全 文 ：低温逆境对不同核桃品种抗氧化系统及
超微结构的影响∗
田景花１　 王红霞２　 张志华２∗∗　 高　 仪１
（ １河北农业大学园艺学院， 河北保定 ０７１００１； ２河北农业大学山区研究所， 河北保定 ０７１００１）
摘　 要　 为揭示核桃抗寒机理，确定核桃抗寒性鉴定适宜的生化指标，以展叶期抗寒性不同
的哈特雷、晋龙 １号和晋龙 ２号 ３个品种 １年生枝条的叶片为材料，测定了 １ ℃低温下抗氧化
酶活性及超氧阴离子（Ｏ２
－·）含量的变化，并采用透射电子显微镜观察低温逆境对抗寒性差异
大的哈特雷和晋龙 ２号叶肉细胞超微结构的影响．结果表明： 低温胁迫前后抗寒性强的哈特
雷叶片中超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）和过氧化物酶（ＰＯＤ）的活性最高，超氧阴离子含量最低，叶
肉细胞超微结构较稳定，叶片没有明显冷害症状．抗寒性差的晋龙 ２号随着低温胁迫时间的延
长，３种抗氧化酶活性的下降幅度最大，Ｏ２
－·含量始终处于高水平；胁迫 ７２ ｈ 时细胞叶绿体普
遍膨胀，基粒片层变薄，数目减少，部分叶绿体被膜及质膜清晰度下降，部分顶端小叶叶缘呈
水浸状，表现出冷害症状．可见，低温逆境下核桃叶肉细胞超微结构的稳定性与其品种的抗寒
性密切相关．ＳＯＤ、ＰＯＤ活性以及 Ｏ２
－·含量可作为展叶期核桃抗寒性鉴定的生化指标；低温胁
迫下核桃叶片细胞内膜系统的损伤与活性氧积累之间可能存在一定的相互关系．
关键词　 核桃； 低温逆境； 抗氧化酶； 超氧阴离子； 超微结构
∗河北省自然科学基金项目（Ｃ２０１００００７７３）资助．
∗∗通讯作者． Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｚｚｈ＠ ｈｅｂａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
２０１４⁃０７⁃３１收稿，２０１５⁃０３⁃０５接受．
文章编号　 １００１－９３３２（２０１５）０５－１３２０－０７　 中图分类号　 Ｓ６６４．１　 文献标识码　 Ａ
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｈｉｌｌｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｗａｌｎｕｔ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ． ＴＩＡＮ
Ｊｉｎｇ⁃ｈｕａ１， ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇ⁃ｘｉａ２， ＺＨＡＮＧ Ｚｈｉ⁃ｈｕａ２， ＧＡＯ Ｙｉ１ （ １Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ， Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１００１， Ｈｅｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ； ２Ｍｏｕｎｔａｉｎｏｕｓ Ａｒｅａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ａｇｒｉ⁃
ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ， Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１００１， Ｈｅｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ） ． ⁃Ｃｈｉｎ． Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｅｃｏｌ．， ２０１５， ２６
（５）： １３２０－１３２６．
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｒｅｖｅａｌ ｃｏｌｄ ｈａｒｄｉｎｅｓｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ａｓｃｅｒｔａｉｎ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｃｏｌｄ ｈａｒｄｉｎｅｓｓ ｂｉｏ⁃
ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｏｆ ｗａｌｎｕｔ （Ｊｕｇｌａｎｓ ｒｅｇｉａ）， ｔｈｒｅｅ ｗａｌｎｕｔ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ‘Ｈａｒｔｌｅｙ’， ‘Ｊｉｎｌｏｎｇ １’ ａｎｄ
‘Ｊｉｎｌｏｎｇ ２’ ｗｉｔｈ ｓｔｒｏｎｇ ｔｏ ｗｅａｋ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｃｈｉｌｌｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ， ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ
ｌｅａｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ （Ｏ２
－·） ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｏｎｅ ｙｅａｒ⁃ｏｌｄ ｂｒａｎｃｈｅｓ ｕｎｄｅｒ
ｃｈｉｌｌｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ ａｔ １ ℃ ｉｎ ｌｅａｆ⁃ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ． Ｔｈｅ ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ｃｅｌｌｓ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ‘Ｈａｒｔｌｅｙ’ ａｎｄ
‘Ｊｉｎｌｏｎｇ ２’ ｕｎｄｅｒ ｃｈｉｌｌｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ． Ｔｈｅ ｒｅ⁃
ｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ （ＳＯＤ） ａｎｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ （ＰＯＤ） ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｗｅｒｅ
ｔｈｅ ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ ａｎｄ Ｏ２
－· ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ ｉｎ ｃｈｉｌｌｉｎｇ⁃ｔｏｌｅｒａｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｒ ‘Ｈａｒｔｌｅｙ’ ｕｎｄｅｒ ｃｈｉｌｌｉｎｇ
ｓｔｒｅｓｓ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ． Ｔｈｅ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｓｔａｂｌｅ， ａｎｄ ｃｈｉｌｌｉｎｇ
ｉｎｊｕｒｙ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｏｂｓｅｒｖｅｄ． Ｉｎ ｃｈｉｌｌｉｎｇ⁃ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｕｌｔｉｖａｒ ‘ Ｊｉｎｌｏｎｇ ２’， ｔｈｅ
ＳＯＤ， ＰＯＤ ａｎｄ ｃａｔａｌａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ （ＣＡＴ） ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｈａｒｐｌｙ， ａｎｄ ｔｈｅ Ｏ２
－· ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ ｋｅｐｔ
ａｔ ａ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｕｎｄｅｒ ｃｈｉｌｌｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ． Ｔｈｅ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｉｎｊｕｒｅｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ
ａｔ １ ℃ ｆｏｒ ７２ ｈｏｕｒｓ． Ｍｏｓｔ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｓｗｏｌｌｅｎ， ａｎｄ ｇｒａｎａ ｌａｍｅｌｌａ ｂｅｃａｍｅ ｔｈｉｎｎｅｒ ａｎｄ ｆｅ⁃
ｗｅｒ． Ａ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｗｅｒｅ ｄａｍａｇｅｄ ａｎｄ ｂｅｃａｍｅ ｉｎｄｉｓｔｉｎｃｔ．
Ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ， ｔｈｅ ｅｄｇｅｓ ｏｆ ｓｏｍｅ ｏｆ ‘Ｊｉｎｌｏｎｇ ２’ ｙｏｕｎｇ ｌｅａｖｅｓ ｂｅｃａｍｅ ｗａｔｅｒ⁃ｓｏａｋｅｄ． Ｉｔ ｗａｓ ｃｏｎ⁃
ｃｌｕｄｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ｃｅｌｌｓ ｕｎｄｅｒ ｃｈｉｌｌｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ ｗａｓ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ
应 用 生 态 学 报　 ２０１５年 ５月　 第 ２６卷　 第 ５期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ， Ｍａｙ ２０１５， ２６（５）： １３２０－１３２６
ｗａｌｎｕｔ ｃｏｌｄ ｈａｒｄｉｎｅｓｓ． ＳＯＤ， ＰＯＤ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｏ２
－· ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｗａｌｎｕｔ ｌｅａｖｅｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ
ａｓ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｏｆ ｗａｌｎｕｔ ｃｏｌｄ ｈａｒｄｉｎｅｓｓ ｉｎ ｌｅａｆ⁃ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ． Ｔｈｅｒｅ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ａ ｃｏｒｒｅ⁃
ｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｄａｍａｇｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｃｈｉｌｌｉｎｇ
ｓｔｒｅｓｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｗａｌｎｕｔ； ｃｈｉｌｌｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ； ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ； ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ； ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．
　 　 核桃（Ｊｕｇｌａｎｓ ｒｅｇｉａ）属于喜温树种，春季萌动后
抗寒能力迅速下降［１］ ．近年来，由于晚霜引起的核桃
花芽、嫩梢、花器官和幼果等寒害时有发生，严重影
响了产量［２］，选用抗寒品种是防止核桃寒害最根本
和有效的措施．目前，有关休眠期及展叶期不同核桃
品种的抗寒性差异已有报道［３－４］，但有关核桃抗寒
机理方面的研究较少．
植物的抗氧化系统与其低温伤害密切相
关［５－７］，有关低温逆境下不同抗寒性核桃品种叶片
中抗氧化系统的活性变化缺乏研究．对蓝莓［８］、咖
啡［９］、苜蓿［１０］等植物的研究表明，抗寒性强的品种
抗氧化酶活性往往高于抗寒性弱的品种，随胁迫时
间延长，保护酶活性下降，抗寒性强的品种下降幅度
小．积累起来的活性氧能引发并加剧细胞膜脂过
氧化，从而造成膜系统损伤［７，１０］ ．超氧化物歧化酶
（ＳＯＤ）通常被看作是酶防御系统的核心酶，ＳＯＤ 活
性的高低可反映出植物对逆境的抵御能力，而过氧
化物酶（ＰＯＤ）和过氧化氢酶（ＣＡＴ）活性的变化与
低温逆境的相互关系有不同报道［１１－１３］ ．
研究表明，低温胁迫下抗寒性强的植物品种细
胞超微结构比不抗寒品种更稳定［１４－１５］ ．低温逆境对
植物最主要的负作用是造成严重的膜损伤［１６］，这也
是超氧阴离子（Ｏ２
－·）伤害植物的机理之一［６］ ．本研
究以展叶期抗寒性不同的核桃品种为材料，测定了
低温逆境下核桃叶片 ＳＯＤ、ＰＯＤ和 ＣＡＴ活性以及超
氧阴离子含量的变化，采用透射电子显微镜研究了
低温逆境下不同抗寒性核桃品种叶肉细胞的超微结
构变化，以期确定展叶期核桃抗寒力鉴定适宜的生
化指标，为揭示核桃的抗寒机理提供科学依据．
１　 材料与方法
１􀆰 １　 供试材料及低温处理
材料采自河北农业大学标本园，树势中庸，以展
叶期抗寒性差异明显的 ３个核桃品种的一年生枝叶
为试验材料，抗寒性从强到弱依次为哈特雷（Ｈａｒｔ⁃
ｌｅｙ）、晋龙 １ 号、晋龙 ２ 号．经电导法测定，３ 个品种
展叶期叶片的低温半致死温度分别为－７．３８、－２．１７
和－０．４０ ℃ ［３］ ．
在核桃展叶期（２０１２ 年 ４ 月 ２０—２３ 日）于每天
６：３０取样（胁迫 １２ ｈ的为前一天下午取样）．每处理
选取 ４个长势一致的 １ 年生生长枝，在智能人工气
候箱（宁波海曙赛福实验仪器厂）中水培，光照强度
４０００ ｌｘ，光照时间 １２ ｈ，５ ℃下预处理 ２ ｈ 后缓慢降
温至 １ ℃，进行低温处理，分别处理 １２、２４、４８ 和 ７２
ｈ后取样，以未经低温处理的材料作为对照．透射电
镜制样选用抗寒性差异大的哈特雷和晋龙 ２号 ２ 个
品种，低温处理后立即取材；同时，采集处理后的枝
条中部叶片，分装于塑料袋中密封，液氮速冻后存放
于－７０ ℃超低温冰箱中，用于各项生理指标的测定．
１􀆰 ２　 抗氧化酶活性及超氧阴离子含量的测定
称取 ０．４ ｇ（去主脉）超低温保存的核桃叶片，加
入预冷的 ０．０５ ｍｏｌ·Ｌ－１、ｐＨ ７．８ 的磷酸钠盐缓冲液
１ ｍＬ，在冰浴中研磨成匀浆，加入少量石英砂和 ３％
的不溶性吡咯烷酮（ＰＶＰ）．用磷酸钠盐缓冲液定容
到 ５ ｍＬ，于 ４ ℃、１００００ ｒ·ｍｉｎ－１下离心 ２０ ｍｉｎ，上清
液即为酶的粗提液，用于蛋白质、抗氧化酶活性以及
超氧阴离子含量的测定．
可溶性蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝 Ｇ⁃
２５０染色法［１７］；ＳＯＤ活性的测定采用 ＳＯＤ抑制氮蓝
四唑（ＮＢＴ）光化还原法，以抑制 ＮＢＴ光化还原 ５０％
为一个酶活性单位［１７］；ＰＯＤ活性的测定采用愈创木
酚显色法并略改动［１７］；ＣＡＴ 活性的测定采用碘量
法［１８］ ．超氧阴离子自由基含量的测定参照王爱国
等［１９］的方法，采用羟胺定量法．
１􀆰 ３　 核桃幼叶细胞超微结构的观察
参照田景花等［２０］的方法制备超薄切片．取各处
理枝条顶端的幼叶（直径约 １．５ ｃｍ），用预冷的蒸馏
水冲洗干净，滤纸吸干，用双面刀片从叶片中部中脉
两侧切取 ０．５ ｍｍ × １．０ ｍｍ大小的组织块．所用器具
用前要预冷，取样过程在冰浴上进行，将切好的组织
块迅速投入 ３％戊二醛固定液中，真空泵抽气 １５
ｍｉｎ，待大部分叶块下沉后，于 ４ ℃下固定 ４ ｈ；洗涤
后再用 １％锇酸于 ４ ℃下后固定 ３ ｈ．漂洗后常规系
列乙醇脱水，丙酮过渡，环氧树脂 Ｓｐｏｎ８１２ 渗透并包
埋．于 ３７、４５和 ６０ ℃下分别聚合 １２、１２和 ２４ ｈ．采用
ＬＫＢ⁃８８００型超薄切片机切片，２％醋酸双氧铀 ２５ ℃
１２３１５期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 田景花等： 低温逆境对不同核桃品种抗氧化系统及超微结构的影响　 　 　 　 　 　
下染色 ３０ ｍｉｎ，在 ＪＥＭ⁃１００ＳＸ型透射电子显微镜下
观察、拍照．
１􀆰 ４　 数据处理
采用 Ｅｘｃｅｌ ２００３软件对数据进行统计分析并作
图；采用 ＤＰＳ ７．０５ 软件进行相关性分析．透射电子
显微镜底片经扫描后用 ＡＣＤＳｅｅ ６．０软件处理．
２　 结果与分析
２􀆰 １　 低温逆境下一年生枝叶的冷害症状
各品种的一年生枝叶在低温处理 ４８ ｈ 前，均没
有明显的冷害症状；胁迫到 ７２ ｈ 时，抗寒性差的晋
龙 ２号枝条的部分顶端小叶的叶缘开始呈现水浸
状，之后变干，而哈特雷和晋龙 １ 号无明显的冷害
症状．
２􀆰 ２　 低温逆境下不同核桃品种叶片 ＳＯＤ、ＰＯＤ 和
ＣＡＴ活性的变化
由图１可以看出，低温处理前，３个品种叶片
图 １　 低温胁迫下不同核桃品种叶片 ＳＯＤ、ＰＯＤ和 ＣＡＴ活性
Ｆｉｇ．１　 ＳＯＤ， ＰＯＤ ａｎｄ ＣＡＴ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｗａｌｎｕｔ ｃｕｌｔｉ⁃
ｖａｒｓ ｕｎｄｅｒ ｃｈｉｌｌｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ．
Ⅰ： 哈特雷 Ｈａｒｔｌｅｙ； Ⅱ： 晋龙 ２号 Ｊｉｎｌｏｎｇ ２； Ⅲ： 晋龙 １号 Ｊｉｎｌｏｎｇ １．
下同 Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ．
ＳＯＤ活性存在较大差异，抗寒性强的哈特雷叶片
ＳＯＤ活性比抗寒性差的晋龙 ２ 号高 １７．５％，比晋龙
１号高 ５０．４％．表明在春季较低的环境温度下（尤其
是夜温），抗寒性强的哈特雷叶片 ＳＯＤ 清除活性氧
的能力最强．
低温逆境下，３ 个核桃品种叶片 ＳＯＤ 活性的变
化趋势基本一致，均表现为低温胁迫初期，酶活性迅
速上升，１２ ｈ时出现峰值，之后逐渐下降；２４ ｈ 后，３
个品种叶片 ＳＯＤ活性的变化均较平缓，其中抗寒性
强的哈特雷和晋龙 １ 号 ＳＯＤ 活性的下降速度均小
于抗寒性差的晋龙 ２ 号．哈特雷的 ＳＯＤ 活性始终在
３个品种中最高，晋龙 １ 号 ＳＯＤ 活性的下降幅度最
小，酶活性较稳定，到 ７２ ｈ时仍高于低温处理前，而
晋龙 ２号低温胁迫到 ２４ ｈ 时，酶活性已经降到了 ３
个品种中的最低值，并显著低于低温处理前，说明其
清除超氧化物的能力降低．
３个品种 ＰＯＤ 活性差异及低温处理后的变化
趋势与 ＳＯＤ 类似，低温处理前后 ３ 个品种 ＳＯＤ、
ＰＯＤ酶活性之间达到显著正相关．表明二者对低温
反应较一致，在清除核桃叶片活性氧过程中均发挥
着重要作用．３ 个品种叶片 ＰＯＤ 活性的变化趋势也
表明，较高的 ＰＯＤ 活性以及 ＰＯＤ 活性的相对稳定
对清除活性氧、提高核桃叶片的抗寒性都具有重要
作用．低温处理 １２ ｈ后晋龙 ２号叶片 ＰＯＤ活性迅速
下降，清除活性氧能力降低．
展叶期清晨不同抗寒性核桃品种叶片 ＣＡＴ 活
性存在很大差异，以抗寒性强的哈特雷叶片 ＣＡＴ 活
性最低，抗寒性差的晋龙 ２号叶片 ＣＡＴ活性最高．低
温逆境下，３个核桃品种叶片 ＣＡＴ 活性的变化趋势
略有差别．低温胁迫初期，抗寒性强的哈特雷叶片
ＣＡＴ活性逐渐上升，１２ ｈ 时出现峰值，之后缓慢下
降，７２ ｈ时酶活性与低温处理前差异不显著．抗寒性
较强的晋龙 １ 号 ＣＡＴ 活性在低温胁迫初期缓慢下
降，２４ ｈ后逐渐回升，７２ ｈ 时酶活性略低于低温处
理前，酶活性比较稳定．抗寒性差的晋龙 ２ 号叶片
ＣＡＴ活性在低温胁迫初期迅速下降，２４ ｈ 后回升，
但显著低于低温处理前，表明随着低温处理引起的
组织内 Ｈ２Ｏ２含量的增加，晋龙 ２ 号叶片 ＣＡＴ 的清
除能力反而下降，可能会造成活性氧产生与清除之
间的平衡被破坏．
２􀆰 ３　 低温逆境下不同核桃品种叶片超氧阴离子含
量的变化
从图 ２ 可以看出，展叶期清晨不同抗寒性核桃
品种叶片Ｏ２
－·含量存在显著差异，以抗寒性差的晋
２２３１ 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
图 ２　 低温胁迫下不同核桃品种叶片中超氧阴离子含量
Ｆｉｇ．２　 Ｏ２
－· ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｗａｌｎｕｔ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｕｎｄｅｒ ｃｈｉｌｌｉｎｇ
ｓｔｒｅｓｓ．
龙 ２号叶片 Ｏ２
－·含量最高，比抗寒性强的哈特雷叶
片高出 ８０．４％．３个品种叶片 Ｏ２
－·含量与其低温胁迫
前 ＣＡＴ活性大小呈正相关．
低温逆境下，哈特雷和晋龙 １ 号叶片 Ｏ２
－·含量
在低温处理初期明显上升，之后下降，到 ２４ ｈ 后又
逐渐升高；晋龙 ２ 号叶片 Ｏ２
－·含量在低温处理初期
随着 ＳＯＤ酶活性的上升略有下降，２４ ｈ 后又升高．
低温胁迫前后，抗寒性强的哈特雷叶片 Ｏ２
－·含量始
终最低，与其叶片 ＳＯＤ 的高活性一致．抗寒性差的
晋龙 ２号叶片 Ｏ２
－·含量始终维持在高水平，从而造
成细胞内膜系统的损伤．
２􀆰 ４　 低温逆境对不同抗寒性核桃品种幼叶细胞超
微结构的影响
由图 ３ 可以看出，展叶期核桃叶肉细胞具有较
大的液泡，液泡中有少量内含物；叶绿体靠近质膜分
布于细胞质中，叶绿体多呈梭形或长椭圆形，内部片
层丰富整齐，含有少量脂质球（嗜锇颗粒）；线粒体
数目较多；质膜及其他细胞内膜清晰完整，抗寒性不
同的哈特雷和晋龙 ２号幼叶细胞超微结构没有显著
差异．
核桃幼叶于 １ ℃下处理 １２ ｈ时，两品种细胞中
线粒体数目明显增多，部分大液泡被分割成多个小
液泡．低温处理 ２４ ｈ 时两品种细胞的超微结构与处
理 １２ ｈ时的差异不显著．低温处理 ４８ ｈ时，２个品种
的叶片没有明显冷害症状．此时超微结构显示，抗寒
性差的晋龙 ２号叶绿体膨胀，从梭形或长椭圆形向
圆形变化，基粒片层仍较整齐，但有的叶绿体中基粒
片层变薄，脂质球数目增多；抗寒性强的哈特雷细胞
中叶绿体没有明显变化．低温处理 ７２ ｈ 时，哈特雷
叶肉细胞的超微结构完整，与低温胁迫前相比，只是
线粒体数目增多，液泡分割，少数叶绿体变形，叶片
外观没有明显冷害症状．而抗寒性差的晋龙 ２ 号叶
绿体普遍膨胀变圆，部分叶绿体被膜和质膜的清晰
度下降，同时 １年生枝条的顶部小叶表现明显冷害
症状．此时，细胞中线粒体和细胞核的结构基本正
常，冷稳定性较强，表明叶绿体和质膜是细胞结构中
对低温最敏感的部位．
３　 讨　 　 论
３􀆰 １　 低温逆境下抗氧化系统与核桃抗寒性的关系
许多研究证实，细胞内膜系统的稳定性与植物
抗寒性呈正相关［７，２０］，在清除自由基、维护膜的稳定
性中，抗氧化酶系统起着重要作用，ＳＯＤ、ＰＯＤ、ＣＡＴ
是植物防止膜脂过氧化的酶促防御体系中重要的保
护酶，在低温逆境中所起的作用已得到证明［５－７］ ．超
氧阴离子伤害植物的机理之一在于参与启动膜脂过
氧化或膜脂脱酯作用，从而破坏膜结构．低温胁迫干
扰了植物细胞中活性氧产生与清除之间的平衡，活
性氧在细胞中积累使蛋白质氧化和生物膜膜脂受到
伤害，导致植物受损［５－６］ ．有研究表明，低温引起香蕉
和大蕉叶片 ＳＯＤ 活性的降低，但抗寒性强的大蕉
ＳＯＤ活性下降幅度比抗寒性弱的香蕉小［２１］ ．１５ ℃ ／
１５ ℃的昼 ／夜低温引起黄瓜叶片 ＣＡＴ 活性下降，但
抗寒性强的品种下降幅度小［７］ ．在 １１ ℃低温胁迫
下，烟草叶片中 ＳＯＤ、ＰＯＤ 活性，以及 Ｈ２Ｏ２和超氧
阴离子浓度均升高，抗寒性强的品种中 ＳＯＤ、ＰＯＤ
活性高于抗寒性差的，而 Ｈ２Ｏ２和超氧阴离子浓度小
于抗寒性差的［１４］ ．本研究表明，在 ３ 个核桃品种中，
抗寒性强的哈特雷叶片 ＳＯＤ、ＰＯＤ 活性始终最高，
超氧阴离子含量最低；抗寒性差的晋龙 ２ 号 ＳＯＤ 和
ＰＯＤ活性下降迅速，清除活性氧的能力降低，超氧
阴离子含量始终处于高水平，最终叶肉细胞中质膜
及叶绿体被膜清晰度下降，叶片表现出明显冷害症
状．表明低温逆境下稳定、较高的 ＳＯＤ、ＰＯＤ 活性在
清除核桃叶片活性氧过程中发挥着重要作用，二者
通过清除活性氧、防止膜质过氧化，降低了细胞内膜
系统的破坏程度，使哈特雷品种表现出较强抗寒性．
因此，ＳＯＤ、ＰＯＤ活性以及超氧阴离子含量均可作为
春季展叶期核桃叶片抗寒性鉴定的生理生化指标．
活性氧具有双重作用，一是加重细胞损伤，二是
发出信号以激活防御系统［２２］ ．Ｗａｎｇ 等［２３］利用外源
Ｈ２Ｏ２预处理沟叶结缕草（Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ），能显著提
高常温下 ＣＡＴ 等抗氧化酶的活性，随着低温胁迫，
Ｈ２Ｏ２预处理减轻了沟叶结缕草Ｈ２Ｏ２水平的上升，
３２３１５期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 田景花等： 低温逆境对不同核桃品种抗氧化系统及超微结构的影响　 　 　 　 　 　
图 ３　 ‘哈特雷’（Ａ）和‘晋龙 ２号’（Ｂ）核桃幼叶经 １ ℃低温处理 ０、１２、４８和 ７２ ｈ时的超微结构
Ｆｉｇ．３　 Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｗａｌｎｕｔ ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ‘Ｈａｒｔｌｅｙ’ （Ａ） ａｎｄ ‘Ｊｉｎｌｏｎｇ ２’ （Ｂ） ａｔ １ ℃ ｆｏｒ ０， １２， ４８ ａｎｄ ７２ ｈ．
Ｃｈ： 叶绿体 Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ； Ｎ： 细胞核 Ｎｕｃｌｅｕｓ； Ｐｍ： 质膜 Ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ； Ｖ： 液泡 Ｖａｃｕｏｌｅ； Ｍ： 线粒体 Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ； Ｃｐ： 细胞质 Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ． 箭
头指示叶绿体中的脂质球 Ａｒｒｏｗｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｓｏｍｅ ｌｉｐｉｄ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ．
提高了 ＣＡＴ等抗氧化酶的活性．表明 Ｈ２Ｏ２是一种信
号分子，能诱导抗氧化酶的产生，防止低温引起的氧
化损伤．本研究中，低温逆境下 ＣＡＴ 活性与核桃品
种的抗寒性没有直接关系，但抗寒性强的品种中
ＣＡＴ能保持较稳定的活性，从而行使其分解 Ｈ２Ｏ２的
功能，这与红松（Ｐｉｎｕｓ ｋｏｒａｉｅｎｓｉｓ） ［２４］的研究结果一
致．核桃展叶期清晨气温多在 １５ ℃以下，从 ３ 个核
桃品种叶片中超氧阴离子含量与其 ＣＡＴ 活性呈正
相关可以推测，核桃叶片中 ＣＡＴ活性可能与叶片中
活性氧的含量有关，即轻度低温或低温胁迫初期
ＣＡＴ活性主要受叶片 Ｈ２Ｏ２含量的诱导，但随着胁迫
时间延长，ＣＡＴ 活性受低温影响很大．核桃叶片中
ＣＡＴ活性与 Ｈ２Ｏ２和低温处理之间的关系需要进一
步研究．
３􀆰 ２　 低温胁迫下叶片超微结构变化与核桃抗寒性
的关系
本研究表明，展叶期核桃叶肉细胞一般具有较
大的液泡，液泡中有少量内含物．随着低温胁迫，液
泡分割，内含物增多．在黄瓜［２０］、樟树（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ
ｃａｍｐｈｏｒａ） ［２５］的叶片中也观察到这种现象．表明低温
胁迫下，液泡通过吞噬、分解内含物等形成具有渗透
性的化合物，提高渗透调节能力，达到避免低温伤害
４２３１ 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
的效果，这是细胞适应逆境的一种表现．
线粒体是氧化磷酸化、释放能量的场所，其数目
与细胞的生理功能及需求密切相关，一般需要能量
较多的细胞中线粒体数目也较多［２６］ ．本研究发现，
春季核桃叶肉细胞中有较多的线粒体，随着低温胁
迫，线粒体数目明显增多，从而为低温条件下细胞提
供更多的能量，以减轻低温伤害．在低温胁迫下，翠
南报春 （Ｐｒｉｍｕｌａ ｓｉｅｂｏｌｄａｉ） ［２７］、拟南芥 （ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ） ［２８］叶片中也观察到线粒体数目增多．这可
能是植物细胞对低温逆境的一种适应性变化．
有研究表明，叶绿体是低温伤害最早和最严重
的细胞器，而线粒体、细胞核等细胞器对低温的敏感
性差［１５，２９］，抗寒性强的品种中叶绿体等细胞器的冷
稳定性强于抗寒性差的品种［２５，３０］，本研究结果与此
一致．随着低温胁迫时间延长，抗寒性差的晋龙 ２ 号
细胞中叶绿体和质膜损伤明显．质膜和叶绿体被膜
是众多活性蛋白存在的部位，其受损必然引起细胞
代谢的紊乱，造成低温寒害．
超氧阴离子伤害植物的机理之一是参与启动膜
脂过氧化或膜脂脱酯作用，从而破坏膜结构［６］，脂
质球的积累是叶绿体类囊体膜受到伤害而降解产生
脂类物质的结果［３１－３２］ ．有研究表明，休眠季节抗寒
性较差的圆柏（Ｓａｂｉｎａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）叶绿体受到低温伤
害，脂质球数目增多，而祁连圆柏（Ｓ． ｐｒｚｅｗａｌｓｋｉｉ）类
囊体的结构受到影响较小，脂质球数目少［３０］ ．在低
温损伤的烟草叶绿体中也发现了脂质球数目增
多［１４］ ．本研究中，抗寒性差的晋龙 ２ 号在低温逆境
下始终存在较高的超氧阴离子浓度，可能造成了叶
绿体类囊体膜等细胞内膜系统的降解，随着低温持
续，晋龙 ２号叶绿体被膜和质膜的清晰度下降，叶绿
体中基粒片层变薄，同时出现较多的脂质球；而抗寒
性强的哈特雷叶片中超氧阴离子浓度低，叶绿体中
脂质球少，细胞内膜系统完整．这表明核桃细胞内膜
系统的完整性与超氧阴离子积累之间可能存在一定
的相互关系．
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国）， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｅｌｅｎｉｕｍ ｏｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ
ｕｌｔｒａ⁃ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｅｌｅｍｅｎｔ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｌｅａｖ⁃
ｅｓ ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｒｏｐｐｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ． Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ （应用生态学报）， ２００３， １４ （ ４）：
５７３－５７６ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）
作者简介　 田景花，女，１９６９年生，博士研究生． 主要从事园
艺作物抗寒生理研究． Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｙｙｔｊｈ＠ ｈｅｂａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
责任编辑　 孙　 菊
６２３１ 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷