全 文 ：施肥对设施菜地 nirK型反硝化细菌群落
结构和丰度的影响*
曾希柏1**摇 王亚男1 摇 王玉忠2 摇 白玲玉1 摇 李莲芳1 摇 段摇 然1 摇 苏世鸣1 摇 吴翠霞1
( 1中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 /农业部农业环境重点实验室, 北京 100081; 2甘肃省武威市凉州区农业技
术推广中心, 甘肃武威 733000)
摘摇 要摇 采用末端限制性片段多态性分析(T鄄RFLP)和实时荧光定量 PCR( real鄄time PCR)方
法,研究了甘肃武威设施菜地不同施肥条件下 0 ~ 20 cm、20 ~ 40 cm 土层中土壤 nirK 型反硝
化细菌群落结构和丰度的变化.结果表明: 施肥对土壤中 nirK型反硝化细菌的群落结构具有
明显影响,且对 70、156、190 bp片段所代表设施菜地土壤优势种群影响最显著.施肥对 0 ~ 20
cm土层 nirK型反硝化细菌丰度有明显影响,其最大值出现在全有机肥(M)处理、为每克干土
2. 16伊107个拷贝数,分别是对照(CK)和全化肥(NPK)处理的 2. 04 和 2. 02 倍.设施菜地土壤
0 ~ 20 cm与 20 ~ 40 cm土层 nirK型反硝化细菌的优势种群及其基因丰度均存在显著差异,且
设施菜地土壤中 nirK型反硝化细菌的群落结构和丰度与大田差异明显. 土壤 pH 值、有机质
及硝酸盐含量均影响 nirK型反硝化细菌的群落结构和丰度.系统发育分析结果表明,土壤中
除存在与厌氧反硝化细菌亲缘相近的 nirK型反硝化微生物外,还存在与好氧反硝化菌亲缘关
系相近的 nirK型反硝化微生物,如根瘤菌属、苍白杆菌属、土壤杆菌属等.
关键词摇 nirK型反硝化细菌摇 末端限制性片段多态性分析摇 实时荧光定量 PCR摇 群落结构和丰度
*“十二五冶国家科技支撑计划项目(2012BAD05B06)和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助.
**通讯作者. E鄄mail: zengxibai@ caas. cn
2013鄄03鄄29 收稿,2013鄄11鄄17 接受.
文章编号摇 1001-9332(2014)02-0505-10摇 中图分类号摇 S154. 3摇 文献标识码摇 A
Effects of different fertilization regimes on abundance and community structure of the nirK鄄
type denitrifying bacteria in greenhouse vegetable soils. ZENG Xi鄄bai1, WANG Ya鄄nan1,
WANG Yu鄄zhong2, BAI Ling鄄yu1, LI Lian鄄fang1, DUAN Ran1, SU Shi鄄ming1, WU Cui鄄xia1 ( 1 In鄄
stitute of Environment and Sustainable Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural
Sciences / Ministry of Agriculture Key Laboratory of Agricultural Environment and Climate Change,
Beijing 100081, China; 2Liangzhou Center of Agricultural Technology Extension, Wuwei 733000,
Gansu, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. , 2014, 25(2): 505-514.
Abstract: The community structure and abundance of nirK鄄type denitrifying bacteria in different
soil layers (0-20 cm and 20-40 cm) under various fertilization regimes in Wuwei, Gansu Province
were investigated by the combination of terminal restriction fragment length polymorphism
(T鄄RFLP) and real鄄time quantitative PCR. Results showed that the nirK鄄type denitrifying bacteria
community structure was significantly affected by fertilization regimes, especially for 70, 156 and
190 bp T鄄RFs that represented the dominant populations in greenhouse soil. Fertilization regimes
significantly influenced the abundance of nirK gene in the 0-20 cm soil layer with the highest abun鄄
dance of nirK gene copy number (2. 16伊107 copies·g-1 soil) detected in the manure treatment
(M), which was 2. 04 and 2. 02 times of that in the control (CK) and chemical fertilizer (NPK)
treatments, respectively. Both the dominant population and abundance of nirK鄄type denitrifying
bacteria in the greenhouse soil were significantly different between the 0-20 cm and 20-40 cm soil
layers, and the nirK鄄type denitrifying bacteria community structure and abundance in the green鄄
house soil were obviously different from that in the field. Soil pH, soil organic matter content and
nitrate鄄N content had the greatest influence on the bacterial community composition. Phylogenetic
analysis indicated that there were not only anaerobic nirK鄄type denitrifying bacteria in greenhouse
应 用 生 态 学 报摇 2014 年 2 月摇 第 25 卷摇 第 2 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Feb. 2014, 25(2): 505-514
soil, but also aerobic denitrifying bacteria, such as Rhizobium, Ochrobactrum, Agrobacterium.
Key words: nirK gene denitrifying bacteria; terminal restriction fragment length polymorphism (T鄄
RFLP); real鄄time fluorescent quantitative PCR (real鄄time PCR); community structure and abun鄄
dance.
摇 摇 反硝化作用是农田生态系统中土壤氮素损失的
重要途径,该过程中产生的 N2O 还是主要的温室气
体.有研究者估计,全球 70% 的 N2 O 排放来自土
壤[1],其中农业生态系统的排放量约占 25% [2] . 由
亚硝酸盐还原为 NO的过程是反硝化作用区别于其
他硝酸盐代谢的标志性反应,也是反硝化过程中最
重要的限速步骤,亚硝酸盐还原酶(Nir)是执行该步
骤的限速酶,因此,nir 基因也成为反硝化细菌功能
基因中研究最多的基因[3] . Nir 酶包括进化关系不
相关且结构不同的 2 种酶,即 Cu鄄亚硝酸还原酶
(nirK)和细胞色素 cd1鄄亚硝酸还原酶(nirS),很多
研究将 nirK 和 nirS 基因作为环境样品中反硝化微
生物的分子标识物.作物类型[4-6]、肥料类型及施用
量[7-8]、土地利用方式[9-11]、温度[12-13]、土壤含水
量[12]、pH 值[12-13]等因素的变化均可导致具有 Nir
酶的反硝化细菌群落变化,且在环境中 nirK 基因比
nirS基因的分布更广泛、对环境因子的响应也更敏
感[4] . Enwall等[7]研究发现,长期施用有机肥改变
了土壤中反硝化细菌的群落结构,使得土壤中的反
硝化速率高于施用无机肥. Wolsing和 Prieme[8]通过
长期定位试验,发现施用有机肥和无机肥的农田中
nirK型反硝化细菌的群落结构和反硝化速率均有明
显差异.
设施菜地作为一种土地利用率高、集约化生产
的种植模式,施肥、栽培管理措施及土地利用方式、
作物种植类型、作物生长的小环境等均与大田具有
明显区别.设施菜地中过量的有机肥、氮肥投入和大
水漫灌,使得土壤中硝化反硝化作用强烈,N2O释放
通量比大田高 1. 41 倍[14],由于 0 ~ 40 cm 土层中
碳、氮等底物丰富,反硝化能力也相对更强[15] . 因
此,反硝化微生物在设施菜地中的重要性和作用不
容忽视,而目前针对设施条件下不同施肥模式对反
硝化细菌群落结构和数量影响的研究较少.近年来,
甘肃威武市设施农业发展迅速,到 2010 年底,仅凉
州区设施菜地面积已超过 6130 hm2 .本研究利用在
甘肃武威设施菜地中设置的长期定位试验,应用末
端限制性片段多态性分析( terminal restriction frag鄄
ment length polymorphism,T鄄RFLP)和实时荧光定量
PCR(real鄄time fluorescent quantitative PCR)方法,探
明了按当地农民习惯施肥以及习惯施肥基础上的减
量施肥、单施化肥、单施有机肥等施肥方式下,设施
菜地 0 ~ 20 cm 和 20 ~ 40 cm 土层中 nirK 型反硝化
细菌群落的组成和丰度变化,为深入探讨施肥对设
施菜地氮素循环过程及反硝化作用影响提供相应依
据,并为设施菜地合理施肥、提高氮肥利用率提供科
学参考.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 试验设计与土壤样品采集
试验始于 2007 年,地点位于甘肃省武威市高坝
镇(37毅53忆 N,102毅40忆 E),海拔 1632 m,属于大陆干
旱型气候.供试土壤为灌漠土,试验前对 0 ~ 20 cm
和 20 ~ 40 cm土层土壤的基本性质进行测定[16] .
试验共设置 5 个处理[16],分别为: 1 ) 对照
(CK),不施任何肥料;2)常规施肥(MNPK),按当地
农民习惯施肥;3)1 / 2 常规施肥(1 / 2 MNPK);4)全
有机肥(M);5)全化肥(NPK). 各处理施肥量见表
1,每个处理重复 3 次,随机区组设计.各处理施用的
化肥包括尿素、过磷酸钙、磷酸二铵和硫酸钾,有机
肥包括猪粪和牛粪,其中化肥氮和有机肥氮的比例
为 7. 24 颐 10. 作物生长期间的灌溉、耕作管理措施
等均按照当时农民的习惯进行,栽培作物为黄瓜和
西红柿轮作.
摇 摇 样品的采集参考文献[16],采样时间为最后一
次追肥施用后第 40 天(2010 年 7 月 8 日),作物收
获前.所采集的土壤经混合均匀并过 2 mm 尼龙筛
后分成两份,一份置于冰盒内带回实验室并保存于
-20 益冰箱中,用于微生物分析;另一份按常规方法
表 1摇 不同处理的施肥量
Table 1 摇 Fertilizer amount in different treatments
(kg·hm-2)
处理
Treatment
摇 N 摇 P2O5 摇 K2O
CK 0 0 0
MNPK 1480 1500 1120
1 / 2 MNPK 740 750 560
M 740 750 560
NPK 740 750 560
605 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
处理用于理化性质测定. 土壤保存和理化性质分析
参照鲍士旦[17]方法进行,土壤硝态氮含量采用流动
分析仪测定[18] . 所采集的土壤样品含水量约为
20% ,采样时大棚内温度为 40 益左右. 采集设施菜
地样品的同时,在临近玉米地采集土壤样品作为大
田对照.
1郾 2摇 土壤微生物 DNA的提取
土壤微生物总 DNA 的提取方法和步骤按照土
壤基因组 DNA 提取试剂盒[ Fast DNA SPIN(BIO
101)]的说明进行,提取完成后用 100 滋L DES 洗脱
液进行洗脱分离. 将提取的 DNA 采用超净 DNA 纯
化试剂盒(MO BIO Labs, Solana Beach, CA)进行纯
化去除干扰杂质,最终分装保存于-20 益冰箱中.
1郾 3摇 nirK型反硝化细菌 PCR扩增及 T鄄RFLP分析
对亚硝酸盐还原酶基因 nirK 进行 T鄄RFLP分析
时,对 nirK 基因的后引物 nirK鄄5R(5忆鄄GCCTCGAT鄄
CAGRTTRTGG鄄3忆)进行 6鄄FAM[19]荧光标记,前引物
为 nirK鄄1F ( 5忆鄄GGMATGGTKCCSTGGCA鄄3忆) [20] . 50
滋L的 PCR 反应体系包括:1 伊PCR 缓冲液( TaKa鄄
Ra), 1. 5 mmol · L-1 MgCl2 ( TaKaRa ), 200
滋mol·L-1 dNTP(TaKaRa),各引物 0. 5 滋mol·L-1
(TaKaRa),0. 25 U的 DNA Taq酶(TaKaRa),模板 1
滋L,用灭菌超纯水补足至总体积为 50 滋L. PCR采用
降落式(touchdown):94 益 2 min;94 益 30 s,57 益
30 s(每个循环后减少 0. 5 益),72 益 40 s,10 个循
环;然后 94 益 30 s,55 益 30 s,72 益 40 s,25 个循
环,最后 72 益延伸 7 min[11] . PCR产物用 1. 5%的琼
脂糖凝胶电泳检测并用生工纯化试剂盒纯化,-20
益保存备用.
纯化后 nirK 基因的 PCR 产物用限制性内切酶
Hae芋(Fermentas International Inc. )进行酶切. 反应
体系为:10伊Tango缓冲液 2 滋L,Hae芋 10 U,PCR纯
化产物 10 滋L,加灭菌超纯水补足至总体积为 20
滋L.混匀后 37 益酶切 3 ~ 6 h,65 益失活 20 min.
1郾 4摇 酶切产物的纯化和检测
酶切产物用乙醇沉淀法纯化,纯化后产物于
-20 益保存.将 1 ~ 2 滋L 上述纯化产物加入去离子
甲酰胺和内标的混合物中. 混合液在 95 益变性 3
min后立即置于冰上冷却.消化产物在 3130 测序仪
(ABI)上进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,利用峰高计算
不同片段的相对丰度.
1郾 5摇 克隆及测序分析
进行基因克隆 PCR扩增时,选用不带荧光标记
的前后引物,将 PCR 产物进行切胶回收纯化. PCR
纯化产物的连接转化步骤同相关文献方法[16] . 最
后,检测白色菌落是否为阳性克隆,将阳性克隆送博
迈德公司测序分析.
先利用 CHECK鄄CHIMERA 软件分析检查去除
嵌合及怪异序列.将测序的序列和下载的标准、相近
的 nirK基因序列,利用 Clustal X 和 Mega 5. 0 软件
分析多重比对后,采用邻接法( neighbor鄄joining)构
建系统发育树.将有效 nirK 基因序列提交 EMBL 核
苷酸数据库,获得系列号为 FR774836 ~ FR774914.
1郾 6摇 nirK型反硝化细菌定量 PCR
用阳性克隆质粒绘制 nirK功能基因定量 PCR标
准曲线.含有 nirK 基因反硝化细菌定量 PCR 引物为
nirK876(5忆鄄ATYGGCGGVCAYGGCGA鄄3忆)和 nirK1040
(5忆鄄GCGTCGATCAGRTTRTGGTT鄄3忆) [21-22] . 25 滋L 的
PCR反应体系包括:12. 5 滋L 2 伊 iQ5 缓冲液,0. 2
滋mol·L-1引物(TaKaRa),2 滋L 20 倍稀释的 DNA
模板,最后用灭菌高纯水补足体积.反应程序为降落
式(touchdown)PCR:95 益变性 15 min;95 益变性 15
s,63 益退火 30 s(每个循环减少 1 益,直到 58 益),
72 益延伸 30 s,80 益收集荧光信号 30 s,共 6 个循
环;95 益变性 15 s,60 益退火 30 s,72 益延伸 30 s,
80 益收集荧光信号 30 s,共 40 个循环;最后做溶解
曲线,先 95 益 15 s,然后从 60 益开始到 95 益结
束[22] .
1郾 7摇 数据处理
土壤理化性质和 nirK 型反硝化细菌群落结构
的关系用 CANOCO for Windows 4. 5 软件(Microcom鄄
puter Power, Ithaca, NY, USA)进行分析,相关数据
的方差分析和相关性分析采用 SPSS 16. 0 软件
(SPSS 16. 0 for Windows, SPSS Inc, Chicago, USA)
进行.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 施肥对土壤相关理化性质的影响
设施栽培 3 年后,不同处理间土壤的理化性质
出现了较明显的差异(表 2). 0 ~ 20 cm 土层中,不
施肥(CK)处理下土壤 pH 值显著高于各施肥处理,
其中,MNPK处理施肥量最高且 pH 值下降最明显,
仅为 8. 18,比 CK 降低 0. 6,说明施肥可使土壤 pH
值出现一定程度的降低. 各处理土壤有机质含量也
以 MNPK处理最高,为 21. 36 g·kg-1,M处理次之,
为 19. 21 g·kg-1,说明增加施肥量和有机肥用量均
可提高土壤有机质的含量.各处理土壤硝态氮含量
7052 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 曾希柏等: 施肥对设施菜地 nirK型反硝化细菌群落结构和丰度的影响摇 摇 摇 摇 摇 摇
表 2摇 不同处理第 3 年时土壤的理化性质
Table 2摇 Physical and chemical properties of soils in different fertilization treatments in the third year
土层
Soil layer
(cm)
处理
Treatment
pH 有机质
Organic matter
(g·kg-1)
硝态氮
Nitrate N
(mg·kg-1)
全磷
Total P
(g·kg-1)
全钾
Total K
(g·kg-1)
0 ~ 20 F 8. 30b 17. 79ab 3. 07c 0. 66c 23. 86ab
CK 8. 78a 12. 46c 4. 27c 0. 71c 22. 95bc
1 / 2 MNPK 8. 24b 16. 32bc 50. 88a 1. 04ab 23. 10abc
MNPK 8. 18b 21. 36a 33. 02ab 1. 25a 24. 01a
M 8. 46ab 19. 21ab 23. 57bc 0. 99b 22. 64c
NPK 8. 48ab 12. 96c 8. 35bc 0. 99b 22. 82c
20 ~ 40 F 8. 26d 13. 15bc 2. 59b 0. 57d 23. 53a
CK 8. 80a 12. 92c 2. 56b 0. 71cd 23. 04a
1 / 2 MNPK 8. 34cd 16. 19b 36. 74a 1. 02ab 23. 20a
MNPK 8. 26d 19. 44a 26. 50a 1. 16a 24. 06a
M 8. 54b 15. 09bc 18. 87ab 0. 91bc 23. 16a
NPK 8. 44bc 12. 46c 18. 90ab 0. 93b 23. 16a
F:大田 Field. 同列不同字母表示同一土层不同处理间差异显著(P<0. 05)Different letters in the same column meant significant difference among
treatments in the same soil layer at 0. 05 level.下同 The same below.
比较,以 CK处理最低,仅为 4. 27 mg·kg-1,只有含
量最高的 1 / 2 MNPK 处理 (50. 88 mg· kg-1 )的
8郾 4% ,其次是 NPK 处理,各处理间的差异显著,这
种结果可能与微生物参与的硝化反硝化过程等密切
相关.各处理土壤的全磷含量随施肥量的增加而增
加,以 CK 最低,MNPK 处理最高,为 1. 04 g·kg-1 .
各处理全钾含量的变化不大. 20 ~ 40 cm 土层中,土
壤 pH值、有机质、硝态氮和全磷含量的变化规律与
0 ~ 20 cm土层基本一致,其中,pH 值以 MNPK 处理
较低,为 8. 26,有机质和全磷含量以 MNPK 处理最
高,分别达 19. 44 和 1. 16 g·kg-1,硝态氮含量以
1 / 2 MNPK处理最高,为 36. 74 g·kg-1,且显著高于
其他处理的同一土层.与设施土壤相比较,大田土壤
除 pH值和有机质含量与 CK稍有差异外,其余指标
均与 CK 相近,且试验前土壤的理化性质[16]也与
CK相近,说明本研究中耕作年限对土壤理化性质的
影响远不如施肥显著.
2郾 2摇 施肥对 nirK型反硝化细菌群落结构的影响
将不同处理土壤样品的 nirK 功能基因扩增后
用限制性内切酶 Hae芋酶切,主要得到 61、70、109、
137、156、173、190、229、150 和 450 bp 这 10 种片段
(图 1).其中,70、156、190 bp片段为主要片段,占全
部片段百分比含量的 63. 4% ~ 86. 5% ,说明这些片
段所代表的 nirK型反硝化细菌在土壤中占优势.大
田土壤的 T鄄RFs 片段种类较设施菜地相对丰富,除
含有设施菜地各处理中均有的 10 个 T鄄RFs片段外,
0 ~ 20 cm土层还含有 4. 2%的 119 bp、7. 6%的 122
bp和 7. 9%的 186 bp,3 种片段占总量的 19. 7% ,这
可能也是设施土壤与大田土壤的重要差别.
0 ~ 20 cm 土层所含的主要片段中,70 bp 片段
百分比含量受施肥影响极显著(表 3),在大田中最
多,达 38. 9% , CK 和 NPK 处理次之,而以 1 / 2
MNPK处理最少,仅为 7. 8% . 156 bp 片段百分比含
量受施肥影响也极显著且变化规律与 70 bp 相反,
其中以 1 / 2 MNPK 处理下最多,达 61. 9%,CK 和大
田中则最少,仅分别为 30. 2%和 12. 1% . 190 bp 片段
则以 CK处理最多,为 17. 0%,大田次之,1 / 2 MNPK
处理最少,仅 7. 5% .此外,109 和 250 bp 片段的百分
比含量也显著受到施肥的影响,但它们在土壤中含量
普遍较少,仅个别样品达到 9. 0%左右. 20 ~ 40 cm土
层中,70、156、190 bp 这 3 个主要片段的百分比含
量受施肥影响的变化规律与0 ~ 20 cm土层中基本
图 1摇 不同处理 nirK型反硝化细菌 T鄄RFs相对丰度百分比
Fig. 1摇 Percentage of relative abundance of bacteria nirK T鄄RFs
in different treatments (mean依SE, n=3).
F:大田 Field. 下同 The same below. a)0 ~ 20 cm; b)20 ~ 40 cm.
805 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
表 3摇 不同处理下对 nirK基因 T鄄RFs百分比影响显著性的 ANOVA分析
Table 3摇 ANOVA analysis for the percentage of relative abundance of nirK T鄄RFs in different treatments
处理
Treatment
末端限制性片段 Terminal restriction fragment (bp)
61 70 109 137 156 173 190 229 250 450
A 0. 810 0. 0120* 0. 337 0. 053 0. 0003* 0. 983 0. 0001* 0. 820 0. 264 0. 258
B 0. 185 0. 0001* 0. 011* 0. 576 0. 0001* 0. 552 0. 0005* 0. 054 0. 005* 0. 671
A:土层间 Between soil layers; B:施肥处理间 Between fertilization treatments. *P<0. 05.
一致. 其中, 70 bp 在大田中最多,为 46. 3%,
1 / 2 MNPK处理最少,为 14. 8% . 156 bp 在 1 / 2 MNPK
处理最多,为 40. 4%,CK 最少,为 19. 4% . 190 bp 在
CK最多,为 26. 4%,1 / 2 MNPK处理最少,为 13郾 1% .
0 ~ 20 cm和 20 ~ 40 cm 土层比较,同一处理下
70、190 bp片段的百分比含量为 20 ~ 40 cm 层高于
0 ~ 20 cm层,156 bp 则是 0 ~ 20 cm 层高于 20 ~ 40
cm层.而在大田中,除 0 ~ 20 cm土层中含有一些不
同于设施菜地的 T鄄RFs 外,20 ~ 40 cm 土层土壤的
主要片段种类与设施菜地中一致,且与 CK 的 nirK
型反硝化细菌片段种类和丰度基本相似.
根据 T鄄RFs 的分析可得出,70、156、190 bp所代
表的 nirK型反硝化细菌既是优势种群又对施肥及
土壤性质的变化较敏感,可以推测它们所代表的反
硝化细菌类群可能在反硝化过程中起着非常重要的
作用.由设施菜地与大田中这 3 种片段所占的百分
比明显不同也可以看出,设施菜地中起作用的 nirK
基因型反硝化细菌与大田可能存在显著差别.
2郾 3摇 nirK型反硝化细菌群落结构与土壤理化性质
的相关性
不同施肥处理下,nirK 型反硝化细菌的优势种
群差异明显,这主要是因为nirK型反硝化细菌的群
图 2摇 基于 RDA的 nirK型反硝化细菌群落结构与土壤性质
的相关性
Fig. 2摇 Correlation of soil properties with the community struc鄄
ture of nirK denitrifying bacteria by RDA ( redundancy analy鄄
sis) .
TK:全钾 Total K; TP:全磷 Total P; SOM:土壤有机质 Soil organic
matter; Nitrate鄄N:硝态氮 Nitrate鄄N.
落结构与土壤理化性质密切相关. RDA 分析显示
(图 4),土壤 pH 值 ( r = 0. 279, F = 10. 861, P =
0郾 0013)、有机质含量 ( r = 0. 251,F = 9. 393,P =
0郾 0013)、硝态氮含量( r = 0. 313,F = 12. 774,P =
0郾 0007)、全磷含量 ( r = 0. 194, F = 6. 721, P =
0郾 0087)均极显著影响 nirK型反硝化细菌的群落结
构.而全钾含量对 nirK 型反硝化细菌群落无影响.
将土壤的理化性质与 nirK 型反硝化细菌的主要 T鄄
RFs进行相关性分析,发现 pH 值与 70、190 bp T鄄
RFs呈显著正相关,与 156 bp T鄄RFs呈显著负相关;
土壤有机质和硝态氮含量与 70、190 bp T鄄RFs 呈显
著负相关,与 156 bp T鄄RFs呈显著正相关.由于土壤
硝态氮含量、有机质含量、pH 值等理化指标的变化
在很大程度上与施肥及管理措施密切相关,因此,此
结果进一步说明土壤中反硝化细菌群落受耕作方式
和施肥的影响.
2郾 4摇 施肥对 nirK型反硝化细菌多样性指数的影响
根据所得 T鄄RFs 片段种类及百分比丰度,计算
和比较土壤样品中 nirK型反硝化细菌的 Shannon多
样性指数、Simpson 多样性指数、Margalef 物种丰富
度指数和均匀度指数.
从表 4 可以看出,同一土层不同施肥处理之间
多样性指数差异显著. 0 ~ 20 cm 土层中,nirK 型反
硝化细菌的 Shannon多样性指数、Simpson 多样性指
数、均匀度指数最大值均出现在 NPK 处理,分别为
1. 84、0. 81 和 0. 87;Margalef丰富度指数最大值出现
在 1 / 2 MNPK处理,为 1. 20.在 20 ~ 40 cm 土层中,
nirK型反硝化细菌的 Shannon 多样性指数、Simpson
多样性指数、均匀度指数最大值都出现在 MNPK 处
理,分别为 1. 72、0. 79 和 0. 87;Margalef 丰富度指数
最大值出现在 1 / 2 MNPK处理,为 1. 10.施肥种类和
施肥量均对 nirK 型反硝化细菌多样性指数产生
影响.
0 ~ 20 cm 和 20 ~ 40 cm 土层之间 nirK 型反硝
化细菌的多样性指数也存在一定差异,但不如施肥
处理间差异显著,说明在设施栽培条件下,nirK 型反
硝化细菌的多样性更易受施肥影响.
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表 4摇 不同处理土壤 nirK型反硝化细菌的多样性指数
Table 4摇 Diversity indices of nirK denitrifying bacteria in the different treatments
土层
Soil layer (cm)
处理
Treatment
Shannon指数
Shannon index
Simpson指数
Simpson index
Margalef指数
Margalef index
均匀度指数
Evenness index
0 ~ 20 CK 1. 69依0. 08ab 0. 77依0. 02ab 1. 00依0. 01a 0. 83依0. 01a
1 / 2 MNPK 1. 39依0. 07c 0. 59依0. 03d 1. 20依0. 00a 0. 63依0. 03c
MNPK 1. 65依0. 06b 0. 73依0. 02bc 1. 00依0. 05a 0. 81依0. 01a
M 1. 62依0. 05b 0. 70依0. 02c 1. 20依0. 00a 0. 74依0. 02b
NPK 1. 84依0. 03a 0. 81依0. 00a 1. 10依0. 05a 0. 87依0. 01a
20 ~ 40 CK 1. 38依0. 04b 0. 69依0. 02b 0. 75依0. 08b 0. 78依0. 03b
1 / 2 MNPK 1. 73依0. 14a 0. 76依0. 04a 1. 10依0. 08a 0. 82依0. 01ab
MNPK 1. 83依0. 04a 0. 81依0. 01a 1. 05依0. 00a 0. 88依0. 02a
M 1. 75依0. 09a 0. 78依0. 03a 1. 05依0. 08a 0. 84依0. 02ab
NPK 1. 72依0. 05a 0. 79依0. 00a 0. 95依0. 10ab 0. 87依0. 02a
2郾 5摇 nirK型反硝化细菌系统发育树的构建
本研究选取 CK、MNPK 处理的土壤样品构建
nirK基因的克隆文库,共选取 79 个阳性质粒测序
(CK 37 个,MNPK 42 个). 克隆序列用软件分析得
到的酶切片段与 T鄄RFLP 分析得到的片段长度和比
例相当,主要片段包括 36、61、70、109、137、156、
173、190、229、450 bp 这 10 种片段,其中,70、156、
190 bp 仍占主导地位,还出现了在 T鄄RFLP 分析中
没有的 36 和 229 bp 2 种片段,但每个片段仅有 1 条
序列,说明它们所占比例较小,或者其百分比含量太
低,所以无法在 T鄄RFLP 图谱上体现出来.将测得的
有效序列与已知的 nirK反硝化细菌进行比对,构建
系统发育树(图 3).
从图 3 可以看出,设施菜地土壤中的 nirK 型反
硝化细菌主要分成玉、域和芋等 3 个大类. 其中,玉
包括 a、b、c 等 3 个小分支;域包括 d 和 e 等 2 个小
分支;芋仅有 1 个分支. a 主要含有 61 bp 和大部分
的 156 bp这 2 种片段,它们与已知的根瘤菌属(Rhi鄄
zobium sp. )和土壤杆菌属(Agrobacterium sp. )反硝
化菌株的序列有很高的相似度. b 含有 61、173 和
190 bp 等 3 种片段,它们与已知的苍白杆菌属
(Ochrobactrum sp. )、假单胞杆菌属 ( Pseudomonas
sp. )和剑菌属(Ensifer sp. )反硝化菌株的 nirK 基因
有较近的亲缘关系. c 含有 156 bp 和未在 T鄄RFLP
中出现的 229 bp 片段,与已知的土壤杆菌属菌株具
有较高的相似性. 除此之外,玉大类中还含有 70 和
137 bp 这 2 种片段所属的反硝化细菌,它们与 a、b
和 c具有较远的亲缘关系,也与域类的反硝化细菌
明显不同. d 含有 36、70、137 和 156 bp,其中,36 和
137 bp为 d特有的片段长度,与已知的中慢生根瘤
菌属(Mesorhizobium sp. )亲缘关系相近. e 仅含有
70、190、450 bp片段,其中,450 bp为其特有片段,与
已知的亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas sp. ) TA 921i鄄
NH4 反硝化菌株和不可培养的细菌克隆 MW00011、
K30J48 亲缘关系相近. 域类的反硝化细菌的 nirK基
因序列均与红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp. )
序列的相似度低. 芋类只包括 70 bp 的片段,与已知
菌种假单胞菌属有较近的相似度. 由于反硝化功能
基因在不同微生物之间存在水平传递,所以反硝化
菌 nirK功能基因的系统发育学关系和 16S rRNA分
类对应关系很差[23],存在相同片段长度代表不同反
硝化菌和不同片段长度代表相同反硝化菌的情况.
根据本研究的结果,可以初步认为在大田、CK
和 NPK处理下,反硝化细菌以域类的 e 分支的 nirK
型反硝化细菌为主,约占总种类的 50%左右. 主要
包括 70 和 190 bp 2 个片段,且两者成竞争关系.而
在 1 / 2 MNPK、MNPK和 M处理下,反硝化细菌则以
玉类的 a分支的 nirK型反硝化细菌为主,约占总种
类的 30% ~ 60% ,主要包括 156 bp 的片段. 施肥可
以导致 nirK型反硝化细菌优势种群的改变,尤其是
施用有机肥可以促使 a 分支的 nirK 型反硝化细菌
逐步取代土壤中原有的 e 分支的 nirK 型反硝化细
菌而成为优势种群.大田与 CK、NPK 处理间虽然也
有一定的差异,但不及施有机肥的影响显著.
2郾 6摇 施肥对 nirK型反硝化细菌丰度的影响
由表 4 可以看出,施肥对 0 ~ 20 cm土层的 nirK
型反硝化细菌丰度有显著影响.不同处理相比较,最
小丰度出现在 CK 处理,仅为每克干土 1郾 06 伊107
个拷贝数;最大丰度出现在 M 处理,为每克干
土 2. 16伊107个拷贝数,是 CK 的 2郾 04 倍;其次为
1 / 2 MNPK处理,丰度达到每克干土 1. 74 伊107个拷
贝数,是CK的1 . 64倍;NPK处理的nirK型反硝化
015 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
图 3摇 采用 Neighbor鄄joining方法构建的 nirK基因部分序列(515 bp)的系统发育树
Fig. 3摇 Phylogenetic tree of denitrifying bacteria based on partial nirK sequences (515 bp) using neighbor鄄joining analysis.
每个克隆名称后面的数字表示酶切片段长度,括号中的数字表示相同片段的克隆数 The numbers after each clone names represented T鄄RFs, and
the numbers in the parentheses represented the number of clones with the same T鄄RF.
细菌丰度与 CK相当.在 20 ~40 cm土层中,nirK型反
硝化细菌丰度变化不大:最小丰度仍出现在 CK;但最
大丰度出现在 MNPK处理,为每克干土1. 11伊107个拷
贝数;次高丰度出现在 1 / 2 MNPK 处理,为每克干土
1郾 03伊107个拷贝数.比较不同处理还可发现,施用有
机肥比单施化肥更易促进土壤中 nirK型反硝化细菌
丰度的增加,在设施菜地中,施用有机肥处理的 nirK
型反硝化细菌丰度均高于单施化肥处理.
比较 2 个土层中 nirK 型反硝化细菌的丰度,
0 ~ 20 cm土层的丰度均显著(P<0. 01)高于 20 ~ 40
cm土层,且变化幅度比施肥处理间更大. 说明不同
土层由于土壤养分、水分及通气等状况的差异,导致
了 nirK型反硝化细菌丰度的变化.
3摇 讨摇 摇 论
设施栽培在我国蔬菜和其他重要经济作物的反
季节种植中起着十分重要的作用,近年来在全国各
地得到了大面积推广.设施菜地具有特殊的环境条
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图 4摇 不同施肥处理 nirK型反硝化细菌基因丰度的变化
Fig. 4摇 Changes of the nirk gene copy numbers in different fer鄄
tilizer treatments.
不同字母表示同一土层不同处理间差异显著(P<0. 05) Different let鄄
ters meant significant difference among treatments in the same soil layer at
0. 05 level.
件和耕作管理方式,如半封闭性结构、缺少雨水淋洗
等,大棚内的温度、湿度、通气状况和作物的水肥管
理措施均与大田有较大差别,因此,对土壤中参与元
素循环微生物的影响也明显不同于大田.本研究中,
设施菜地 0 ~ 20 cm土层中 nirK 型反硝化细菌片段
的种类虽不及大田丰富,但其丰度却远高于大田,且
优势种群及起重要作用的 nirK 型反硝化细菌也与
大田有明显的不同. 这可能是由于设施菜地的高养
分含量、高温环境对土壤中 nirK 型反硝化细菌产生
了驯化作用,使得适合在该环境条件下生存的反硝
化细菌的丰度增加,逐渐取代了数量较少且不适宜
在该环境下生存的反硝化细菌,从而成为优势种群
并发挥重要作用.
反硝化微生物广泛分布于系统发育进化阶段不
同的各种细菌和古菌中,共有 50 多个属,已发现的
具有反硝化能力的原核生物就有 130 多种[24],土
壤、沉积物及水体中都可以分离得到具有反硝化功
能的微生物.本研究中,除与大田中普遍存在的假单
胞菌属[25]亲缘相近的反硝化细菌外,在设施土壤中
还存在能在有氧条件下进行反硝化作用的好氧反硝
化细菌,它们分别与根瘤菌属、苍白杆菌属、土壤杆
菌属的反硝化细菌具有较近的亲缘关系.此外,还有
与剑菌属、中慢生根瘤菌属及亚硝化单胞菌属微生
物亲缘关系相近的反硝化细菌,但与已知的红假单
胞菌属微生物亲缘关系较远,说明设施菜地中反硝
化细菌种类丰富并与大田土壤具有一定差异.
不同基因型代表的反硝化菌种对施肥的反应不
同[26] .本研究选用对施肥处理较敏感的 nirK型反硝
化细菌展开研究,发现施肥可以显著影响土壤中
nirK型反硝化细菌的群落结构,尤其对 nirK 型反硝
化细菌优势种群影响更为显著,这与前人的研究结
论一致.如Wolsing和 Prieme[8]及 Chen等[27]均发现
nirK型反硝化细菌的群落结构在施用无机肥和有机
肥的土壤中变化规律显著不同. 施有机肥比单施化
肥更易促进土壤中 nirK型反硝化细菌丰度的增加,
0 ~ 20 cm土壤中最高达每克干土 2. 16伊107个拷贝
数,20 ~ 40 cm 土壤中最高达每克干土 1. 11伊107个
拷贝数,分别是 NPK 处理的 2. 02 和 1. 63 倍,说明
在设施菜地中,nirK 型反硝化细菌的数量更易受到
有机肥的影响.一般认为,有机质作为微生物的重要
碳源,是控制反硝化速率的重要因子之一,它对反硝
化细菌种群的影响有 3 个途径:1)直接提供碳源给
反硝化细菌并促进其生长;2)通过促进其他微生物
的生长,进而降低土壤中 O2的分压,创造有利于反
硝化进程的环境条件;3)提高了土壤的缓冲性能,
减少环境胁迫对反硝化细菌的抑制作用.
将反硝化细菌群落与环境因子进行冗余
(RDA)和相关性分析,发现除土壤有机质含量外,
土壤 pH值和硝态氮含量也是导致 nirK型反硝化细
菌群落结构和丰度差异的主要因素. pH值对反硝化
细菌具有选择效应[28],其变化可以影响反硝化细菌
的群落结构[29]并进而影响它们对环境变化的响
应[30] .有研究表明,pH值对反硝化细菌种群的影响
可以通过间接影响有机碳源的有效性来实现[31] .
Liu等[32]在 mRNA 水平上的研究表明,pH 值对反
硝化终产物比例的影响是一种转录后的调控现象.
硝酸盐作为反硝化反应的起始底物,是控制 nirK 型
反硝化细菌进行反硝化作用的重要因素,虽然本研
究中硝态氮含量与 nirK型反硝化细菌丰度相关,但
由于土壤中硝酸盐含量是硝化和反硝化作用的共同
结果,因而仅仅根据土壤中硝酸盐含量的高低来评
价反硝化微生物的数量和活性是不够的,必须结合
土壤性质以及其他土壤微生物的特性进行系统分
析.本研究中,土壤硝酸盐含量不是在施肥量最高的
处理中达到最大而是在 1 / 2 MNPK 处理,导致该现
象的原因可能是:1)前期对氨氧化细菌群落结构和
丰度的研究结果显示[16],设施土壤中氨氧化细菌在
1 / 2 MNPK 处理中丰度最高,说明此处理土壤中的
硝化作用较强烈,并因此产生了大量的硝酸根离子;
2)根据 katyal 等[33]的研究结果,当土壤 pH 值在
6郾 4 ~ 8. 3 时硝化作用最强,本研究中 1 / 2 MNPK 处
理的 pH值正好处于该范围,因此土壤中硝化作用
215 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
强、硝态氮含量也相应较高;3)部分 nirK 型反硝化
细菌没有发挥作用,反硝化作用较硝化作用弱,土壤
中硝态氮相对累积.实际上,尽管施用有机肥能促进
具有 nirK基因的反硝化细菌丰度升高,但只能说明
土壤中具有反硝化功能的微生物数量多,并不是所
有具有反硝化功能的微生物都能发挥作用,只有将
反硝化功能基因通过 mRNA 表达出来,才能真正执
行反硝化功能.此外,作物吸收及淋溶等作用,也是
导致土壤中硝酸盐含量变化的重要原因.
4摇 结摇 摇 论
本文采用 T鄄RFLP 和定量 PCR 结合的技术,系
统研究了设施菜地不同施肥处理、不同土层条件下
nirK 型反硝化细菌群落结构和丰度的变化.结果表
明:
1)设施菜地土壤中,除存在与假单胞菌属亲缘
相近的反硝化细菌外,还存在与好氧反硝化细菌亲
缘关系相近的微生物,如根瘤菌属、苍白杆菌属、土
壤杆菌属的反硝化细菌.
2)施肥处理和土层均对 nirK 型反硝化细菌的
群落结构产生显著影响. 70、156、190 bp所属的反硝
化细菌既是优势种群又对施肥处理和土层环境条件
的变化比较敏感,且与大田土壤中含量不同. 70 bp
在大田中最高,达 38. 9% ;156 bp以 1 / 2 MNPK有机
肥处理的土壤中最高,达 61. 9% ;190 bp则在 CK最
高,达 17. 0% . 说明设施菜地中起主要作用的 nirK
基因型反硝化细菌与大田显著不同.
3)施用有机肥比单施化肥更易促进 nirK 型反
硝化细菌丰度的增加,在 M 处理的 0 ~ 20 cm 土层
中最高,达每克干土 2. 16伊107拷贝数,是 NPK和 CK
处理的 2. 02 和 2. 04 倍.土层对 nirK 型反硝化细菌
丰度的影响大于施肥.
4)土壤 pH 值、有机质和硝酸盐含量显著影响
nirK型反硝化细菌群落结构和丰度.
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作者简介 摇 曾希柏,男,1965 年生,博士,研究员. 主要从事
退化及污染农田修复研究. E鄄mail: zengxibai@ caas. cn
责任编辑摇 肖摇 红
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