全 文 ：基因组学与应用生物学，2009年，第 28卷，第 6期，第 1117-1122页
Genomics and Applied Biology, 2009, Vol.28, No.6, 1117-1122
研究报告
Research Report
拟南芥中磷脂酶 Dγ2的低温信号转导作用途径分析
赵鹏 1,2 王道龙 1*
1中国农业科学院农业资源与农业区划研究所,北京, 100081; 2中山火炬职业技术学院,中山, 528436
*通讯作者, wangdl@cjac.org.cn
摘 要 磷脂酶 D (PLD)的磷脂降解功能和信号转导功能均能影响植物的抗冻性。本研究以 PLDγ2基因被
敲除的拟南芥突变体及其野生型为材料，进行低温驯化和冻害胁迫处理，随后由这两种植株的表型及其离子
渗透率等来分析 PLDγ2基因对拟南芥抗冻性。结果发现，经直接冻害处理后，PLDγ2敲除型的抗冻性与野生
型基本一致；但经过低温驯化后的冻害处理，PLDγ2敲除型的抗冻性弱于野生型，即表明 PLDγ2基因参与了
低温信号转导作用。进一步的实验结果表明 PLDγ2基因介导脯氨酸调控的可溶性物质调控途径和过氧化物
酶(POD)活性调控的抗氧化系统途径；但是与低温信号激素 ABA不在同一条信号转导途径。
关键词 磷脂酶 D, PLDγ2,拟南芥,低温驯化,信号转导
Signal Transduction Pathway of Arabidopsis Phospholipase Dγ2 in the Low
Temperature
Zhao Peng 1,2 Wang Daolong 1*
1 Instiute of Agricultaral Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, 100081; 2 Zhongshan Torch Polytech-
nic, Zhongshan, 528436
* Corresponding author, wangdl@cjac.org.cn
DOI: 10.3969/gab.028.001117
Abstract Both the functions of phospholipid degradation and signal transduction of phospholipase D (PLD) could
affect plant freezing tolerance. In this research, we employed a PLDγ2 gene knockout mutant of Arabidopsis thaliana
and its wild-type plants as the tested materials by treatment with cold acclimated and freezing stressed in a climate
chamber, and then we detected the changes in phenotype and membrane ion leakage of these tested materials in order
to clarify freezing tolerance of PLDγ2 gene in Arabidopsis thaliana.The results showed that PLDγ2-KO plants has
the same freezing tolerance with its wild-type after freezing stressed, but PLDγ2-KO plants was consistently less re-
sistant to freezing than wild-type after cold-acclimation and freezing stressed. These results indicated that PLDγ2
gene mediated in signal transduction function of low temperature, further experimental results make clear that
PLDγ2 gene involved in osmotic adjustment pathway in the process of low temperature signal transduction mainly by
regulating proline level and anti-oxidation system regulation which mainly by regulating POD activity, but it was not
in the same pathway in which of signal hormone ABA.
Keywords Phospholipase D, PLDγ2, Arabidopsis thaliana, Cold acclimation, Signal transduction
www.genoapplbiol.org/doi/10.3969/gab.028.001117
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(30771701)资助
植物生物膜在植物遭受低温冻害时最先受破坏，
对植物抗冻性起着关键作用(Steponkus, 1984)。磷脂是
生物膜组成的骨架成分，遇到低温胁迫等逆境就会水
解(Yoshida, 1979)。磷脂酶 D (Phospholipase D, PLD)
就是植物中一种关键的磷脂水解酶，而且植物中
PLD基因家族比其它生物体中要复杂，拟南芥中就
有 12个 PLD基因被鉴定(Liscovitch et al., 2000)。根
据基因的结构和它们编码的 PLD的序列相似性、域
结构、生化特性以及 cDNA克隆的顺序，可分成 6种
类型，PLDα (3)，PLDβ (2)，PLDγ (3)，PLDδ，PLDε和
PLDζ(2) (Wang, 2000; Wang, 2002)。PLD结构的多
样性决定了它们生物化学性质的特异性。
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
PLD还是一类重要的跨膜信号转导酶类。近年
来，人们通过反义抑制法或者基因敲除等分子操作
手段成功地筛选到了拟南芥 PLD的基因缺失突变
体，使得不同类型的 PLD基因在逆境胁迫、激素反
应、防御反应等方面的重要功能不断被揭示。Young
等(1996)发现当白叶枯病侵染水稻时，水稻 PLDα活
性明显提高，抗病性品种尤为明显而且 PLDα聚集于
病菌与植物相接触的部位，这可能表明 PLDα参与对
病菌的抵御过程。Sang等(2001)实验观察到拟南芥
PLDα缺失株的抗旱力较野生型的低，证明 PLDα可
能参与植物干旱胁迫。Li等(2004)实验发现 PLDδ基
因被敲除后，抗冻性下降，而 PLDδ超表达时拟南芥
的抗冻性提高，表明 PLDδ介导拟南芥低温抗冻性。
刘斌等(2002)将 PLDγ 反义基因转入三倍体毛白杨
后，转化株的耐盐碱能力明显提高，在含盐量达 0.5%
的土壤环境中仍可快速生长。目前对 PLDγ基因功能
的研究较少，本文将重点探讨 PLDγ对低温驯化信号
转导的介导作用及其作用机理，从而探索提高植物
抗冻性的新途径。
1材料与方法
1.1供试材料
试验材料为 PLDγ2基因被敲除的拟南芥突变体
及其哥伦比亚野生型拟南芥(由美国密苏里大学的王
学敏教授惠赠)。本试验于 2007年至 2008年间在中
国农业科学院农业环境与可持续发展研究所进行。
1.2植物材料的培养、低温驯化与冻害胁迫处理
1.2.1植物材料的培养
选取拟南芥种子播种在培养皿中，2周后移栽至
盆内，放置于培养箱中，生长条件设置为：白天温度
23℃、光照 12 h，光照强度为 24 000 Lx，湿度 80%；
黑夜温度 19℃，黑暗 12 h，湿度 65%。
1.2.2低温驯化与冻害胁迫处理
利用 PU-4K型人工气候霜箱(日本 ESPEC公司)
对拟南芥进行低温驯化和冻害胁迫处理。低温驯化
处理方法为将长至 35 d左右未开花的拟南芥，放置入
4℃的人工气候霜箱中保持 3 d。冻害胁迫处理按照模
拟自然降温的方式进行程序设置，即先从室内温度迅
速降至 4℃(设定时间为 0.5 h)，再以 3℃/h的速度降
至-2℃，保持 3 h，保持期间喷适量水，防止材料出现
过冷却状态，之后以 2℃/h的速率降至-20℃，在降至
预定的处理温度下取出处理材料。取出冻害处理的材
料后，先放置于 4℃冰箱中解冻 24 h，之后再放置于
人工气候培养箱中，正常生长条件培养 7 d，在 7 d时
对处理后材料的冻害情况进行观察和拍照。
1.3离子渗漏率的测定
参照Welti等(2002)测定离子渗漏率的方法。将
低温冻害处理后的植株置于 4℃下解冻 24 h，之后取
每个处理温度下的材料叶片各 3枚，放置于去离子
水中，在 23℃水浴下轻微振荡 1 h，测定初电导值；之
后在 100℃下煮沸 10 min，冷却至 23℃测定总电导
值。离子渗漏率＝初电导值 /总电导值。离子渗漏率越
高，表示植株的受冻害程度越严重，离子渗漏率越
低，则反之。
1.4 ABA处理和抗冻性鉴定
拟南芥长至 30d未开花时，用浓度为 30 μmol/L
外源 ABA对基因敲除型和野生型植株进行根施处
理，处理 4 d后放置于人工气候霜箱中进行低温冻害
处理，处理程序参照 1.2.2的降温程序，处理完成后
进行调查拍照并测定离子渗漏率。
将长至 30 d未开花的拟南芥植在 4℃下低温驯
化 3 d，驯化完成后将植株叶片立即采集放入液氮中保
存，再用冻干机制成干粉(Li et al., 2004)待用。接着用
酸性水合茚三酮比色法测定脯氨酸含量(邹琦, 2000)，
用蒽酮比色法测定可溶性糖含量(Li et al., 2004)。
1.6抗氧化酶系统活性的测定
取 1~2 g处理后的叶片放入预冷的研钵中，加入
1 mL预冷磷酸缓冲液在冰浴中加石英砂研磨，将研磨
好的酶液倒入容量瓶并加缓冲液定容至 25mL，混匀后
吸取 10mL至离心管中离心 20min，转速 3000 r/min，
取上清液制成实验所需酶液备用。取相应酶液分别用氮
蓝四唑法测定超氧化物歧化酶(SOD) (李合生等, 2003)，
用比色法测定过氧化氢酶(CAT) (曾永三和王振中,
2004)，用愈创木酚法测定过氧化物酶(POD) (郝再彬
等, 2004)。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测
定(邹琦, 2000)。
2结果与分析
2.1 PLDγ2基因参与低温信号转导作用
PLDγ2基因敲除型和野生型拟南芥未经低温驯
化的直接冻害 7 d后观察结果如图 1所示，两者的抗
冻性基本一致；同时结合冻害处理后的电导率测定
结果(图 2)，两者的电导率变化趋势基本一致。由此
可推断 PLDγ2基因没有参与组成型抗冻型的调控。
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图 4 PLDγ2基因敲除型与野生型拟南芥低温驯化后的离子渗
漏率比较
注: WT:野生型拟南芥；γ2: PLDγ2基因敲除型
Figure 4 Ion leakage comparison of cold-acclimated PLDγ2-KO
and wild-type of Arabidopsis thaliana
Note: WT : Wild-type of Arabidopsis thaliana; γ2: PLDγ2-KO
图 3 PLDγ2基因敲除型和野生型拟南芥低温驯化后的冻害
处理比较
注: A,C,E:野生型拟南芥; B,D,F: PLDγ2-KO
Figure 3 Freezing tolerance comparison of cold-acclimated
PLDγ2-KO and wild-type of Arabidopsis thaliana
Note: A,C,Ewild-type ofArabidopsis thaliana; B,D,F: PLDγ2-KO
图 2 PLDγ2基因敲除型与野生型拟南芥未低温驯化后的离子
渗漏率比较
注: WT:野生型拟南芥；γ2: PLDγ2-KO
Figure 2 Ion leakage comparison of non-acclimated PLDγ2 and
wild-type of Arabidopsis thaliana
Note: WT: Wild-type of Arabidopsis thaliana; γ2: PLDγ2-KO
图 1 PLDγ2基因敲除型与野生型拟南芥未低温驯化后的冻害
处理表型比较
注: A,C,E:野生型拟南芥; B,D,F: PLDγ2-KO
Figture 1 The phenotype comparison of freezing sensitivity of
non-acclimated KO-γ2 and wild-type of Arabidopsis thaliana
Note: A,C,E:Wild-type ofArabidopsis thaliana; B,D,F: PLDβ-KO
两者经低温驯化后的冻害处理 7 d后观察结果
如图 3所示，敲除型弱于野生型的抗冻性；同时冻害
处理后的电导率测定结果(图 4)也表现为离子渗漏率
率高于野生型，即敲除型抗冻性弱于野生型的抗冻
性。由此可推断 PLDγ2基因参与低温信号转导途径。
2.2 低温胁迫下 PLDγ2未参与 ABA调节过程
PLDγ2 基因敲除型和野生型拟南芥植株经过
ABA根施处理 4 d后，从冻害处理的结果可以看出
敲除型与野生型冻害处理后的抗冻性基本一致，没
有显著差异(图 5)；同时结合测定的离子渗漏率也可
拟南芥中磷脂酶 Dγ2的低温信号转导作用途径分析
Signal Transduction Pathway of Arabidopsis Phospholipase Dγ2 in the Low Temperature 1119
基因组学与应用生物学
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图 5 PLDγ2基因敲除型和野生型 ABA处理后的抗冻性比较
注: A,C,E:野生型拟南芥; B,D,F: PLDγ2-KO
Figture 5 Freezing tolerance comparison of PLDγ2-KO and wild-
typeofArabidopsis thaliana after treatingwithABA
Note:A,C,E:Wild-type ofArabidopsis thaliana; B,D,F: PLDγ2-KO
图 6 PLDγ2基因敲除型和野生型拟南芥 ABA 处理后的离
子渗漏率比较
注: WT:野生型拟南芥; γ2: PLDγ2基因敲除型
Figture 6 Comparison of ion leakage of PLDβ-KO and wild-type
of Arabidopsis thaliana after treating with ABA
Note: WT: Wild-type of Arabidopsis thaliana; γ2: PLDγ2-KO
图 7 PLDγ2基因敲除型和野生型拟南芥低温驯化后的可溶性
糖含量
注: WT:野生型拟南芥; γ2: PLDγ2-KO
Figure 7 Soluble sugar content of cold-acclimated PLDγ2-KO
and wild-type of Arabidopsis thaliana
Note: WT: Wild-type of Arabidopsis thaliana; γ2: PLDγ2-KO
图 8 PLDγ2基因敲除型和野生型拟南芥经低温驯化的脯氨
酸含量
注: WT:野生型拟南芥; γ2: PLDγ2-KO
Figture 8 Proline content of cold-acclimated PLDγ2-KO and
wild-type of Arabidopsis thaliana
Note: WT: Wild-type; γ2: PLDγ2-KO
以看出两者之间离子渗漏程度相当，也没有显著的
差异(图 6)。因此，我们推断 PLDγ2基因参与低温信
号转导的途径与低温信号激素 ABA介导低温信号
的调节途径可能不在同一条途径上，两者有着其各
自特异的途径。
2.3低温胁迫下PLDγ2参与脯氨酸调节途径
将 PLDγ2基因敲除型和野生型经过 3 d的低温
驯化，而后测量可溶性糖和脯氨酸含量。可溶性糖含
量如图 7，同时利用 DPS进行数据分析，得到两者之
间的可溶性糖含量差异不大，呈不显著；脯氨酸的含
量如图 8所示，野生型脯氨酸含量显著高于敲除型
的含量，但含量差异未达到极显著水平。结果表明
PLDγ2基因参与渗透调节物质中脯氨酸的调节途径。
2.4 低温胁迫下 PLDγ2 在低温驯化过程中参与抗氧
化酶活性的调节
经过 3 d低温驯化后 PLDγ2基因敲除型和野生
型的 SOD酶活性如图 9所示，野生型的 SOD酶活
性高于敲除型，但是两者之间的含量差异不显著，表
明 PLDγ2基因未参与 SOD活性调控途径，同时两者
的 CAT 活性如图 10 所示，差异也不显著，表明
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图 12 PLDγ2基因敲除型和野生型拟南芥低温驯化后MDA含
量比较
注: WT:野生型拟南芥; γ2: PLDγ2-KO
Figture 12 Comparison of MDA content of cold-acclimated
PLDγ2-KO and wild-type of Arabidopsis thaliana
Note：WT : wild-type of Arabidopsis thaliana; γ2: PLDγ2-KO
图 10 PLDγ2基因敲除型和野生型低温驯化后的 CAT活性比
较 注: WT:野生型拟南芥; γ2: PLDγ2-KO
Figture 10 Comparison of CAT activity of cold-acclimated
PLDγ2-KO and wild-type of Arabidopsis thaliana
Note: WT : wild-type of Arabidopsis thaliana; γ2: PLDγ2-KO
图 11 PLDγ2基因敲除型和野生型拟南芥低温驯化后的 POD
活性比较
注: WT:野生型拟南芥; γ2: PLDγ2-KO
Figure 10 Comparison of POD activity of cold-acclimated
PLDγ2-KO and wild-type of Arabidopsis thaliana
Note: WT: Wild-type of Arabidopsis thaliana; γ2: PLDγ2-KO
图 9 PLDγ2基因敲除型和野生型野生型低温驯化后的 SOD
活性比较
注: WT:野生型拟南芥; γ2: PLDγ2-KO
Figture 9 Comparison of SOD activity of cold-acclimated PLDγ2
-KO and wild-type of Arabidopsis thaliana
Note: WT : Wild-type of Arabidopsis thaliana; γ2: PLDγ2-KO
PLDγ2基因未参与 CAT活性途径的调控。而敲除型
的 POD活性高于野生型的 POD活性(图 11)且差异
显著，但差异未达到极显著水平，表明 PLDγ2基因参
与了 POD活性调节的途径。
2.5 低温胁迫下 PLDγ2参与MDA含量积累的途径
经过 3d低温驯化后，PLDγ2基因敲除型和野生
型的丙二醛含量如图 12所示，PLDγ2敲除型的MDA
含量高于野生型，达到显著水平，表明 PLDγ2基因参
与MDA含量积累的途径。
3结论
实验结果表明 PLDγ2基因参与介导低温信号转
导的途径，但没有参与组成型抗冻性的调控，这表明
了 PLDs基因对拟南芥抗冻性影响的多样性和复杂
性。PLDγ2基因参与低温胁迫下介导脯氨酸积累和
POD活性变化过程，但是 PLDγ2基因参与途径与低
温信号激素 ABA不在同一条信号转导途径。
低温驯化过程会引起一系列的生理变化，其中包
括一些渗透调节物质的积累(Karen and Lynch, 1992)。
实验中发现低温处理后野生型脯氨酸含量显著高于
敲除型的含量，而可溶性糖的含量相近，表明 PLDγ2
基因对脯氨酸的积累有影响，可能介导脯氨酸积累
的信号途径。
ABA是重要的逆境激素，可以提高植物的抗逆
性，包括抗冻性。Kang等(2002b)研究表明低温会引
起内源 ABA的瞬间或者持续性积累，最终导致诱导
基因表达及植物抗冻性的提高。而在诱导植物抗冻
性过程中，提高内源 ABA水平和施加外源 ABA均
能提高植物抗冻性，实验证明利用外源施用 ABA可
以显著提高玉米、水稻等植物的抗冷性(Anderson et
al., 1994)。本实验对 PLDγ2基因敲除型和野生型植
株外源施用 ABA后进行冻害处理，分析离子渗漏率
拟南芥中磷脂酶 Dγ2的低温信号转导作用途径分析
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结果发现 ABA处理后各植株的抗冻性比直接冻害
处理植株的抗冻性强，但两者之间抗冻性却没有明显
差别。这说明 PLDγ2基因参与的低温信号转导途径
与低温胁迫中的 ABA途径可能不在同一条上。
抗氧化系统活性强能够使自由基和活性氧水平
保持在较低水平，保护植物免受冻害产生的活性氧和
自由基伤害，保护膜结构功能，避免膜脂过氧化和膜
蛋白的聚合，从而提高植物的抗冻性。但是当抗氧化
系统受到破坏时，植物中的MDA含量就会增加，所
以实验室中，通常以MDA的含量作为发生膜脂过氧
化反应的主要指标，用以表示植物对逆境条件反应的
强弱(陈贵等, 1991)。PLDγ2基因参与抗氧化系统活性
变化过程，PLDγ2基因主要参与 POD活性途径，这就
使得 PLDγ2基因对于MDA的生成有一定的影响。
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