全 文 ：真菌对土壤 N2O释放的贡献及其研究方法
*
黄摇 莹1,2 摇 龙锡恩2**
( 1浙江大学环境与资源学院, 杭州 310058; 2中国科学院城市环境研究所, 福建厦门 361021)
摘摇 要摇 N2O是一种重要的温室气体,而土壤作为 N2O的重要来源之一,其 N2O 主要产生于
硝化和反硝化作用的生物过程.研究表明细菌和古菌是这些生物过程的主要参与者,然而在
特定土壤生态系统中,真菌在 N循环过程中起主要作用.但真菌对土壤 N2O释放贡献的研究
报道甚少.本文阐述了土壤真菌 N2O产生机制的研究进展,介绍了自养硝化、异养硝化和反硝
化过程的发生机理、关键微生物和功能基因.详细介绍了与真菌有关的 N2O产生过程,真菌的
异养硝化作用和反硝化作用,并且比较了真菌和细菌反硝化系统的差异.此外,本文重点总结
了研究土壤真菌 N2O产生的主要方法,包括选择抑制剂法、15N标记、分离和纯培养以及免培
养的分子生态学方法,对各种方法的优势和弊端进行了探讨,并对今后的研究工作提出了
展望.
关键词摇 土壤真菌摇 N2O产生机制摇 N转化过程摇 N2O排放
文章编号摇 1001-9332(2014)04-1213-08摇 中图分类号摇 F301. 24; S154. 3摇 文献标识码摇 A
Contribution of fungi to soil nitrous oxide emission and their research methods: A review.
HUANG Ying1,2, LONG Xi鄄en2 ( 1College of Environmental and Resource Sciences, Zhejiang Univer鄄
sity, Hangzhou 310058, China; 2 Institute of Urban Environment, Chinese Academy of Sciences,
Xiamen 361021, Fujian, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. , 2014, 25(4): 1213-1220.
Abstract: Nitrous oxide is an important greenhouse gas. Soil is one major emission source of N2O,
which is a by鄄product of microorganisms鄄driven nitrification and denitrification processes. Extensive
research has demonstrated archaea and bacteria are the predominant contributors in nitrification and
denitrification. However, fungi may play a predominant role in the N transformation in a certain soil
ecosystem. The fungal contribution to N2O production has been rarely investigated. Here, we re鄄
viewed the mechanism of N2O production by soil fungi. The mechanisms of denitrification, auto鄄
trophic and heterotrophic nitrification and their key microbes and functional genes were described,
respectively. We discriminated the differences in denitrification between bacteria and fungi and dis鄄
cussed the methods being used to determine the contribution of fungi to soil N2O emission, inclu鄄
ding selective inhibitors, 15N stable isotope probing, isolation and pure culturing and uncultured
molecular detection methods. The existing problems and research prospects were also presented.
Key words: soil fungi; N2O production mechanism; N transformation processes; N2O emission.
*国家自然科学基金项目(31071869,31272256)资助.
**通讯作者. E鄄mail: xelong@ iue. ac. cn
2013鄄07鄄30 收稿,2014鄄01鄄17 接受.
摇 摇 N2O作为一种重要的温室气体,其增温潜势是
CO2 的 300 倍.它不仅参与光化学反应破坏臭氧层,
而且其温室效应是导致气候变暖的重要因素.此外,
它还是酸沉降过程中 HNO3的生成源,严重威胁人
类的健康和生存环境. 因此,掌握 N2O 产生机制可
为减少其释放提供理论基础,对缓解全球温室效应、
改善生态环境具有重大意义.
土壤是 N2O的重要来源,约占全球年均总量的
57% [1] .长期以来,人们普遍认为细菌参与的硝化
和反硝化过程是 N2O 的主要生物来源. 从 1970 年
至今,越来越多的研究发现非反硝化细菌、古菌以及
真核生物尤其是丝状真菌和酵母也能产生 N2O[2] .
然而,直到 1991 年人们发现尖孢镰刀菌(Fuarium
oxysporum)的 N2O产生机制,真菌产生 N2O 的能力
才逐渐被重视.最近,有研究表明,在特定土壤生态
系统中,真菌在 N循环过程(比如硝化作用)中扮演
重要角色[3-5] .由于发生反硝化作用的真菌类群比
较广泛,因此研究真菌对 N2O 释放的贡献意义重
应 用 生 态 学 报摇 2014 年 4 月摇 第 25 卷摇 第 4 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Apr. 2014, 25(4): 1213-1220
大.然而,土壤真菌 N2O 产生机制和对 N2O 释放贡
献方面的研究相对滞后. 本文综述了土壤真菌产生
N2O的机制,总结了真菌对土壤 N2O 排放贡献的研
究方法进展,提出以往研究中存在的问题和建议,旨
在进一步掌握与真菌有关的土壤 N素转化过程.
1摇 土壤 N2O产生的生物途径、关键微生物及其功
能基因
1郾 1摇 硝化作用
1郾 1郾 1 自养硝化摇 土壤 N2O释放主要来源于土壤氮
素生物转化过程(硝化和反硝化作用).硝化和反硝
化作用产生的 N2O占土壤释放总量的 70% .硝化作
用分两阶段进行,第一阶段是好氧微生物将氨氮或
有机氮氧化成 NH2OH,再进一步氧化成 NO2 -,主要
由氨氧化细菌或氨氧化古菌完成;第二阶段是 NO2 -
氧化为 NO3 -,由亚硝酸盐氧化菌完成. 整个过程中
N2O产生于氨氧化过程的中间产物比如 NH2OH 或
NO2 -的化学分解以及 NH2OH的不完全氧化也会产
生 N2O.硝化作用分为自养硝化作用和异养硝化作
用.传统的自养硝化作用是微生物将氨氧化为硝酸
盐,并从中获得能量的过程.这些能量被微生物用以
固定 CO2 和供自身细胞生长.作为硝化作用的限速
步骤,氨氧化过程一直被认为主要由氨氧化细菌
(ammonia鄄oxidizing bacteria, AOB)催化完成的. 针
对土壤 AOB的研究主要集中于 16S rRNA 和 amoA
两个目的基因. AOB 根据 16S rRNA 基因序列的系
统发育关系,分为变形菌纲 茁 亚群以及 酌 亚群的亚
硝化球菌属(Nitrosococcus) [6] .亚硝化单胞菌(Nitro鄄
somonas)和亚硝化螺菌属(Nitrosospira)两个属根据
不同环境中自然群落的 16S rRNA 序列至少可以分
成 7 个 Clusters(亚硝化螺菌属 clusters 1 ~ 4;亚硝化
单胞菌 clusters 5 ~ 7).其中土壤中以亚硝化螺菌属
clusters 2 ~ 4 为优势菌群[7] .然而,2005 年 K觟nneke
等[8]从海水中分离培养到第一株氨氧化古菌( am鄄
monia鄄oxidizing archaea, AOA),随后从海水到河口、
湖水、沉积物以及土壤中都发现了古菌的 amoA 和
16S rRNA基因[9-11],说明古菌的氨氧化过程在特定
环境中对净硝化作用贡献较大. AOA 主要由
Group1. 1a associated 和 Group1. 1b 两大类组成,其中
Group1. 1a associated 主要分布于酸性土壤, 其相对
丰度与土壤 pH 具有明显的负相关关系. Group1. 1b
则主要分布于中性及碱性土壤,与土壤 pH 有一定
正相关关系[12] . 氨单加氧酶( ammonia monooxygen鄄
ase, AMO)的 3 个结构基因 amoA、amoB和 amoC在
泉古菌门和变形菌门之间有一定的差异,变形菌门
的 amo簇具备保守的 amoCAB 操纵子序列,泉古菌
门的 amo簇基因序列变异较大[13] .对 AOA 和 AOB
的 amoA基因进行定量分析发现,在大多数土壤中
AOA 丰度要高于 AOB,但在特定环境如重金属污
染、植物群落结构以及高营养环境下 AOB 相对丰度
要高于 AOA[14-16] .
1郾 1郾 2 异养硝化摇 异养硝化作用底物可以是无机态
N也可以是有机态 N. 因此异养硝化作用定义为异
养微生物将还原态 N(包括有机态 N)氧化为亚硝酸
盐和硝酸盐的过程(图 1).
摇 摇 早在 19 世纪末和 20 世纪初,异养硝化现象就
在土壤的硝化过程中被发现,但有关这方面的报道
较少.这主要是因为硝化作用通常是通过测定其氧
化产物硝酸盐和亚硝酸盐来确定,异养硝化、好气反
硝化的同时存在导致异养硝化微生物硝化作用产物
(NO2 -和 NO3 -)积累量偏低.因此,人们一直认为自
然界的硝化过程基本上由自养硝化微生物完成,异
养硝化微生物在硝化过程中的作用较小.直到 20 世
纪中叶,Quastel 等[18]以丙酮酸肟作为选择性培养
基,采用连续灌注土柱的方法分离获得具有产生
NO2 -能力(不经过氨化)的异养菌株,异养硝化微生
物和异养硝化作用才重新引起研究者们的广泛关
注.与氨氧化细菌(AOB)不同,异养微生物对氨的
氧化获得的能量不能支持自身细胞生长. 异养微生
物的氨氧化过程包含两种生物化学机制:一种以异
养硝化细菌为主,它们持有的氨氧化酶和羟胺氧化
酶与自养硝化微生物非常相似,但由于异养细菌氧
化的底物很广,因此目前还不确定异养细菌中利用
图 1摇 土壤 N循环相关微生物过程[17]
Fig. 1摇 Microbiological processes in the nitrogen cycle[17] .
1)N固定 Nitrogen fixation; 2)自养和异养硝化 Autotrophic nitrification
and heterotrophic nitrification; 3)反硝化 Denitrifiction; 4)真菌协同反
硝化 Co鄄denitrification by fungi; 5)厌氧氨氧化 Anammox; 6)氨氧化
过程产 N2O N2O production during ammonia oxidation.
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氨单加氧酶氧化 NH3的过程是否为主要催化过
程[19] .一些异养微生物如脱氮副球菌(Paracoccus
denitrificans)可将硝化作用与好氧反硝化作用相结
合.这是由于脱氮副球菌的 AMO 是一种包含两个
亚单位的醌醇氧化酶. 这种硝化和反硝化作用相结
合的过程在有氧呼吸能力受限制时可通过消耗
NADH获取能量[20] . 另一种以真菌硝化为主. 虽然
耐酸的自养微生物也可以在酸性条件下进行硝化作
用,但通常认为酸性土壤(特别是酸性森林土壤)中
硝化作用的主要承担者是异养硝化微生物(一般认
为以真菌为主),尤其是耐酸性真菌的异养硝化过
程.目前研究发现,作为自养硝化微生物的 AOB 种
群数量和丰度在酸性土壤中普遍较低,AOB 的存在
与土壤的硝化活性无关或根本检测不到 AOB 的活
性,并且纯培养试验表明,在 pH <6. 5 的条件下,
AOB已停止生长[21] . 而氨氧化古菌(AOA)在酸性
土壤中丰度和种群多样性显著高于 AOB[22-24] . 因
此,真菌和 AOA都有可能在酸性土壤硝化作用中起
重要作用.
1郾 2摇 反硝化作用
反硝化作用定义为通过微生物反应将 NO3 -或
NO2 -异化还原为 N2O和 N2 的过程.一个世纪以来,
研究认为反硝化作用是由原核生物主导的反应,大
多数反硝化微生物是异养型的兼性厌氧细菌. 细菌
反硝化过程包含 4 个反应,分别由硝酸还原酶
(Nar)、亚硝酸还原酶 ( Nir)、NO 还原酶 ( Nor)和
N2O 还原酶 ( Nos) 催化完成. 1972 年 Bollag 和
Tung[25]在含氧低的培养基中发现土壤真菌尖孢镰
刀菌(Fusarium oxysporum)和腐皮镰刀菌(F. sola鄄
ni)还原 NO2 -并释放 N2O.随后 1992 年 Shoun 等[26]
发现,在真菌的子囊菌门和担子菌门中存在反硝化
活性,还发现了一直被误认为是严格好氧的尖孢镰
刀菌等多种真菌也能进行反硝化作用. Shoun[27]的
后续研究通过真菌纯培养阐明真菌反硝化的生物化
学机制和生理作用.在土壤中,反硝化真菌不仅参与
土壤反硝化作用,并且在好氧和厌氧环境下的 N2O
释放过程中扮演重要角色.除了细菌等原核微生物,
许多真核微生物也能在低氧或厌氧条件下利用复杂
的 ATP产能系统进行反硝化作用.如镰刀菌属(Fu鄄
sarium)、木霉属 ( Trichoderma)、柱孢属 ( Cylindro鄄
carpon)、毛壳属(Chaetonium)、水稻恶苗病属(Gib鄄
erella)、青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)及
其他半知菌类、丝状真菌、酵母菌等. 真菌反硝化需
要少量的 O2 供应,有氧呼吸产生 ATP 和反硝化过
程同时在线粒体中进行[28] .真菌的 Nar 酶蛋白与反
硝化细菌的 Nar 相似[29],Nir 酶蛋白中含 Cu,与细
菌的 NirK属于同源体[30] . 真菌与细菌反硝化系统
的主要差别在于真菌含有 P450nor(细胞色素 P450,
一氧化氮还原酶),利用 NADH或 NADPH作为直接
电子供体将 NO 还原为 N2O,在厌氧呼吸过程中该
系统主要位于线粒体中,并且它还原 NO 的速度是
细菌的 5 倍[31] . 另外,真菌反硝化系统缺乏氧化亚
氮还原酶(Nos),不能将 N2O 还原为 N2,最终产物
为 N2O.但可通过真菌协同反硝化作用产生 N2,即
N2 或 N2O是由胺和亚胺氮源中的氮元素与亚硝态
氮中的氮素结合产生的[32] .其中 P450nor 参与合成
且不需要电子供体,如 NADH[33] .虽有部分真菌(如
尖孢镰刀菌和赤霉菌等)可将 NO3 -或 NO2 -还原为
N2O,但大部分反硝化真菌只能将 NO2 -还原,这表
明 NO2 -可作为更有效的底物而被反硝化真菌利
用[26] .此外,在尖孢镰刀菌中发现了硝酸盐异化还
原为 NH4 +的过程,即真菌铵发酵过程.在该过程中,
NO3 -作为发酵过程的最终电子受体,与厌氧呼吸无
关,主要是为了在厌氧条件下支持真菌生长.这种存
在于细菌中的类似途径称为 NO3 -异化还原为铵的
过程 ( dissimilatory nitrate reduction to ammonium,
DNRA).与真菌不同,在细菌的 DNRA过程中,NO3 -
是呼吸过程的最终电子受体[34] . Hayatsu 等[35]认
为,真菌可以通过 3 个能量产生途径进行代谢,即有
氧呼吸(高浓度)、NO3 -呼吸(低浓度)和氨发酵(完
全厌氧),从而能在各种 O2 供应条件下生存. 除此
以外,N2O产生过程还包括硝化细菌反硝化作用,即
氨氧化细菌把氨氧化为亚硝酸根,然后将亚硝酸根
作为底物还原为 NO,最后还原为 N2O的过程,甚至
可能还原为 N2,但 N2O一般情况下是硝化反硝化过
程的终产物.硝酸盐异化还原为铵(DNRA),即 N2O
产生于 DNRA的亚硝酸根还原阶段,但该过程实际
对 N2O释放的贡献尚不确定.
已有研究发现,80 多个属的细菌和部分古菌、
真菌和放线菌都可能参与反硝化作用的全部或部分
反应步骤[12] . 反硝化微生物广泛分布于假单胞菌
(Pseudomonas)、芽孢杆菌(Bacillus)、硫杆菌(Thio鄄
bacillus)、 丙酸菌 ( Propionibacterium ) 等细菌种
属[36] .这些优势异养微生物为兼性厌氧微生物,在
低氧或厌氧条件下利用 NO3 -代替 O2 作为电子受
体.一些古菌如超嗜热菌(hyperthermophile Pyrobac鄄
ulum aerophilum)和嗜盐反硝化菌(halophile Halofer鄄
51214 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 黄摇 莹等: 真菌对土壤 N2O释放的贡献及其研究方法摇 摇 摇 摇 摇 摇
ax denitrificans)可以发生反硝化作用. 反硝化古菌
通过 NO3 -异化还原过程将 NO3 -还原为 NO2 -、NO、
N2O和 N2,这点和反硝化细菌有点儿类似. 生物化
学分析和基因序列数据表明,古菌和细菌反硝化酶
基因组织、结构以及酶调控方面存在差异[37] . 目前
国内外关于反硝化作用及其对 N2O 释放的贡献已
有大量研究,对不同土壤系统以及环境条件下参与
反硝化过程的关键功能基因 ( narG、 napA、 nirK、
nirS、norB、nosZ)的多样性及影响因素的研究也较深
入[38-39] .然而反硝化过程复杂、参与微生物繁多并
且多数微生物可能同时含有一种或多种功能基因.
以目前的分子生态学技术难以辨别与土壤反硝化作
用 N2O释放真正相关的功能微生物及基因.
2摇 研究真菌对土壤 N2O释放贡献的方法
在很多土壤生态系统中,真菌不但可以进行硝
化和反硝化作用,而且它的微生物生物量也占据优
势.在不同土壤生态系统中,真菌对土壤 N2O 释放
的贡献大小存在显著差异.一般认为,真菌硝化作用
主要发生在酸性森林土壤中,真菌反硝化主要发生
于森林土壤、草地土壤和半干旱区域.综合国内外研
究来看,真菌对土壤 N2O释放的贡献主要是通过确
定真菌和细菌在土壤硝化或反硝化作用中的相对贡
献.主要有以下几种方法:
2郾 1摇 选择性抑制剂
包括硝化抑制剂和生物抑制剂.由于硝化抑制
剂只能抑制自养硝化作用,因此常被用来区分自养
和异养硝化作用.最常见的硝化抑制剂为乙炔、双氰
胺(DCD)和 2鄄氯鄄6鄄三氯甲基吡啶(nitrapyrin)等.最
具代表性的生物抑制剂为放线菌酮,广泛应用于选
择性抑制参与土壤 N 转化过程(硝化和反硝化作
用)的真菌活性. 它可以抑制真核生物 60S 核糖体
亚单位的肽基转移酶活性. 用放线菌酮抑制真菌活
性可以为土壤中硝化作用是否以真菌为主导提供有
力证据[40-42] .另外一种常用生物抑制剂为链霉素,
它可以导致信使 RNA 的错误解读而抑制原核生物
蛋白合成,常被用于抑制细菌活性[43] . 由于放线菌
酮和链霉素的作用在于抑制蛋白合成,因此无法迅
速与微生物发生反应而导致抑制作用不完全,二者
不如乙炔在土壤中反应迅速. 针对真菌在土壤 N2O
释放机制的研究通常将硝化抑制剂和生物抑制剂结
合,首先通过添加硝化抑制剂或底物刺激来直接或
间接区分土壤中的自养和异养硝化,然后添加生物
抑制剂比如放线菌酮和链霉素,确定真菌和细菌对
N2O释放的相对贡献. 有研究者向土壤中添加不同
N源进行长期培养并测定底物对 NO3 -形成的影响,
结果发现添加有机氮可以刺激生成 NO3 -而添加
NH4 +却不能,说明 NO3 -是由异养硝化作用产生
的[44] .在 Schimel 等[41]的研究中 NO3 -的产生不受
C2H2 抑制,表明 NO3 -来源为异养硝化作用,而添加
生物抑制剂后 NO3 -的产生被放线菌酮抑制,表明土
壤中有部分 NO3 -是由真菌作用产生的. Castaldi 和
Smith[45]研究森林土和耕作土中放线菌酮对真菌反
硝化活性的影响,发现添加蛋白胨可以明显刺激森
林土 N2O释放,而低浓度(0. 5 ~ 2. 5 mg·g-1土)放
线菌酮可以迅速降低 N2O 释放量,表明在这种森林
土中,真菌是 N2O 释放的主要贡献者. Laughlin 和
Stevens[46]通过添加放线菌酮和链霉素测定草地土
壤真菌和细菌对 N2O排放的相对贡献,结果发现放
线菌酮和链霉素分别使 N2O 释放量降低 89% 和
23% .因此,他们认为真菌在草地土壤 N2O 释放过
程中起主导作用.随着对真菌 N 转化过程的深入研
究,人们逐渐将重点放在真菌对 N2O 的释放与环境
因素变化(比如施肥、土地利用改变、农业管理措
施)的响应机制上. Herold 等[47]通过添加放线菌酮
和链霉素研究 pH和耕作对细菌和真菌反硝化潜势
以及生物量的影响,结果发现,在供试土壤中,真菌
对反硝化潜势的贡献虽然显著,但仍低于细菌反硝
化潜势,真菌生物量不像细菌生物量那样随土壤 pH
和耕作作物的变化发生相应改变,真菌反硝化作用
在不同 pH梯度土壤中较稳定,因此耕作土壤反硝
化微生物对 N2O 释放的贡献研究必须考虑真菌的
反硝化作用. Marusenko 等[48]调查美国西南部城市
土壤和沙漠地带土壤 NO3 -和 N2O 的产生,通过添
加放线菌酮、链霉素和乙炔测定土壤硝化潜势以及
不同含水量的土壤 N2O释放,结果发现乙炔显著抑
制硝化潜势,证明氨氧化和 NO3 -产生过程中自养微
生物占主导而非异养微生物. 在高强度灌溉和施肥
的城市土壤中,真菌对 N2O 释放的贡献能力较弱.
但在不同含水量的沙漠和半干旱草地土壤中,真菌
是 N2O释放的主要贡献者. 因此他们得出结论,城
镇化土地利用改变了与 N 循环相关的生物途径,在
旱地土壤中真菌在反硝化过程中起主要作用.
2郾 2摇 15N稳定同位素
15N标记最初作为一种区分异养硝化和自养硝
化作用的方法,主要原理是向土壤中添加15N 标记
的 NH4 +后,硝酸盐库15N 的富集仅依赖于自养硝化
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作用. Pedersen等[49]将15N 技术与乙炔抑制相结合
研究酸性针叶林的硝化作用,发现乙炔迅速抑制
15N鄄NH4 +生成15N鄄NO3 - .因此得出结论:异养硝化微
生物的底物是有机 N 而不是 NH4 +,但是他们没有
分离出具体的异养硝化微生物. Laughlin 和 Ste鄄
vens[46]将15N气体通量法和底物诱导呼吸抑制法相
结合,发现供试土壤中存在真菌的协同反硝化作用,
来自15NO3 -的一个15N 原子与自然 N 源中的14N 原
子相结合,土壤释放的 N2 中15N 原子的分布揭示了
真菌协同反硝化和反硝化作用对 N2 的相对贡献.约
92%标记的 N2 来自于协同反硝化,只有 8%来自于
反硝化作用,表明在半干旱土壤中,真菌是推动 N
循环和 N2O 产生的重要成员. 随后,Laughlin 等[50]
继续用15N 通量法与生物抑制剂结合,发现在草地
土壤中硝化作用由真菌主导,并且真菌可以同时氧
化 NH4 +和有机 N.随着研究的深入,18O鄄15N 双同位
素标记法的建立能更加精确地区分真菌和细菌在
N2O释放中的相对贡献[51] .虽然该法对自然土壤环
境造成的干扰小、不需要任何抑制剂、不会改变微生
物活性,但其昂贵性以及对操作要求的精确性使得
该方法未能得到广泛应用.
2郾 3摇 真菌的分离和纯培养
虽然生物抑制剂和15N 示踪无论单独还是结合
运用都可以很好地揭示土壤中真菌在硝化作用和反
硝化作用以及 N2O 排放中的相对重要性. 然而,这
些研究方法都没有确定具体的真菌种类,无法确定
哪几种真菌可以产生 N2O,通过何种路径产生 N2O.
Lavrent爷ev 等[52]从厌氧培养的土壤中获得 19 个兼
性厌氧真菌菌株的纯培养,发现有 14 个菌株可以在
微氧含硝酸盐的培养基中产生 N2O. 其中尖孢镰刀
菌 11dn1 和腐皮镰刀菌 12 这两种真菌产生的 N2O
量最为显著,因此他们将这两种菌株接种到不同含
水量的灭菌土壤中,结果证明接种这两种菌株的土
壤 N2O释放量随土壤含水量增加而增大.并且含水
量较高时,微氧条件下的菌株 N2O 释放量高于厌氧
条件下的 N2O 释放量,添加 NO2 -比添加 NO3 -的
N2O释放量高. Jirout等[53]从耕地、草地和森林土中
分离出 36 个真菌物种,并且通过稀释平板法发现有
23 个物种可以产生 N2O. 这些物种属于镰孢菌属、
青霉菌属、明梭孢属、支顶孢属、赤霉菌属和假阿利
什菌属.虽然纯培养结合接种技术可以揭示土壤中
产生 N2O的具体真菌种类,但可供培养的真菌种属
有限,并且培养条件不一定适合所有的真菌物种,因
此试验技术仍需改进.
2郾 4摇 分子生态学方法
自然生态系统存在 150 万个真菌物种,目前发
现的仅占 5% ~ 10% . 主要原因在于可供培养的真
菌数量极少,传统的微生物学技术为土壤中真菌群
落的组成和动态变化提供的信息极其有限.以 DNA
为基础的方法不依赖于微生物培养,因此可以为研
究复杂的真菌群落结构提供方法支持. 分子生物学
技术近 20 年来普遍应用于表征真菌群落丰度和多
样性.这些分子技术主要有核糖体 DNA( rDNA)扩
增测序、rDNA 限制性分析、rDNA 的温度梯度凝胶
电泳(TGGE)和变形梯度凝胶电泳(DGGE)、末端限
制性片段长度多态性 ( terminal restriction fragment
length polymorphism, T鄄RFLP)、荧光定量 PCR 以及
焦磷酸测序等.针对真菌硝化和反硝化过程中功能
基因的分子研究手段比较少见,仅限于机理研究.小
亚基 18S rRNA基因、大亚基 28S rRNA 基因、rDNA
内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)和基
因间隔区( intergenic spacer, IGS)等核糖体基因复
合体最常用于真菌群落分析[54] .这些标记基因包含
高度保守区域和变异区域,只要引物设计合理,可以
对真菌群落从门到具体菌株进行精确分析[55-56] .
Smit等[57]设计多种 PCR 引物,即使在非真菌 18S
rDNA存在的情况下也可以对真菌 18S rDNA 序列
进行特异性扩增,将 PCR 扩增技术结合利用 TGGE
对小麦根际真菌群落进行分析. Bennett 等[58]用特
异性引物对扩增真菌 ITS区域然后做 T鄄RFLP分析,
比较森林土表层土壤真菌群落组成差异以及采样地
点与土壤性质的关系. Rousk 等[59]利用 qPCR 和焦
磷酸测序相结合测定长期施石灰处理对土壤细菌
16S rRNA和真菌 18S rRNA基因群落丰度和组成的
影响,结果发现真菌群落丰度和组成不受 pH 影响
或者影响很小,但是细菌群落丰度和多样性与土壤
pH呈正相关. 以上研究虽然通过 PCR 和一些分子
生态技术相结合的方法,极大提高了人们对真菌分
子生态方面的认知,并且揭示了之前一些未知微生
物的存在,但是真菌 18S rRNA 基因序列与其他真
核生物基因序列高度相似,因此同样的引物可能会
产生非特异性扩增. Smit等[57]证明引物对 EF4 / EF3
和 EF4 / fung5 只能扩增小麦根际土壤真菌 18S
rDNA序列,然而有研究发现同样的引物对还可以扩
增一些非真菌模板[60] . 因此,设计合理的引物对真
菌群落组成和结构的研究非常重要.
71214 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 黄摇 莹等: 真菌对土壤 N2O释放的贡献及其研究方法摇 摇 摇 摇 摇 摇
3摇 研究不足与展望
随着对 N循环过程的深入研究,细菌不再是唯
一的贡献者,越来越多的试验证明真菌不仅参与硝
化和反硝化作用并且在很多土壤生态系统中(比如
草地土壤、酸性森林土以及干旱半干旱区域土壤)
对 N2O释放起主要作用.真菌与细菌在土壤 N2O释
放的贡献方面的相对重要性已日益成为国内外的研
究热点.国外学者不断有通过生物抑制剂等各种方
法对反硝化真菌的培养筛选、机理以及基于基因水
平方面的报道.但是从已有的研究结果看,不同的研
究方法各有利弊.目前国内对真菌 N2O 排放方面的
研究很多还只停留在菌种的分离、纯化、生理生化特
性研究[61]、种群数量以及群落结构变化特征等基础
研究[62] .运用分子技术对真菌的 N2O 排放机理及
其在 N循环过程中的重要性研究相对较少.面向未
来的土壤真菌与 N素循环研究,应以新技术新方法
为手段,结合不同土壤生态系统的特性,重点开展以
下几方面研究:1)关于 AOA 和 AOB 在土壤硝化作
用中的相对贡献一直存在争议. 酸性森林土壤中硝
化作用主要以 AOA为主,然而研究显示添加有机氮
可以明显刺激硝化速率,添加无机氮时硝化速率不
受影响,说明此类酸性土壤中异养硝化作用占主导
地位.那么真菌是否参与其中? 贡献如何? 真菌与
AOA在硝化作用中的相对重要性如何尚不清楚.因
此,除进一步加强 AOA 和真菌的分离培养研究外,
需利用各种分子生物学手段,结合各种分析手段
(同位素示踪等),对真菌和 AOA 的多样性等开展
系统性研究,进一步认识两类微生物对硝化作用的
相对贡献和其他可能的生态功能. 2)对真菌反硝化
过程中参与 N2O释放的关键酶的代谢方式、特性以
及编码基因进行深入研究,尤其是与真菌硝化反硝
化作用相关的功能基因还缺乏分子水平的研究. 因
此迫切需要将纯培养与同位素示踪技术以及分子生
态学技术相结合,进一步揭示真菌在 N 循环中的重
要地位.对这些关键反应过程和关键微生物的认识
是制定有效氮素管理措施的重要前提. 3)由于产生
N2O的真菌类群广泛,但可培养的种类较少,因此可
将宏基因组技术、转录组学研究以及基因芯片等其
他研究手段相结合,深入了解真菌在各种土壤环境
中的基因表达及调控方式,为掌握真菌对土壤 N2O
产生贡献中的地位、真菌与细菌及其他微生物之间
以及真菌与周围环境的相互作用提供技术支撑.
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作者简介摇 黄摇 莹,女,1987 年生,博士研究生.主要从事茶
园土壤 N2O产生机制及微生物生态研究. E鄄mail: hybg0418
@ 126. com
责任编辑摇 肖摇 红
0221 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷