全 文 ：设施蔬菜种植年限对氮素循环微生物群落
结构和丰度的影响*
王亚男1 摇 曾希柏1**摇 王玉忠2 摇 白玲玉1 摇 苏世鸣1 摇 吴翠霞1 摇 李莲芳1 摇 段摇 然1
( 1中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 /农业部农业环境重点实验室, 北京 100081; 2甘肃省凉州区农业技术推广
中心, 甘肃武威 733000)
摘摇 要摇 以甘肃武威设施菜地为研究对象,采用末端限制性片段多态性分析(PCR鄄T鄄RFLP)
和实时荧光定量 PCR( real鄄time PCR)相结合的方法,研究了设施菜地种植 3、9、14、17 年等年
限下土壤中细菌、氨氧化细菌(AOB)和 nirK 型反硝化细菌群落结构和丰度的变化. 结果表
明: 设施菜地中细菌、氨氧化细菌和 nirK 型反硝化细菌优势种群及丰度与大田明显不同,并
随种植年限不同发生变化.随种植年限的增加,细菌和 nirK 型反硝化细菌的丰度呈现先增后
减的趋势,分别在种植 14 年和 9 年达到最大,0 ~ 20 cm土层为每克干土 9. 67伊109、2. 30伊107
个拷贝数,是种植 3 年的 1. 51、1. 52 倍;而氨氧化细菌的丰度则呈现出先减后增的趋势,在种
植 14 年的 0 ~ 20 cm土层为每克干土 3. 28伊107个拷贝数,仅是种植 3 年土壤的 45. 7% ,说明
设施菜地中参与氮素循环的功能微生物生态适应机制存在显著差异.研究结果为进一步研究
设施栽培条件下土壤微生物的适应机制等奠定了基础.
关键词摇 蔬菜种植年限摇 末端限制性片段多态性分析摇 实时荧光定量 PCR摇 群落结构和丰度
*“十二五冶国家科技支撑计划项目(2012BAD05B06)和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助.
**通讯作者. E鄄mail: zengxibai@ caas. cn
2013鄄07鄄31 收稿,2014鄄01鄄19 接受.
文章编号摇 1001-9332(2014)04-1115-10摇 中图分类号摇 S154. 3摇 文献标识码摇 A
Effects of vegetable cultivation years on microbial biodiversity and abundance of nitrogen cy鄄
cling in greenhouse soils. WANG Ya鄄nan1, ZENG Xi鄄bai1, WANG Yu鄄zhong2, BAI Ling鄄yu1,
SU Shi鄄ming1, WU Cui鄄xia1, LI Lian鄄fang1, DUAN Ran1 ( 1 Institute of Environment and Sustain鄄
able Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Agricul鄄
tural Environment and Climate Change, Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China;
2Liangzhou Center of Agricultural Technology Extension, Wuwei 733000, Gansu, China) . 鄄Chin. J.
Appl. Ecol. , 2014, 25(4): 1115-1124.
Abstract: The effects of facility vegetable cultivation years ( three, nine, fourteen or seventeen
years) on biodiversity and abundance of soil microorganisms, such as bacteria, ammonia oxidizing
bacteria (AOB) and nirK type denitrifying bacteria, in the greenhouse soils in Wuwei of Gansu
Province, China were determined by the combined analyses of terminal restriction fragment length
polymorphism (T鄄RFLP) and real鄄time quantitative PCR. The results showed that the dominant
population structure and abundance of bacteria, AOB, nirK type denitrifying bacteria in the soils
were significantly different from those in the farmland fields. The dominant population also changed
with the cultivation years. With the increase of vegetable cultivation years, the abundance of 16S
rRNA and nirK gene in the 0-20 cm soil layer first increased and then decreased, with the maxi鄄
mum values of 9. 67伊109and 2. 30伊107 copies·g-1 soil at year 14 and year 9, being as 1. 51 and
1. 52 times of that of the 3鄄year, respectively. However, the abundance of amoA gene showed an
opposite trend. The amoA gene copy number in the 14鄄year sample was 3. 28伊107 copies·g-1soil,
which was only 45. 7% of that of the 3鄄year. These results illustrated that the ecological adaptation
mechanisms of the different functional microorganisms involved in nitrogen cycling had significant
differences in the facility vegetable soils, and provided a base for further researches on exploring
应 用 生 态 学 报摇 2014 年 4 月摇 第 25 卷摇 第 4 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Apr. 2014, 25(4): 1115-1124
and explaining the characteristics and adaptation mechanisms of microorganisms in greenhouse soil.
Key words: vegetable cultivation years; terminal restriction fragment length polymorphism ( T鄄
RFLP); real鄄time fluorescent quantitative PCR (real鄄time PCR); community structure and abun鄄
dance.
摇 摇 土壤微生物是农田生态系统的重要组成部分,
是土壤质量变化最敏感的指标,也是土壤健康的决
定性因素[1] .农田中微生物的种类与数量在很大程
度上受到种植方式、种植年限、作物种类及施肥等因
素的影响.设施种植经济效益高、受季节变化影响
小,近年来在我国发展迅速,但因其种植方式相对单
一、农业生产资料投入量大、生产环境可控且相对封
闭,使得土壤质量随种植年限的延长出现了不同程
度的退化[2-3],并导致土壤微生物群落结构、数量及
功能的变化[4-5] .近年来,国内外学者针对设施菜地
微生物特别是细菌、真菌、放线菌数量变化等方面的
研究较多[4-6],并取得了一些较有价值的结论,但针
对参与氮素循环功能微生物群落结构和数量变化的
研究则相对较少.在参与氮素循环的微生物中,氨氧
化细菌( ammonia oxidizing bacteria, AOB)、氨氧化
古菌(ammonia oxidizing archaea, AOA)和反硝化细
菌分别是执行硝化、反硝化过程的重要功能微生物,
在土壤氮素循环中起着十分重要的作用. 土壤中所
有的氨氧化细菌都具有 amoA 基因,该基因编码的
氨单加氧酶是执行硝化过程中氨氧化反应的限速
酶[7] .同样,反硝化细菌具有的 Cu鄄亚硝酸还原酶
(nirK)和细胞色素 cd1鄄亚硝酸还原酶(nirS)是将亚
硝酸盐还原成 NO 的重要限速酶[8-10],也是区别于
其他硝酸盐代谢的标志性反应.因此,amoA、nirK 和
nirS基因常被作为分子标记物用于研究参与土壤中
硝化、反硝化过程的重要功能微生物.
土壤中氨氧化细菌和反硝化细菌的群落结构及
数量丰度易受土壤通气性[11-12]、 pH 值[13]、含水
量[14-15]、温度[14-16]、 氮素 含 量[11] 以 及 植 被 类
型[12,17]等多种因素的影响. 在设施栽培条件下,上
述各因素与大田均具有显著差异,且随设施菜地种
植年限的增加,土壤理化性质和大田的差异也相应
增大,并导致土壤中氨氧化细菌和反硝化细菌群落
结构等出现相应的差别. 本研究采用末端限制性片
段多态性分析 ( terminal restriction fragment length
polymorphism,T鄄RFLP)方法探讨了设施菜地不同种
植年限下土壤微生物群落结构的变化,并结合荧光
定量 PCR( real鄄time fluorescent quantitative PCR)方
法定量分析了细菌、氨氧化细菌和 nirK 型反硝化细
菌群落数量的变化规律,为揭示设施菜地种植年限
对土壤氮循环重要功能微生物群落的影响趋势,并
进一步探讨设施种植条件下土壤微生物的适应机制
等奠定基础.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试土壤
供试土壤采自甘肃武威市凉州区高坝镇(37毅
53忆 N,102毅40忆 E)农户家相邻的不同种植年限的设
施菜地,采样区属于大陆干旱气候,海拔 1550 m.各
设施大棚长 25 ~ 40 m、宽 7. 0 ~ 7. 5 m,至取样时,种
植蔬菜年限分别为 3、9、14、17 年(记为 GS3、GS9、
GS14、GS17),分为 0 ~ 20 cm和 20 ~ 40 cm两个土层,
每个种植年限选择 3 个大棚取样,每个大棚均按照
蛇形布点法采集 5 个点样品并均匀混合. 不同种植
年限设施菜地的施肥、灌溉及蔬菜类型和品种按当
地农民习惯进行,每一茬作物在整个生长周期分
10 ~ 14次浇水,使土壤保持最大田间持水量的 45%
左右,棚内温度保持在 25 ~ 40 益,主要作物种类为
西红柿、黄瓜、辣椒、豇豆,采样时尽量选择作物类型
和品种、施肥及管理等相对一致的大棚.根据采样时
调查结果,研究区域内设施菜地全年施肥量换算成
氮、磷、钾用量分别为:N 1480 kg·hm-2、P2O5 1500
kg·hm-2、K2O 1120 kg·hm-2,所用肥料类型包括
猪粪、牛粪、复合肥、有机鄄无机复合肥、尿素、磷酸二
铵等,肥料中化肥氮和有机肥氮的比例约为 7 颐 10.
在采集不同种植年限设施土壤的同时,按相同方法
采集相邻大田的土壤样品(记为 FS)作为对照,大田
种植模式为小麦、玉米轮作,全年施肥量换算成氮、
磷、钾用量大致为: N 663 kg· hm-2、 P2O5 742郾 5
kg·hm-2、K2O 144 kg·hm-2,所用肥料种类包括牛
粪、复合肥、尿素、磷酸二铵等,肥料中化肥氮和有机
肥氮的比例约为 13 颐 10.
采样时间为 2010 年 7 月 8 日,将采集的土壤样
品分为 2 份,其中一份过 2 mm 尼龙筛后放入冰盒,
带回实验室保存在-20 益冰箱中用于微生物分析,
另一份按照常规方法处理、保存,用于理化性质测
定[18] .硝态氮和铵态氮用新鲜土样、采用流动注射
分析仪测定[19];pH 值采用玻璃电极法(土水比 1 颐
6111 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
5)、有机质采用重铬酸钾容量法、全钾含量采用氢
氧化钠溶解法、全磷含量采用硫酸高氯酸消解法分
别测定[18] .
1郾 2摇 土壤微生物 DNA的提取
土壤微生物总 DNA 的提取方法和步骤按照土
壤基因组 DNA 提取试剂盒[ Fast DNA SPIN(BIO
101)]的说明进行,最后用 100 滋L DES 洗脱液进行
洗脱分离.将提取的 DNA 采用超净 DNA 纯化试剂
盒(MO BIO Labs, Solana Beach, CA)进行纯化去除
干扰杂质,最终分装保存于-20 益冰箱中[20] .
1郾 3摇 细菌、氨氧化细菌和 nirK 型反硝化细菌 T鄄
RFLP分析
将细菌 16S rRNA 基因(27F / 907R)、氨氧化细
菌的 amoA(amoA鄄1F / amoA鄄2R)和反硝化细菌 nirK
(nirK鄄1F / nirK鄄5R)引物对中的一条进行 6鄄FAM 荧
光标记后,采用 50 滋L 的 PCR 反应体系扩增. 体系
包括 1伊PCR缓冲液(TaKaRa)、1. 5 mol·L-1 MgCl2
(TaKaRa)、200 滋mol·L-1 dNTP(TaKaRa),前后引
物 0. 4 滋mol·L-1(TaKaRa)、0. 25 U 的 DNA Taq 酶
(TaKaRa),模板 1 滋L(提取 DNA 稀释 5 倍),用灭
菌超纯水补足 50 滋L. 反应条件为:94 益 3 min;
94 益 45 s,退火温度(16S rRNA 基因 52 益,amoA
57 益,nirK 55 益)45 s,72 益 90 s,25 个循环;72 益
延伸 6 min. PCR产物用 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检
测,生工纯化试剂盒纯化,-20 益保存备用.
纯化后 PCR 产物分别采用限制性内切酶 Msp
玉、Msp玉和 Hae 芋(Fermentas International Inc. )
20 滋L酶切体系进行酶切.酶切产物采用乙醇沉淀法
纯化,进行 T鄄RFLP分析前,根据纯化后 PCR产物的
浓度确定最终加 10 滋L 灭菌超纯水.将 1 ~ 2 滋L 上
述纯化产物加入去离子甲酰胺和内标的混合物中.
混合液在 95 益变性 3 min,然后立即置于冰上冷却.
消化产物在 3130 测序仪(ABI)中进行聚丙烯酰胺
凝胶电泳,用自动测序仪进行检测,末端带荧光标记
的片段能被自动检测.
1郾 4摇 阳性克隆质粒 DNA的挑选和检测
利用细菌 16S rRNA 基因(27F / 907R)、氨氧化
细菌的 amoA ( amoA鄄1F / amoA鄄2R)和反硝化细菌
nirK(nirK鄄1F / nirK鄄5R)的不带荧光标记引物对进行
PCR扩增,扩增产物切胶纯化回收. 纯化产物采用
pMD19鄄T Vector(TaKaRa)连接后,转化到 JM109 感
受态细胞(TaKaRa)中,涂在含有 X鄄Gal、IPTG、Amp
的 LB琼脂平板培养基上,37 益过夜培养,形成单菌
落.挑选白色克隆至 LB鄄Amp 平板上划线,37 益过
夜培养.检测白色菌落是否为阳性克隆,将阳性克隆
质粒送至博迈德公司测序分析,确认是所需条带后,
测定质粒 DNA的浓度并制备定量 PCR标准曲线.
1郾 5摇 微生物荧光定量 PCR的测定
1郾 5郾 1 细菌 16S rRNA 基因的荧光定量 PCR摇 细菌
16S rRNA 基因定量 PCR 引物对为 Eub338 (5 爷鄄
ACTCCTACGGGAGGCAGCAG鄄3爷) 和 Eub518 ( 5 爷鄄
ATTACCGCGGCTGCTGG 鄄3爷) [21] . 25 滋L 的 PCR 反
应体系包括:12. 5 滋L 2伊iQ5 缓冲液,0. 2 滋mol·L-1
引物(TaKaRa),2 滋L 20 倍稀释的 DNA 模板,加灭
菌高纯水补足 25 滋L. 反应程序为: 95 益 变性
15 min;然后 95 益变性 1 min,53 益退火 30 s,72 益
延伸 1 min,80 益收集荧光信号 30 s,共 40 个循环;
最后做溶解曲线,从 55 益开始温度以 0. 2 益每个循
环递增,每个循环 6 s,至 95 益结束[22] .
1郾 5郾 2 氨氧化细菌的 amoA 基因的荧光定量 PCR摇
氨氧化细菌的 amoA基因定量 PCR 引物对为 amoA鄄
1F 和 amoA鄄2R. 25 滋L 的 PCR 反应体系包括:
12. 5 滋L 2伊iQ5 缓冲液,0. 2 滋mol·L-1引物(TaKa鄄
Ra),2 滋L 20 倍稀释的 DNA模板,最后用灭菌高纯
水补足 25 滋L. 反应程序为:95 益变性 4 min;然后
95 益变性 30 s,57 益退火 45 s,72 益延伸 1 min,
82 益收集荧光信号 30 s,共 40 个循环;95 益 1 min,
55 益 1 min;最后做溶解曲线,从 55 益开始温度以
0. 2 益每个循环递增,每个循环 10 s,至 95 益结束.
1郾 5郾 3反硝化细菌 nirK基因的荧光定量 PCR摇 亚硝酸
盐还原功能基因 nirK 的定量 PCR 引物对为 nirK876
(5 爷鄄ATYGGCGGVCAYGGCGA鄄3 爷) 和 nirK1040 ( 5 爷鄄
GCGTCGATCAGRTTRTGGTT鄄3爷)[23-24] . 25 滋L的 PCR
反应体系包括:12. 5 滋L 2伊iQ5 缓冲液,0. 2 滋mol·L-1
引物(TaKaRa),2 滋L 20倍稀释的 DNA模板,最后用
灭菌高纯水补足 25 滋L. 反应程序为降落式
(touchdown) PCR:95 益变性 15 min;95 益变性 15 s,
63 益退火 30 s(每个循环减少 1 益,直到 58 益),
72 益延伸30 s,80 益收集荧光信号30 s,共6个循环;
95 益变性 15 s,60 益退火 30 s,72 益延伸 30 s,80 益
收集荧光信号 30 s,共 40 个循环;最后做溶解曲线,
先 95 益 15 s,然后从 60 益开始到 95 益结束[23] .
1郾 6摇 数据处理
使用 Biological Tools (2. 0)软件对 T鄄RFLP分析
结果进行多样性指数分析,采用 SPSS 16. 0 软件进
行相关分析和 one鄄way ANOVA单因素方差分析,处
理间的差异性分析采用 Duncan法,显著性水平设定
为 P<0. 05.
71114 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 王亚男等: 设施蔬菜种植年限对氮素循环微生物群落结构和丰度的影响摇 摇 摇 摇 摇
2摇 结果与分析
2郾 1摇 不同种植年限下土壤理化性质的变化
不同种植年限的设施菜地与大田土壤的理化性
质均有显著差异(表 1).从整体上看,设施菜地土壤
中 pH值均低于大田,而有机质、硝态氮、铵态氮、全
磷和全钾的含量则明显高于大田. 这种结果可能与
设施菜地耕作频繁、养分投入量大等因素有关,化肥
及有机肥的大量投入使土壤中养分的累积速度加
快,但同时不合理的施肥方式和用量也可能造成土
壤养分失衡,加速土壤酸化的进程[26] .
摇 摇 设施菜地 0 ~ 20 cm 土层中,pH 值随种植年限
的增加呈逐年下降趋势,土壤有机质和硝态氮含量
则随种植年限增加而上升,且部分种植年限间含量
差异达到极显著水平.其中有机质含量在种植至 14
年时最高,硝态氮含量则在 17 年时达到最高,其达
到最高值时的含量分别是大田的 2. 36 和 8. 41 倍,
说明在设施栽培条件下有机肥和氮肥的施用量大、
表层土壤中有机质和硝态氮的累积趋势明显[5];土
壤铵态氮含量随种植年限的变化无明显规律,但与
大田比较均有所增加,其主要原因可能与设施种植
下氮肥施用量较大、氮素矿化速率较快等有关;土壤
全磷含量随种植年限的变化无明显规律,但与大田
相比均有较大幅度增加,可能与设施菜地中磷肥施
用量较大、且磷的移动性较小等有关;土壤全钾含量
则不同设施种植年限间差异不大,且与大田比较亦
无太大变化,说明本研究设施菜地中钾肥的施用量
与蔬菜的吸钾量之间基本上能维持动态平衡. 20 ~
40 cm土层中,上述指标的变化规律与 0 ~ 20 cm 土
层基本一致.
2郾 2摇 不同设施种植年限下土壤微生物群落结构的
变化
2郾 2郾 1 不同设施种植年限下细菌群落结构的变化摇
细菌的 16S rRNA基因扩增产物经 Msp玉酶切后,共
得到 35 种 T鄄RFs片段(图 1A).由于片段种类较多,
所以每种片段所占百分比含量均较低,但还是不难
发现,138 bp(2% ~ 9. 8% )、147 bp(2. 2% ~ 9% )、
150 bp(11. 5% ~30. 3% )、543 bp(8. 7% ~ 22. 4% )
这 4 种片段在所有片段中所占百分比含量较高且不
同种植年限间有较明显差异,说明设施菜地中细菌
的优势种群在很大程度上会受到种植年限的影响.
上述 4 种片段中,150 bp片段百分比含量在种植 17
年的土壤中明显升高,这一片段所代表的微生物大
部分属于酸杆菌门的细菌[25],适宜在酸性土壤中生
存,说明随着种植年限延长、土壤趋于酸化,使得这
类耐酸性细菌所占比例大大增加. 而 77、109、162、
165 bp等片段仅在个别种植年限的设施菜地中出
现,大田中不存在,亦说明设施菜地土壤中存在特殊
种群,并与大田中的种类具有差异,但种类和所占比
例较少.
从细菌的主成分分析图(图 2A)可以看出,第 1
主成分 PC1 可以解释 58. 6%的物种变量,第 2 主成
分 PC2 可以解释 22. 8%的物种变量.设施菜地中细
菌的主要种类与大田具有明显差异,大田主要分布
在 PC2 的正轴,设施菜地则大部分分布在 PC2 的负
轴,尤其在种植 17 年的土壤中与大田距离最远,说
明土地利用方式的改变使得土壤中细菌种类发生明
显变化.同时,随种植年限的增加,设施菜地细菌的
种类也会发生明显变化,其差异主要与 PC1 主成分
关系密切.由于第 1 主成分可以解释的物种变量高,
表 1摇 不同种植年限的设施菜地理化性质
Table 1摇 Physical and chemical properties of soils with different cultivation years
土层
Soil layer
(cm)
处理
Treatment
pH 有机质
Organic matter
(g·kg-1)
硝态氮
Nitrate鄄N
(mg·kg-1)
铵态氮
Ammonium鄄N
(mg·kg-1)
全磷
Total P
(g·kg-1)
全钾
Total K
(g·kg-1)
0 ~ 20 FS 8. 34a 17. 98d 42. 70e 10. 07c 0. 66e 23. 86a
GS3 7. 55c 32. 88c 188. 76d 15. 59a 1. 15d 24. 20a
GS9 7. 80b 33. 49c 195. 30c 11. 57b 2. 11b 23. 33a
GS14 7. 43c 42. 39a 210. 25b 12. 50b 1. 60c 23. 68a
GS17 7. 24d 39. 35b 359. 12a 11. 62b 2. 32a 23. 41a
20 ~ 40 FS 8. 25a 13. 60c 73. 72c 10. 78c 0. 57e 23. 53a
GS3 7. 93b 15. 16c 105. 91b 11. 16c 0. 73d 25. 36a
GS9 7. 80b 31. 67b 68. 61d 16. 34a 1. 96b 22. 57a
GS14 7. 60c 39. 04a 204. 91a 13. 38b 1. 60c 23. 30a
GS17 7. 47c 32. 16b 206. 42a 15. 66a 2. 23a 23. 82a
FS: 大田样品 Field sample; GS: 设施菜地土壤 Greenhouse soil; 3 ~ 17: 种植年限 Cultivation years. 同列同一土层不同字母表示差异显著(P<
0郾 05) Different letters in the same column for the same soil layer meant significant difference at 0. 05 level. 下同 The same below.
8111 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
图 1摇 不同设施种植年限下土壤微生物群落的 T鄄RFs百分比
Fig. 1摇 Percentage of relative abundance of soil microbial gene
T鄄RFs under different cultivation years.
A: 细菌 Bacteria; B: 氨氧化细菌 Ammonia oxidizing bacteria; C: nirK
型反硝化细菌 nirK type denitrifying bacteria. FS:大田样品 Field sam鄄
ple; GS:设施大棚样品 Greenhouse sample; 3 ~ 17:种植年限 Cultiva鄄
tion years. 下同 The same below.
所以说明耕作年限对细菌种类的影响比耕作方式更
加显著.
2郾 2郾 2 不同设施种植年限下氨氧化细菌群落结构的
变化摇 氨氧化细菌 amoA 基因扩增产物经 Msp玉酶
切后,共得到 4 种 T鄄RFs片段(图 1B).在设施菜地,
156 和 256 bp百分比含量在不同种植年限间变化不
大,说明这两种片段所代表的氨氧化细菌种类受种
植年限的影响较少,而 60 bp(31. 5% ~ 64. 8% )和
235 bp(11. 7% ~47. 0% )这两种片段百分比含量在
不同种植年限间差异明显.其中,60 bp 的百分比含
量随种植年限的增加先增后减,在种植 14 年的土壤
中最大;而 235 bp 的百分比含量随种植年限的增加
先减后增,在种植 14 年的土壤中最小. 经相关性分
析发现(表 2),60 bp片段百分比含量与土壤中的硝
图 2摇 不同设施种植年限下土壤微生物群落的主成分分析
Fig. 2摇 Principal component analysis of soil microorganism un鄄
der different cultivation years.
表 2摇 土壤微生物主要 T鄄RFs与土壤性质的相关性分析
Table 2摇 Correlation analysis of soil microbial gene main T鄄
RFs with soil physical and chemical properties (n=30)
基因种类
Types of
gene
片段长度
Fragment
length
(bp)
pH 有机质
Organic
matter
(mg·kg-1)
硝态氮
Nitrate鄄N
(mg·kg-1)
aomA 60 -0. 46 0. 32 0. 61*
nirK 61 -0. 41 0. 61* 0. 35
70 0. 78** -0. 73* -0. 51
109 -0. 52 0. 78** 0. 73*
156 -0. 72* 0. 36 0. 24
190 0. 82** -0. 60 -0. 56
450 0. 63* -0. 55 -0. 40
*P<0. 05; **P<0. 01.
态氮含量呈显著正相关( r = 0. 61,P<0. 05),可以推
测 60 bp片段所代表的氨氧化细菌种类对土壤中硝
态氮变化响应较敏感,在土壤的硝化反应中易受外
界环境的显著影响.此外,大田和设施菜地中氨氧化
细菌种类也有差别. 其中,156 bp 的百分比含量在
20 ~ 40 cm的大田中显著高于设施菜地. 经主成分
分析也发现,除 20 ~ 40 cm 大田中氨氧化细菌群落
91114 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 王亚男等: 设施蔬菜种植年限对氮素循环微生物群落结构和丰度的影响摇 摇 摇 摇 摇
不同于其他样品分布在 PC2 正轴外,其余样品的氨
氧化细菌群落组成与 PC1 关系更密切(图 2B).
2郾 2郾 3 不同设施种植年限下 nirK型反硝化细菌群落
结构的变化摇 反硝化细菌 nirK基因扩增产物经 Hae
芋酶切后,共得到 11 种 T鄄RFs片段(图 1C).设施菜
地与大田中的 nirK 型反硝化细菌的优势种群有所
不同.如 156 bp 所代表的反硝化细菌在设施菜地中
达到 37. 1% ~ 65. 2% ,是优势种群,而在大田中仅
占 12. 1% ~21. 2% ;70 bp 所代表的反硝化细菌则
在大田中占 38. 9% ~ 46. 4% ,是优势种群,而在设
施菜地中仅占 6. 2% ~ 18. 6% . 同时, 109、 156、
190 bp等片段的百分比含量在设施菜地中较高,且
不同种植年限有较大差异,可以认为随着种植年限
的增加,设施菜地中 nirK型反硝化细菌的优势种群
发生转变.其中,156 bp 的片段所代表的优势种群
随种植年限的增加呈现先增后减的趋势,在种植 9
年的土壤中所占百分比含量达到最高,在 0 ~ 20 cm
为 45. 0% ,20 ~ 40 cm为 65. 2% .相关分析发现,pH
值与 70、190、450 bp 的百分比含量显著正相关(表
2),与 156 bp百分比含量显著负相关,由此可知,设
施菜地中 pH值是影响反硝化细菌优势种群的主要
因素.有机质含量也可以对部分片段产生影响,如
61、70 和 109 bp.
从 nirK型反硝化细菌的主成分分析图(图 2C)
可以看出,第 1 主成分 PC1 可以解释 76. 6%的物种
变量,第 2 主成分 PC2 可以解释 19. 1%的物种变
量.设施菜地与大田中反硝化细菌的种类差异明显.
大田中反硝化细菌种类分布在 PC1 的正轴,设施菜
地大部分分布在 PC1 的负轴,且不同种植年限下反
硝化细菌种类差异主要与 PC2 关系密切,随种植年
限的增加,到 14 和 17 年时,反硝化细菌种类集中分
布在 PC2 正轴.
2郾 3摇 不同设施种植年限下土壤微生物多样性指数
的变化
2郾 3郾 1 细菌摇 生物多样性指数是描述生物类型数和
均匀度的一个度量指标,它在一定程度上可反映生
物群落中物种的丰度程度及其各类型间的分布比
例.表 3 列出不同种植年限下细菌 T鄄RFLP 分析后
得到的细菌多样性指数结果,可以看出,设施菜地与
大田中细菌的多样性指数有差异(P<0. 05),大田
0 ~ 20 cm的 Shannon、Margalef和均匀度指数均高于
或等于设施菜地,是种植 14 年的设施菜地的 1. 06、
1. 05、1. 00 倍. 大田表层土壤通风透气等环境条件
优于设施菜地,受人为频繁干扰较少,微生物分布均
匀,比例协调,所以多样性指数高. 而 20 ~ 40 cm大
田的 Shannon、Margalef 指数则低于设施菜地,可能
是由于土壤养分不足造成的.
摇 摇 设施菜地的两个土层中,随着种植年限的增加,
Shannon、Margalef和均匀度指数均呈现出先增后减
的趋势. 0 ~ 20 cm在种植 14 年和 9 年的土壤中 3 个
指数达到最高,为 2. 962、4. 014、0. 931;20 ~ 40 cm
层土壤中 3 个指数在种植 9 年时达到最高,为
3郾 004、3. 562、0. 938. 随着种植年限的继续增加,到
17 年时,土壤中 3 个指数均降为最低.
2郾 3郾 2 氨氧化细菌和 nirK型反硝化细菌摇 表 4、表 5
为不同种植年限氨氧化细菌和 nirK 型反硝化细菌
T鄄RFLP分析后得到的多样性指数结果.两种功能微
生物的 Shannon、Margalef和均匀度指数的变化并不
像细菌那样有规律,种植年限对其多样性指数虽然
有影响但随种植年限的增加其变化并无规律性.可
表 3摇 设施种植年限对细菌多样性指数的影响
Table 3摇 Effects of cultivation years on the biodiversity in鄄
dices of bacteria in soils
土层
Soil
layer
(cm)
处理
Treat鄄
ment
Shannon
指数
Shannon
index
Margalef
指数
Margalef
index
均匀度指数
Evenness
index
0 ~ 20 FS 3. 137a 4. 214a 0. 932a
GS3 2. 706c 3. 060b 0. 885b
GS9 2. 834bc 3. 010b 0. 931a
GS14 2. 962ab 4. 014a 0. 892b
GS17 2. 426d 2. 208c 0. 885b
20 ~ 40 FS 2. 736bc 2. 785bc 0. 927ab
GS3 2. 843ab 3. 261ab 0. 911b
GS9 3. 004a 3. 562a 0. 938a
GS14 2. 949ab 3. 562a 0. 921ab
GS17 2. 393c 2. 208c 0. 872c
表 4摇 设施种植年限对氨氧化细菌多样性指数的影响
Table 4摇 Effects of cultivation years on the biodiversity in鄄
dices of ammonia oxidizing bacteria (AOB) in soils
土层
Soil
layer
(cm)
处理
Treat鄄
ment
Shannon
指数
Shannon
index
Margalef
指数
Margalef
index
均匀度指数
Evenness
index
0 ~ 20 FS 1. 087a 0. 452a 0. 784a
GS3 1. 129a 0. 452a 0. 814a
GS9 1. 154a 0. 452a 0. 833a
GS14 1. 059a 0. 452a 0. 764a
GS17 1. 112a 0. 452a 0. 802a
20 ~ 40 FS 1. 300a 0. 452a 0. 938a
GS3 1. 306a 0. 452a 0. 942a
GS9 1. 030c 0. 452a 0. 743c
GS14 1. 097bc 0. 452a 0. 791bc
GS17 1. 141b 0. 452a 0. 823b
0211 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
表 5摇 设施种植年限对 nirK型反硝化细菌多样性指数的影响
Table 5摇 Effects of cultivation years on the biodiversity in鄄
dices of nirK type denitrifying bacteria in soils
土层
Soil
layer
(cm)
处理
Treat鄄
ment
Shannon
指数
Shannon
index
Margalef
指数
Margalef
index
均匀度指数
Evenness
index
0 ~ 20 FS 1. 746ab 1. 355a 0. 758b
GS3 1. 717ab 1. 355a 0. 746bc
GS9 1. 327c 1. 054c 0. 638d
GS14 1. 831a 1. 355a 0. 795a
GS17 1. 619b 1. 204b 0. 737c
20 ~ 40 FS 1. 566ab 1. 355a 0. 680c
GS3 1. 479b 0. 753d 0. 825a
GS9 1. 221c 1. 054c 0. 587d
GS14 1. 673a 1. 054c 0. 804ab
GS17 1. 677a 1. 204b 0. 763b
能是因为氧气含量[11-12]、pH 值[13]、土壤有机质含
量[20]、土壤温湿度[14-16]、氮素含量[11]等因素均会对
氨氧化细菌和 nirK 型反硝化细菌的群落结构有影
响,而不同种植年限对其群落多样性的影响是各个
因素相互抵消或叠加后综合作用的表现,故群落多
样性指数的变化无规律性.
2郾 4摇 不同设施种植年限下土壤微生物群落丰度的
变化
细菌 16S rRNA基因荧光定量 PCR的标准曲线
的 R2 = 0. 996,扩增效率为 105. 2% ,利用该曲线分
析土壤中细菌 16S rRNA基因拷贝数变化(图 3A).
设施菜地中细菌的丰度高于大田,并且随着种植年
限的增加,两个土层细菌的丰度均呈现先增后减的
趋势.在种植 14 年的土壤中达到最大,0 ~ 20 cm 层
为每克干土 9. 67伊109个拷贝数,20 ~ 40 cm 层为每
克干土 7. 44伊109个拷贝数,分别是种植 3 年土壤的
1. 51 和 2. 98 倍.随着种植年限继续延长,细菌的丰
度逐渐降低,在种植 17 年土壤中降到比种植 3 年的
土壤还要低,接近大田水平.比较不同土层中细菌丰
度发现,0 ~ 20 cm 的细菌丰度均显著(P = 0. 032 <
0郾 05)高于 20 ~ 40 cm,在种植 3 年的土壤中差异
最大.
氨氧化细菌的 amoA基因荧光定量 PCR的标准
曲线的 R2 =0. 999,扩增效率为 81. 7% ,利用该曲线
分析土壤中氨氧化细菌的 amoA 基因拷贝数变化
(图 3B).大田中的氨氧化细菌的丰度并不是一直低
于设施菜地.在 0 ~ 20 cm 土层,设施菜地种植 3 和
17 年的土壤中氨氧化细菌的丰度远高于大田,分别
为每克干土 7. 18伊107和 7. 19伊107个拷贝数,而种植
1 4年的土壤中氨氧化细菌的丰度则低于大田 . 在
图 3摇 不同设施种植年限下土壤微生物群落丰度
Fig. 3摇 Gene abundance of soil microbe under different cultiva鄄
tion years.
20 ~ 40 cm 土层,氨氧化细菌的丰度在种植 3 年的
土壤中最高,为每克干土 7. 11伊107个拷贝数,此时
大田中丰度最低,仅为每克干土 1. 39 伊106个拷贝
数.在两个土层,氨氧化细菌的丰度随种植年限增加
均呈现先减后增的趋势,在种植 14 年土壤中的丰度
仅为种植 3 年的 45. 7% 、34. 2% .但 0 ~ 20 cm 土层
氨氧化细菌的丰度并不像细菌那样一直远高于
20 ~ 40 cm层,种植 3 年的两个土层中几乎相等且达
到最多,总体趋势是 0 ~ 20 cm 土层略大于 20 ~
40 cm土层.
反硝化细菌 nirK 基因的荧光定量 PCR 的标准
曲线的 R2 = 0. 999,扩增效率为 100. 4% ,利用该曲
线分析土壤中反硝化细菌的 nirK 基因拷贝数变化
(图 3C).大田中的 nirK 型反硝化细菌的丰度与种
植 17 年的设施菜地接近,显著低于种植 9 和 14 年
的设施菜地.随种植年限的增加反硝化细菌 nirK 基
因拷贝数变化明显且具有规律性,两个土层均呈现
先增后减的趋势,这与细菌的 16S rRNA 基因变化
12114 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 王亚男等: 设施蔬菜种植年限对氮素循环微生物群落结构和丰度的影响摇 摇 摇 摇 摇
规律相同.两土层在种植 9 年的设施菜地达到最高,
分别为每克干土 2. 30伊107、2. 22伊107个拷贝数,是
种植 3 年土壤的 1. 52、2. 70 倍.随着种植年限的继
续增加,nirK型反硝化细菌的丰度逐渐减低,到种植
17 时降到比大田还要低,仅为每克干土 1. 41伊107和
6. 66伊106个拷贝数.比较两个土层的 nirK 型反硝化
细菌丰度发现,在 0 ~ 20 cm 土层显著高于 20 ~
40 cm土层(P = 0. 0121<0. 05),但种植 9 年的两层
土壤中差异较小.
3摇 讨摇 摇 论
土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分,
在土壤营养元素循环、有机物质的形成和分解、肥力
的保持和提升、生态环境的改善、植物的生长发育和
作物病虫害防治等方面均起到极其重要的作用. 氨
氧化细菌是执行硝化作用的关键微生物,即将氨氧
化为亚硝酸盐,是硝化过程的一步,同时也是硝化作
用的限速步骤[27-28],广泛分布于土壤、淡水和海洋
环境中.执行反硝化过程的微生物在农田生态系统
的氮素损失和 N2O 等温室气体产生等方面也起着
重要作用.在反硝化过程中由亚硝酸盐转化为氧化
氮的过程是反硝化作用区别于其他硝酸盐代谢的标
志性反应,也是反硝化过程中最重要的限速步骤,主
要由两种亚硝酸盐还原酶(nir)催化完成[15] . 其中
一种是可溶性含铜酶(Cu鄄Nir),称为 Cu型亚硝酸盐
还原酶,由 nirK 基因编码;另一种是细胞色素还原
酶(cd1鄄Nir),由 nirS 基因编码[16] .虽然两种酶功能
相同,但结构及催化位点不同,且不能共存于同种细
胞中[29];有研究指出,nirK 存在于大多数反硝化细
菌中,对环境因子的响应比 nirS 基因更敏感[17] . 本
文利用 T鄄RFLP和实时荧光定量 PCR等分子生物方
法系统地研究不同种植年限下设施菜地中细菌、氨
氧化细菌和对环境比较敏感的 nirK 型反硝化细菌
群落结构和丰度的变化,突破了传统培养方法所造
成的微生物种类有限(仅为 1% )、大量有益信息丢
失等问题,能更全面、详细、准确地了解不同耕作方
式及不同种植年限对土壤中参与氮素循环过程重要
功能微生物的影响.
设施菜地常年处于集约化种植管理模式下,土
壤的理化性质和微生物组成与大田会有明显差异.
从本文的结果可以看出,设施菜地的 pH 值均显著
低于大田,而其他的养分指标,如有机质、硝态氮、全
磷等则均高于大田.其中设施菜地 0 ~ 20 cm土层的
pH值在种植 3 ~ 14 年之间每年以约 0. 01 个单位下
降,到种植 14 年以后下降幅度显著增加,平均每年
达 0. 06 个单位.由于设施土壤中的很多物理化学过
程如土壤微生物的活性、物质的存在形态以及土壤
重金属形态转化和有效性等都与 pH 值显著相关,
因此由于耕作方式改变而导致土壤理化性质的变化
是影响土壤环境质量的重要原因.同时,由于设施菜
地肥料投入量大使得土壤中的养分含量高,微生物
可以利用的底物丰富,再加上高温、高湿的土壤环
境,特别适宜各类土壤微生物的生存和繁殖,土壤中
参与硝化反硝化过程的微生物也较大田活跃. 对土
壤微生物群落进行分析也发现,设施菜地参与硝化
反硝化过程的微生物群落结构及丰度与大田均存在
差异.经主成分分析表明,细菌和 nirK 型反硝化细
菌的优势种群和丰度在两种不同耕作方式的土壤中
有明显差异.对细菌来说,大田中的种类主要分布在
PC2 的正轴,设施菜地则大部分分布在 PC2 的负
轴;对 niK型反硝化细菌来说,大田中反硝化细菌种
类分布在 PC1 的正轴,设施菜地大部分分布在 PC1
的负轴.氨氧化细菌的群落组成变化也是导致土壤
硝化过程和硝化势差异的关键因素[30] . Kowalchuk
等[31]指出不同种类和活性的氨氧化细菌可以使土
壤具有不同的硝化势. 本研究土壤中,60 和 235 bp
这两个片段所代表的氨氧化细菌在不同类型土壤中
的百分比差异较大,它们是造成土壤硝化作用差异
的主要类群. 60 bp 片段百分比含量与土壤中的硝
态氮含量呈显著正相关(P<0. 05),可知该片段所代
表的氨氧化细菌在土壤氨氧化过程中起到一定作
用.除了土地利用方式,种植年限对土壤质量和土壤
微生物也具有重要影响.
有研究表明,在长期蔬菜连作的土壤中氨氧化
细菌的群落组成有趋向单一化的趋势[30],多样性从
丰富变为较单一[32] .本研究中设施菜地种植年限对
氨氧化细菌和 nirK 型反硝化细菌的多样性虽然有
影响,但随种植年限的增加变化并没有规律性,大
田、种植 3 年与种植 17 年的土壤中氨氧化细菌和
nirK 型反硝化细菌的多样性指数均无较大差异. 一
般认为,氨氧化细菌的最适 pH值为 7. 0 ~ 8. 5,最适
温度为 24 ~ 28 益,反硝化细菌的最适 pH 值为 7 ~
9,最适温度范围较广,研究土壤中 pH 随种植年限
增加虽有明显下降趋势,但并没有达到对氨氧化细
菌和反硝化细菌的抑制作用,同时土壤中的有机质
和氮素含量较充足,因此使得氨氧化细菌和反硝化
细菌的多样性并没有出现随种植年限持续下降的
趋势.
2211 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
本研究中细菌、氨氧化细菌和 nirK 型反硝化细
菌的群落丰度随种植年限的变化规律并不一致. 细
菌和 nirK型反硝化细菌的丰度随种植年限的增加
均呈现先增后减的趋势,不同的是细菌的 16S rRNA
基因丰度在种植 14 年的土壤中达到最高,nirK 型反
硝化细菌丰度则在种植 9 年的土壤中达到最高. 而
氨氧化细菌群落丰度随种植年限的增加呈现先减后
增的趋势.土壤中 nirK型反硝化细菌群落丰度的变
化与细菌具有相同的趋势,可能说明研究土壤中的
细菌和 nirK型反硝化细菌种类对环境的生态适应
机制偏向于 K鄄对策种群,开始的土壤环境条件适
宜,突变的环境因素对群落数量的影响较小,使得种
群数量保持稳定,随着时间的延长,长期的综合效应
使得群落数量发生明显的波动. 而氨氧化细菌的数
量表现出不同的变化规律,可能是因为设施菜地存
在的氨氧化细菌种类对环境的生态适应机制更偏向
于 R鄄对策种群,环境的细微变化都会使得群落数量
发生大起大落的变动,使得在开始几年群落数量有
比较大的波动.随着种植年限的增加,土壤中的氮素
累积量增加,氨氧化细菌的种类稳定并向 K鄄对策转
变,群落得到恢复.为了对土壤微生物群落随种植年
限的变化有更深入的了解,可以通过合理安排时间
并采集更多年份土壤的方式加以解决.
4摇 结摇 摇 论
随种植年限的增加,设施菜地的 pH 值有明显
下降趋势,0 ~ 20 cm土层的有机质和硝态氮含量有
累积趋势.设施菜地和大田中细菌、氨氧化细菌和反
硝化细菌的优势种群差异明显,设施种植年限也会
导致优势种群群落结构发生变化. 随种植年限的增
加,细菌和反硝化细菌的丰度均呈现先增后减的趋
势,分别在种植 14 年和 9 年的土壤中达到最大;而
氨氧化细菌的丰度则呈现出先减后增的趋势,在种
植 14 年的土壤中最低,并且两个土层变化规律
一致.
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作者简介 摇 王亚男,女,1983 年生,博士研究生,助理研究
员.主要从事退化及污染农田修复、微生物分子生态学等研
究. E鄄mail: wangyanan@ caas. cn
责任编辑摇 肖摇 红
4211 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷