followed by that in the stems with 1.98 fold. Molecular
characterization of DoHMGR1 will be useful for further functional elucidation of the gene involving in
isoprenoid biosynthesis pathway in D. officinale.
Key words: Dendrobium officinale; 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase; gene expression; real time
quantitative PCR

植物细胞类萜生物合成途径由甲羟戊酸
(mevalonate, MVA) 和 5-磷酸脱氧木酮糖/2C-甲基 4-
磷酸-4D-赤藓醇 (1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate/2C-
methyl-D-erythritol 4-phosphate, DXP/MEP) 途径组
成, 其中, MVA为细胞合成萜类、甾醇、激素等物质提
供前体化合物, 在植物次生代谢过程中发挥着十分
重要的作用[1]。3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A还原
酶 (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase,
HMGR) 催化 HMG-CoA 不可逆的产生 MVA, 成为
MVA途径首个重要的限速关键酶[2]。目前, 已经从普
通植物拟南芥[2]、甜瓜[3]、辣椒[4]、榛树[5]、橡胶[6]
和南京椴[7], 以及长春花[8]、红豆杉[9]、杜仲[10]、银
杏[11]、大戟[12]、丹参[13, 14]、甘草[15]和人参[16]等药用植
物中分离到 HMGR基因。大量证据表明, HMGR基因
表达与调控对细胞类萜生物合成起关键作用。在大肠
肝菌中表达大戟 (Euphorbia pekinensis) EpHMGR可
以提高类胡萝卜素的积累[12]。丹参 (Salvia miltiorrhiza)
SmHMGR 在根中高强度表达, 且受植物激素水杨酸
(salicylic acid, SA) 和茉莉酸甲酯 (methyl jasmonate,
MeJA) 诱导表达[13]。过量表达 SmHMGR2基因的丹参
毛状根能够积累较高浓度的丹参酮和萜类物质[14]。
此外, 异源功能互补实验证明, 杜仲[10]、银杏[11]、丹
参 [14]等植物 HMGR 基因可互补 HMGR 缺陷型
(hmgr−) 的酵母菌株。可见, HMGR对植物细胞类萜
物质合成及生长发育至关重要。
铁皮石斛 (Dendrobium officinale Kimura et Migo)
为兰科 (Orchidaceae) 石斛属 (Dendrobium) 最为珍
稀名贵的种, 药用部位为新鲜或干燥茎, 具有益胃生
津、滋阴清热、润肺止咳、明目强身等功效[17]。石斛
属植物普遍含有倍半萜类、菲酚类、双苄酚类、芴酮
类、多糖以及生物碱等主要活性成分。石斛碱是药用
石斛最重要的有效成分之一, 具有止痛解热、抗肿瘤
的功效, 对心血管、胃肠道等疾病有抑制作用[18]。石
斛碱具有基本的倍半萜骨架结构[19], 类萜合成关键
酶 HMGR 可能在石斛碱及萜类物质合成过程中起作
用。本研究以珍稀濒危药用植物铁皮石斛为对象, 采
用 RT-PCR和 RACE技术克隆 DoHMGR1基因, 进行
生物信息学、系统进化及组织表达模式等特征分析,
旨在为深入研究该基因在石斛碱以及萜类物质合成
途径中的分子调控作用提供基础。

材料与方法
材料 野生铁皮石斛植物材料于 2013年 7月采
自云南西双版纳, 取其根、茎、叶组织样品, 液氮速
冻后置 −80 ℃保存备用。
核糖核酸 (RNA) 提取和互补脱氧核糖核酸
(cDNA) 合成 按照 EASYspin Plus 植物 RNA 快速
提取试剂盒 (爱德莱, 中国) 操作说明提取各样品总
RNA, RQ1 RNase-free DNaseI (Promega, USA) 消解
去除基因组DNA; 采用NanoDropTM 2000分光光度计
(Thermo Fisher, USA) 测定 RNA 质量和纯度, 1.2%
琼脂糖凝胶电泳鉴定 RNA 完整性。使用 M-MLV
Reverse Transcriptase kit (Promega, USA) 反转录合
成 cDNA第一链, −20 ℃保存备用。
核心序列的分离 根据 GenBank 中已注册的植
物 HMGR 基因序列保守区, 设计并合成 1 对兼并引
物: HMGR-degF: 5-GGBGATGCHATGGGRATGAAY
AT-3, HMGR-degR: 5-GTVCCMACCTCAATNGAD
GGCAT-3, 以铁皮石斛各样品 cDNA第一链混合物为
模板, 用 Ex TaqTM DNA聚合酶 (TaKaRa, China) 进
行 RT-PCR 扩增 HMGR 基因的核心序列。反应体系
为: 2.5 µL 10×Ex TaqTM buffer、0.5 µL 10 mmol·L−1
dNTPs、10 µmol·L−1 HMGR-degF/R各 0.5 µL、1.0 µL
cDNA、0.3 µL 5 U·µL−1 Ex TaqTM Polymerase, 补
ddH2O至 25 µL。PCR程序为: 95 ℃ 3 min; 95 ℃ 30 s,
53˚C 50 s, 72 ℃ 1 min, 32个循环; 72 ℃延伸 7 min;
4 ˚C保温。产物经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳, TianGen胶
回收试剂盒 (TianGen, China) 纯化大小约为500 bp的
目的条带, 连接至 pMD®18-T vector (TaKaRa, China),
转化大肠杆菌感受态细胞 JM109, 随机挑选 5个克隆,
利用 ABI 3130xl 遗传分析仪 (Applied Biosystems,
USA) 双向测序分析。
张 琳等: 珍稀濒危药用铁皮石斛 HMGR基因的克隆和特征分析 · 413 ·

cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of
cDNA ends, RACE) 克隆 以所获得的核心序列为模
板, 设计 2对特异引物, 按照 SMARTTM RACE cDNA
Amplification Kit (Clotech, Japan) 说明书分别进行 2
次巢式 RACE-PCR。5-RACE引物为: HMGR-R1 5-C
CCCTTCCCAATATCCAATTAACAGCAG-3, HMGR-
R2-nest 5-CCGAACAAAAGTTACCAGAGAGGCTG
A-3; 3-RACE引物为: HMGR-F1 5-CTGCTGTTAAT
TGGATATTGGGAAGGGG-3, HMGR-F2-nest: 5-AA
TGCTCATGCCAGCAACATAGTATCAG-3。
分别以 HMGR-R1/F1 与试剂盒提供的 UPM 引
物组合, 进行第 1轮 5/3-RACE。反应体系为: 2.5 µL
10×Advantage® 2 PCR buffer、0.5 µL 10 mmol·L−1
dNTPs、0.5 µL 10 µmol·L−1 HMGR-R1/F1、0.5 µL
10 µmol·L−1 UPM、1.0 µL 5/3-RACE ready cDNA、
0.5 µL 5 U·µL−1 50×Advatange® 2 Polymerase Mix, 补
ddH2O至 25 µL。PCR程序为: 94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30
s, 70 ℃ 30 s, 72 ℃ 2 min, 5个循环; 94 ℃ 30 s, 68 ℃
30 s, 72 ℃ 2 min, 24个循环; 72 ℃ 10 min, 4 ℃保温。
反应结束后, 取 1.0 µL 产物作为模板, 以 HMGR-
R2/F2 与 UPM 组合, 进行第 2 轮 5/3-RACE。PCR
程序为: 94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s, 68 ℃ 30 s, 72 ℃
2 min, 32个循环; 72 ℃ 10 min, 4 ℃保温。PCR产物
经 1.8% 琼脂糖凝胶电泳分析, 回收目标条带、克隆,
随机选取 3个重组质粒, 利用ABI 3130xl遗传分析仪
(Applied Biosystems, USA) 双向测序分析。
基因全长获取和验证 利用 CAP3 将 5、3端
cDNA序列与核心序列拼接后, 进行 BLASTX和ORF
Finder分析, 设计跨开放阅读框 (open reading frame,
ORF) 引物HMGR-orfF 5-TTTTCACTTTTATCCCCA
CACT-3, HMGR-orfR 5-GATGATACAAATAAAAGC
CCTAAA-3, 进行全长基因的 RT-PCR克隆验证。反
应体系为: 2.0 µL 10×Ex TaqTM buffer、0.4 µL 10
mmol·L−1 dNTPs、10 µmol·L−1 HMGR-orfF/R各 0.4 µL、
1.0 µL cDNA、0.2 µL 5 U·µL−1 Ex TaqTM Polymerase,
补 ddH2O至 20 µL。PCR程序: 94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s,
58 ℃ 30 s, 72 ℃ 2 min, 32个循环; 72 ℃ 延伸 10 min;
4 ℃保温。PCR反应产物经 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检
测, 回收目的条带、克隆, 利用 ABI 3130xl遗传分析
仪 (Applied Biosystems, USA) 双向测序分析。
序列分析 使用 BLAST (http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/blast.cgi)、CAP3 (http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.
php)、ORF Finder (http://www.ncbi.nlh.nih.gov/gorf/
gorf.html) 等在线工具分析 DoHMGR1 cDNA序列。
采用 ExPASy Proteomics Server 在线软件 Protparam
(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html) 进 行
DoHMGR1基因编码蛋白的理化性质分析。使用SOPMA
(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl) 预
测蛋白质二级结构。采用 SWISS-MODEL (http://
swissmodel.expasy.org/) 进行蛋白质三维建模分析。利
用 InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/iprscan/)
和 PROSITE SCAN (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/
npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_proscan.html) 预
测 DoHMGR1 保守结构域和基序。用 SignalP 4.0
(http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/) 进行分泌蛋
白预测。借助 PSORT (http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/
form.html) 进行蛋白亚细胞定位预测。利用 TMHMM
2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 预测蛋
白跨膜区。用 DNASTAR 6.0和 MEGA 4.0软件分别
进行氨基酸序列比对和进化树分析。
实时定量 PCR (real time quantitative PCR,
qPCR) 分析 分别以 2 μg根、茎、叶样品总 RNA反
转录合成 cDNA第一链, 稀释 20倍备用。以铁皮石斛
EF1α为内参基因[20], 采用qPCR技术检测DoHMGR1
基因的组织表达模式。qPCR引物为 DoHMGR1-qPCR-
F: 5-AATGCTCATGCCAGCAACATAG-3, DoHMGR1-
qPCR-R: 5-TCCCATCATTCACTGCTTCCA-3。应
用 ABI PRISM 7500实时荧光定量 PCR仪 (Applied
Biosystems, USA) 进行 PCR扩增反应。反应体系为:
12.5 μL 2×SYBR® Premix Ex TaqTM Master Mix、
DoHMGR1-qPCR-F/R各 0.5 μL (10 μmol·L−1)、0.5 μL
Dye、2 μL cDNA模板、9 μL ddH2O。PCR程序为:
95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 1 min, 40个循环, 同时
绘制熔解曲线。每个反应做 3次重复, 包括不加模板
的对照 (NTC), 本实验重复 3 次。根据 ABI PRISM
7500 SDS软件 (Applied Biosystems, USA) 生成的 CT
(cycle threshold) 值, 2−ΔΔCT计算基因相对表达量[21]。

结果
1 铁皮石斛 DoHMGR1基因克隆和全长验证
用兼并引物 HMGR-degF/R进行 RT-PCR, 克隆获
得 1条长度为 452 bp的 cDNA序列 (图 1A), BLASTX
分析其与 GenBank中已注册植物 HMGR基因有很高
的相似性 (>83%)。在此基础上, 进行RACE扩增 (图
1B, 1C), 获得 5、3末端 cDNA, 长度分别为 1 225 bp
和 667 bp, 与核心序列拼接后获得一条 2 071 bp 的
cDNA, 暂命名为 DoHMGR1, 提交 GenBank获得注
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Figure 1 The agarose gel electrophoresis of (A) the core fragment (1), (B, C) 3/5-RACE (2/3), and (D) full length (4) amplification
products of DoHMGR1 cDNA; M-DL 2000 standard molecular marker

册号 JX272632。ORF Finder 分析显示, DoHMGR1
ORF长 1 689 bp、5-UTR长 114 bp、3-UTR长 243 bp,
含有真核生物 mRNA 转录终止加尾信号 AATAA 及
polyA尾巴结构; 起始密码子附近碱基序列AACATGG
遵循KOZAK规则[22]。使用HMGR-orfF/R进行RT-PCR
扩增, 获得长 1 920 bp的单一条带 (图 1D), 克隆、
测序分析显示其含有完整的 ORF, 说明已成功获得
该基因全长 cDNA。
2 DoHMGR1基因编码蛋白的序列分析
2.1 DoHMGR1 基因编码蛋白理化特性分析 由
DoHMGR1基因推测所编码的蛋白, Protparam预测其
分子式为 C2611H4241N731O798S34, 分子量为 59.73 kD,
等电点 6.18, 带负电残基 (Asp + Glu) 为 56, 带正
电残基 (Arg + Lys) 为 52。该蛋白的不稳定系数
(instability index) 为 49.28, 属于不稳定蛋白。脂肪系
数 (aliphatic index) 为 97.56, 亲水性系数 (grand
average of hydropathicity, GRAVY) 为 0.186。SOPMA
分析显示 DoHMGR1 基因编码的蛋白二级结构中 α-
螺旋占 46.80%、延伸链占 12.81%、β-折叠占 4.98%、
无规卷曲占 35.41%。
2 . 2 D o H M G R 1 编码蛋白结构域预测分析
InterProScan 分析结果显示, DoHMGR1 蛋白含有 4
个保守结构域, 分别是羟甲基戊二酰辅酶 A 还原酶
家族保守的结构域 (第 63～561 位氨基酸)、3-羟基-
3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶结构域 (147～551)、
羟甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶 NAD 结合结构域
(268～383) 和羟甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶底物
结合结构域 (124～541), 符合已报道的植物 HMGR
蛋白的典型结构特征[2]。PROSITE SCAN 分析表明,
DoHMGR1蛋白含有数目不等的保守基元 (motif), 包
括 1个 ATP/GTP结合位点 (152～159)、3个 N-糖基
化位点 (298～301、304～307、550～553)、2个 cAMP-
cGMP 依赖蛋白激酶磷酸化位点 (183～186、372～
375)、9个蛋白激酶 C磷酸化位点 (3～5、20～22、
186～188、247～249、306～308、370～372、414～
416、552～554、556～558)、7个酪蛋白激酶 II磷酸
化位点 (30～33、112～115、113～116、294～297、
331～334、460～463、552～555) 和 12个 N-豆蔻酰
化位点 (201～206、241～246、258～263、366～371、
420～425、425～430、428～433、446～451、483～
488、488～493、502～507、524～529), 赋予该蛋白
一定的生物学功能。
2.3 DoHMGR1 蛋白信号肽、亚细胞定位、跨膜区
预测分析 PSORT 预测显示 DoHMGR1 定位在质
膜的可能性高达 60%, 定位于叶绿体类囊体膜、高尔
基体和内质网膜的几率分别为 48.5%、40% 和 50%。
SignalP 4.0分析其不含信号肽, TMHMM预测表明其
具有 2 个跨膜域, 分别位于 42 和 64 之间以及 85 和
107之间的多肽链, 与 PSORT预测的结果吻合, 说明
该蛋白质可能属于膜相关蛋白而非分泌蛋白。
2.4 DoHMGR1 蛋白三维建模 在 SWISS-MODEL
依据保守结构域作图工具中, 以人类的 HMGR (PDB
No.: 2Q6B) A链为模板[17], 对DoHMGR1蛋白进行三
维结构建模 (图2), 结果显示DoHMGR1与人类HMGR
蛋白有 56.05% 的相似性, 空间结构类似。
2.5 DoHMGR1 基因编码蛋白的多序列比对分析
运用 DNAStar 6.0中的 MegAlign程序对 DoHMGR1
蛋白和 7 种植物 HMGR 蛋白进行多序列比对分
析。图 3 结果表明, 8 个蛋白 C 末端的氨基酸序列
有较高保守性, N 末端序列存在较大差异。铁皮石
张 琳等: 珍稀濒危药用铁皮石斛 HMGR基因的克隆和特征分析 · 415 ·


Figure 2 Three-dimensional structure of the deduced DoHMGR1 protein using SWISS-MODEL


Figure 3 Multiple sequence alignments of DoHMGR1 and HMGR proteins from other plant species. At, Gb, Gu, Nt, Os, Pg, Sm and
Do represent Arabidopsis thaliana, Ginkgo biloba, Glycyrrhiza uralensis, Nicotiana tabacum, Oryza sativa, Panax ginseng, Salvia
miltiorrhiza, and Dendrobium officinale, respectively; I and II respectively show the HMG_CoA-binding motif I and HMG_CoA-binding
motif II; III and IV respectively show the NADP(H)-binding motif III and NADP(H)-binding motif IV
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斛 DoHMGR1基因编码的蛋白与水稻 (Oryza sativa)
OsHMGR2 (AAD08820) 相似性最高 (73.1%), 与烟
草 (Nicotiana tabacum) NtHMGR (AAL54879)、丹参
SmHMGR2 (ACT65734)、西洋参 (Panax ginseng)
PgHMGR (ADI80346)、甘草 (Glycyrrhiza uralensis)
GuHMGR (AEH58930)、银杏 (Ginkgo biloba) GbHMGR
(AAU89123)、拟南芥 (Arabidopsis thaliana) AtHMGR2
(AAA67317) 等次之, 相似性分别为 68.1%、67.8%、
67.6%、67.1%、62.8% 和 62.6%。DoHMGR1与其他
物种的 HMGR 蛋白一样, 均具有 HMG-CoA 结合基
序 (EMPVGYVQIP和 TTEGCLVA) 和 NADP(H) 结
合基序 (DAMGMNM和 GTVGGG)。
2.6 DoHMGR1 基因编码蛋白的系统进化树分析
进一步用 MEGA 4.0软件邻接法 (neighbour-joining)
构建DoHMGR1与 44条HMGR基因编码蛋白的系统
进化树 (图 4), 来源于不同物种的 HMGR基因被聚成
真菌、动物和植物三大类群; DoHMGR1与万代兰所
在分支和水稻、玉米、短柄草等植物 HMGR 基因聚
在一起, 表明其与单子叶植物亲缘关系较近, 和已报
道的植物 HMGR基因分子系统进化结果一致[12, 14]。
3 DoHMGR1基因表达特异性分析
分别提取铁皮石斛植物的根、茎、叶等样品的总
RNA, 利用 qPCR技术检测基因组织表达模式。图 5
结果表明, DoHMGR1 为组成型表达, 其转录本在石
斛 3种器官中的相对表达量存在差异。以叶为校正样


Figure 5 Tissue-specific expression pattern of DoHMGR1 using
qPCR analysis



Figure 4 Phylogenetic tree of DoHMGR1 with various HMGR genes; The symbol * indicates monocot species; The symbol # shows
gymnosperm plants
张 琳等: 珍稀濒危药用铁皮石斛 HMGR基因的克隆和特征分析 · 417 ·

本, DoHMGR1 在根、茎中表达量较高, 分别为叶中
的 2.13倍和 1.98倍。

讨论
3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶在萜类
物质生物合成过程中发挥重要作用, 许多模式植物
和药用植物中均有 HMGR 基因分子特性研究的相关
报道[2−16]。植物中 HMGR 呈多基因家族, 一般含有
至少 2个以上的成员, 如拟南芥[2]、大戟[12]和人参[16]
等植物中现已报道有 2个成员, 橡胶[6]和丹参[14]中有
4 个, Southern blot 分析显示红豆杉中存在多基因家
族成员[9]。HMGR 基因家族成员在植物细胞萜类物
质合成代谢调控中可能发挥不同的生物学功能。本研
究利用兼并引物扩增铁皮石斛 HMGR核心保守区时,
获得 2条序列 (均为 452 bp), 其中一条 cDNA与霍山
石斛 (D. huoshanense) HMGR基因片段 (AGT78194)
有 99% 的相似性, 该基因表达丰度较低, RACE克隆
未能获取全长 (未发表资料)。DoHMGR1 是首个从
珍稀濒危兰科药用铁皮石斛中克隆的 HMGR 编码基
因, 与多种植物 HMGR 基因高度同源, 编码蛋白具
有 HMGR 蛋白家族保守结构域和底物结合位点。进
化关系分析显示 DoHMGR1 基因隶属于植物类群的
单子叶分支, 与万代兰、水稻、玉米等单子叶植物亲
缘关系较近。这些结果说明 DoHMGR1 是编码铁皮
石斛 3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶的全长
新基因。
基因表达研究是解析基因功能的首要前提。大
量研究表明, 植物 HMGR 基因组织表达模式具有较
大差异, 一些 HMGR 基因呈组成型表达, 可能参与
调控细胞的基本生理代谢。如红豆杉 (Taxux media)
TmHMGR基因在叶、根、茎中表达量基本一致[9]。另
一部分 HMGR 基因具有组织表达特异性, 与其所发
挥的生物学功能有一定关系。甜瓜 (Cucumis melo)
CmHMGR 基因在授粉早期果实中大量表达, 随果
实长大剧烈下降 , 与果实发育密切相关 [ 3 ]。杜仲
(Eucommia ulmoides) EuHMGR基因在茎、叶中表达较
高, 根中较低[10]。SmHMGR2在叶中表达量最高, 茎和
根中表达量次之[14]。人参 (Panax ginseng) PgHMGR2
基因在人参的花和叶中表达量最高, 分别是根中的
40、10倍以上, 茎中表达量很低, 可能与花中人参皂
苷含量较高密切相关[17]。此外, 外源 SA、MeJA等激
素处理能诱导植物HMGR基因上调, 如欧榛 (Corylus
avellana) CgHMGR[5]、SmHMGR1[13]、SmHMGR2[14]
等, 说明植物激素信号途径在萜类代谢途径的重要
调控作用。本研究 qPCR 分析揭示 DoHMGR1 基因
表达呈组织特异性, 在 3种器官中表达量大小依次为
根 > 茎 > 叶, 与南京椴 (Tilia miqueliana) TmiHMGR[7]、
EpHMGR[12]和 SmHMGR2[14]表达模式相似, 提示该
基因可能在石斛根中执行重要的分子调控功能。
利用遗传功能互补或转基因过表达等策略, 已
经明确了长春花[8]、红豆杉[9]、杜仲[10]、银杏[11]、大
戟[12]、丹参[14]和甘草[15]等药用植物 HMGR基因在萜
类合成调控中的分子作用, 其他药用植物 HMGR 基
因功能尚不清楚, SmHMGR[13]、PgHMGR2[16]等基因
研究也仅限于转录水平。本研究的后续工作将包括
DoHMGR1基因功能互补分析、蛋白表达的酶学催化
功能研究以及铁皮石斛 HMGR 基因家族其他成员的
分子克隆, 进一步鉴定DoHMGR1及其他成员的生物
学功能、各成员之间是否存在协同作用或功能冗余,
以期为开展铁皮石斛萜类物质合成的分子调控研究
提供物质基础。
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