全 文 ：强化生物除磷系统主要微生物及其
代谢机理研究进展*
孙摇 雪摇 朱为静摇 王摇 亮摇 吴伟祥**
(浙江大学环境与资源学院, 杭州 310058)
摘摇 要摇 强化生物除磷(enhanced biological phosphorus removal,EBPR)工艺在废水除磷处理
中应用广泛.主要功能微生物及其代谢机理的研究是有效调控 EBPR工艺稳定运行与效能提
升的基础.本文选取 EBPR系统中最主要的两类微生物(聚磷菌和聚糖菌),从底物吸收机制、
糖酵解途径、TCA途径的贡献以及聚磷菌和聚糖菌的代谢相似性等方面对这些微生物的代谢
机理进行综述,评价了分子生物学技术在研究 EBPR系统微生物学及其代谢机理方面的应用
现状,在此基础上对 EBPR系统今后的研究方向进行了展望.
关键词摇 强化生物除磷摇 聚磷菌摇 聚糖菌摇 代谢机理
文章编号摇 1001-9332(2014)03-0892-11摇 中图分类号摇 X172, X52摇 文献标识码摇 A
Review on the main microorganisms and their metabolic mechanisms in enhanced biological
phosphorus removal (EBPR ) systems. SUN Xue, ZHU Wei鄄jing, WANG Liang, WU Wei鄄
xiang (College of Environmental and Resource Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058,
China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. , 2014, 25(3): 892-902.
Abstract: Enhanced biological phosphorus removal (EBPR) process is applied widely for removing
phosphorus from wastewater. Studies on functional microorganisms and their metabolic mechanisms
are fundamental to effective regulation for stable operation and performance improvement of EBPR
process. Two main types of microorganisms in EBPR systems, polyphosphate accumulating orga鄄
nisms (PAOs) and glycogen accumulating organisms (GAOs) were selected to summarize their
metabolic mechanisms such as substrate uptake mechanisms, glycogen degradation pathways, extent
of TCA cycle involvement and metabolic similarity between PAOs and GAOs. Application of mole鄄
cular biology techniques in microbiology and metabolic mechanisms involved in the EBPR system
was evaluated. Potential future research areas for the EBPR system and process optimization were
also proposed.
Key words: EBPR; PAOs; GAOs; metabolic mechanisms.
*公益性行业(农业)科研专项(201303091)和国家水体污染控制与
治理科技重大专项(2012ZX07101012 和 2008ZX07101鄄006)资助.
**通讯作者. E鄄mail: weixiang@ zju. edu. cn
2013鄄06鄄02 收稿,2013鄄12鄄19 接受.
摇 摇 含磷废水的大量排放是造成水体富营养化的重
要成因之一. 近年来,随着水体富营养化现象的加
剧,我国对废水排放的磷含量控制越来越重视,各类
污水排放标准中处理出水总磷浓度有逐年降低的趋
势.这一方面为我国水环境保护提供了有力保障,另
一方面也对污水除磷技术提出了更高的要求. 在污
水除磷处理工艺方面,强化生物除磷(enhanced bio鄄
logical phosphorus removal,EBPR)工艺通过厌氧段
和好氧段的交替运行,在活性污泥系统中能够富集
一类聚磷微生物,通过好氧段末端排泥达到污水除
磷的目的. EBPR 工艺具有处理费用低、可持续运行
等优点,在世界范围内被广泛接受并应用.
为了 EBPR工艺的稳定运行和除磷能力更加高
效,近 30 年来环境工程工作者都致力于 EBPR系统
微生物及其机理的研究与应用. 现代分子生物学技
术的迅速发展及其在环境工程微生物领域的应用促
进了人们对 EBPR系统内微生物机理方面的深入探
究.目前针对广泛存在于 EBPR 系统中的聚磷微生
物( polyphosphate accumulating organisms, PAOs)开
展的研究最多,但 EBPR系统环境复杂,微生物种类
多样,同时存在能够与 PAOs 竞争有机物的聚糖微
应 用 生 态 学 报摇 2014 年 3 月摇 第 25 卷摇 第 3 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Mar. 2014, 25(3): 892-902
生物(glycogen accumulating organisms,GAOs). 它们
与 PAOs在表观代谢特征上具有很多相似性,容易
引起除磷效率降低系统恶化. 目前关于这两类 EB鄄
PR系统最主要的微生物的研究在鉴定及代谢机理
方面尚存在部分争议.因此本文从 PAOs和 GAOs的
菌种鉴定、底物吸收机制、糖酵解途径、TCA 途径的
贡献以及 PAOs 与 GAOs 的代谢相似性等方面,对
EBPR系统主要微生物及其代谢机理的研究进展进
行总结与探讨,以期为 EBPR 工艺运行条件的优化
提供参考.
1摇 EBPR系统内的聚磷菌与聚糖菌
EBPR 系统是一个多种类型微生物混居的场
所,多年来世界各地的研究者对其中发挥重要作用
的微生物进行了不懈的探索. 随着现代分子生物学
技术的快速发展,人们对 EBPR 系统内主要功能微
生物种群及其特性研究取得了许多新的进展.
1郾 1摇 聚磷微生物
聚磷微生物(PAOs)也称聚磷菌,是指具有以下
代谢特征的微生物 (图 1 ) [1]:在厌氧 ( anaerobic
phase)条件下,细胞吸收挥发性脂肪酸(volatile fatty
acids,VFAs),并将其转化为胞内聚合物 PHA,同时
分解胞内的糖原(glycogen),水解原有的聚磷(poly鄄
P),产生的无机磷(Pi)被释放至胞外环境;在好氧
或缺氧(aerobic or anoxic phase)条件下,细胞将 O2
或硝态氮(亚硝态氮)作为最终电子受体,氧化胞内
储存的 PHA,产生 CO2和 H2O(或 N2)释放到胞外环
境,同时从外部环境吸收超过自身生理代谢需求量
的无机磷(即过量吸磷),在胞内重新合成聚磷和糖
原,通过这样的循环过程,细胞获得新物质和能量得
以生长并繁殖新细胞[2] . 这些代谢特征与 EBPR 系
统表现出的整体性质吻合,亦符合很多活性污泥微
生物典型代谢模型,例如 ASM2D、 TUD、UCTPHO
等[2] .研究发现,具有这种代谢特征的微生物由多
种特殊的微生物种群组成.
1郾 1郾 1 符合典型代谢模型的 PAOs 摇 1995 年 Bond
等[3]通过对比具有除磷功能和不具有除磷功能的
活性污泥微生物群落结构,采用 16S rRNA 克隆文
库技术分析,首次发现近似于 Betaproteobacteria 第
二亚纲的红环菌属(Rhodocyclus)的细菌在具有除磷
功能的活性污泥微生物数量上占据较大比例. 在具
有良好除磷性能的污泥中采用 FISH 技术结合化学
染色的方法观察该菌种在污泥中的分布情况,印证
了这一发现[4-5] . 这种细菌在系统发育地位上与红
环菌相近,两者最大的不同在于前者不进行光合作
用,Hesselmann 等[6]将其命名为“Candidatus Accu鄄
mulibacter phosphatis冶,常略写为 Accumulibacter. Ac鄄
cumulibacter是目前废水生物处理领域广泛认可的
PAOs,也是研究最多的一种 PAOs.
有研究者根据这种 PAOs 的特异性设计了几种
不同的 FISH探针(表 1),用于检测 PAOs在活性污泥
中的存在状况.相对于总细菌数量,Accumulibacter 在
许多实验室规模 EBPR系统内均能够达到很高的丰
度(55% ~ 95% ) [7] . 实验室规模富集的 Accumuli鄄
bacter表现出良好的除磷性能和 PAOs 的典型代谢
特征.鉴于污水处理厂内水源的水质类型差异较大,
受不同工艺运行条件和构筑物内复杂环境因素等影
响,在具有生物除磷能力的污水处理厂构筑物中
Accumulibacter占到总细菌数量的 4% ~ 22% [8-9] .
澳大利亚的研究人员通过调查 6 所 EBPR污水厂发
现,工艺的除磷效率和污泥中 Accumulibacter 所占
的数量比例呈正相关关系,并通过甲基蓝和苏丹黑
等化学染色法验证了 Accumulibacter 胞内聚磷和
PHA的循环过程,且除 Accumulibacter 外没有发现
其他的聚磷微生物[10] . Kong 等[11]通过 FISH鄄MAR
技术研究了丹麦的3座EBPR污水处理厂污泥中
图 1摇 PAOs细胞代谢机理[1]
Fig. 1摇 Metabolic metabolisms of PAOs cells[1] .
a)厌氧段 Anaerobic phase; b)好氧或缺氧段 Aerobic or anoxic phase.
3983 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 孙摇 雪等: 强化生物除磷系统主要微生物及其代谢机理研究进展摇 摇 摇 摇 摇 摇
表 1摇 EBPR系统中检测 PAOs、GAOs常用的 FISH探针
Table 1摇 Probes used for FISH detection of PAOs and GAOs involved in EBPR systems
探针
Probe
碱基序列 5爷鄄3爷
Sequence 5爷鄄3爷
特异性
Specifity
参考文献
Reference
PAO462 CCGTCATCTACWCAGGGTATTAAC Rhodocyclus tenuis 亚类 [5]
PAO651 CCCTCTGCCAAACTCCAG 多数 Accumulibacter [5]
PAO846 GTTAGCTACGGCACTAAAAGG Rhodocyclus tenuis 亚类 [5]
PAO462b CCGTCATCTRCWCAGGGTATTAAC 多数 Accumulibacter [8]
PAO846b GTTAGCTACGGYACTAAAAGG 多数 Accumulibacter [8]
Acc鄄I鄄444 CCCAAGCAATTTCTTCCCC Accumulibacter clade IA和其他 Type I clades [12]
Acc鄄II鄄444 CCCGTGCAATTTCTTCCCC Accumulibacter clade IIA, IIC, IID 和其他部分 Type II clades [12]
GB CGATCCTCTAGCCCACT Competibacter鄄GB 类的细菌 [13]
GB_G1 TTCCCCGGATGTCAAGGC 部分 Competibacter [13]
GB_G2 TTCCCCAGATGTCAAGGC 部分 Competibacter [13]
GB_1 ~ 2 GGCTGACTGACCCATCC 部分 Competibacter [13]
GB_2 GGCATCGCTGCCCTCGTT 部分 Competibacter [13]
GB_3 CCACTCAAGTCCAGCCGT 部分 Competibacter [13]
GB_4 GGCTCCTTGCGGCACCGT 部分 Competibacter [13]
GB_5 CTAGGCGCCGAAGCGCCC 部分 Competibacter [13]
GB_6 GGTTCCTTGCGGCACCTC 部分 Competibacter [13]
GB_7 CATCTCTGGACATTCCCC 部分 Competibacter [13]
GAOQ431 TCCCCGCCTAAAGGGCTT 部分 Competibacter [14]
GAOQ989 TTCCCCGGATGTCAAGGC 部分 Competibacter [14]
TFO_DF218 GAAGCCTTTGCCCCTCAG 与 Defluviicoccu相近的细菌 主要为 cluster 1 [15]
TFO_DF618 GCCTCACTTGTCTAACCG 与 Defluviicoccu相近的细菌 主要为 cluster 1 [15]
DF988 GATACGACGCCCATGTCAAGGG 与 Defluviicoccu相近的细菌 主要为 cluster 2 [16]
DF1020 CCGGCCGAACCGACTCCC 与 Defluviicoccu相近的细菌 主要为 cluster 2 [16]
Accumulibacter的代谢特征,结果发现均符合除磷生
化模型中对 PAOs代谢特征的描述与定义.
聚磷代谢是 PAOs 的关键代谢程序. 聚磷激酶
(polyphosphate kinase,PPK)被认为是聚磷合成过程
中最重要的酶. ppk 基因( ppk genes)被认为是编码
聚磷合成反应酶的功能基因,已有研究应用于大肠
杆菌 ( Escherichia coli )、 绿脓杆菌 ( Pseudomonas
aeruginosa)、脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)、
不动杆菌( Acinetobacter spp. )等菌种[17] . McMahon
等[18]首次将 PCR 和 mRNA 斑点杂交技术结合 ppk
基因及其表达产物应用于以 Accumulibacter 为主导
的 EBPR系统.相比于 16S rRNA片段,ppk基因在分
辨 Accumulibacter种群系统发育结构方面发挥的作
用更为显著.经 ppk1鄄PCR 扩增试验发现,Accumuli鄄
bacter由 Type玉和 Type域两个进化分支构成[19](常
用探针见表 1),其中每个分支至少包含 5 种子进化
分枝(Type玉包含玉A ~ 玉E,Type域包含域A ~ 域
G) [20] .影响 Accumulibacter种群多样性分布的关键
因素是菌种所在栖息地的环境特征,而非地理隔离
因素[20],因此环境条件对 Accumulibacter 不同菌株
的数量分布起着决定性作用.
1郾 1郾 2 反硝化聚磷菌摇 废水生物处理工艺过程中人
们希望借助同一菌种达到脱氮除磷双重功能. 在缺
氧环境中,部分 PAOs 能够利用硝态氮(或亚硝态
氮)作为最终电子受体氧化胞内储存的 PHA进行反
硝化吸磷等生命活动[11,21] . 由于电子受体不同,分
解等量的 PHA所释放的能量存在明显的差别,相比
以分子氧为电子受体的生化反应,以硝态氮为电子
受体的生化反应产生的能量为 70% ~ 80% ,磷酸盐
吸收量为 40% ~60% [22] .尽管反硝化除磷的产能效
率和吸磷效率较好氧除磷偏低,但反硝化聚磷菌
(denitrifying PAOs,DPAOs)能够将反硝化和吸磷两
个代谢过程同时进行,节省碳源和曝气量,且剩余污
泥产量低[23],DPAOs因此成为研究热点.
投加不同的电子受体,EBPR 系统内的微生物
群落结构就会产生显著性差异[24] .因此,有关 PAOs
和 DPAOs之间的分类关系一直存在争议.产生争议
的主要原因有 3 方面:1)对 PAOs 和 DPAOs 的定义
均从工程学的角度出发,对具有特定功能微生物的
界定,缺少从微生物学角度的考察与评估;2)早期
的研究手段较为有限,采用的试验方法多是从侧面
间接地反映 PAOs 的反硝化功能及其水平,缺少直
观的证据;3)EBPR系统内微生物组成复杂,应用不
同的研究方法可能会针对不同的目标微生物,当目
498 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
标微生物的系统发育地位尚不明确时,各研究者得
出的结论都指向工程学定义的 PAOs,从而各种研究
结论之间不可避免地会产生矛盾和分歧,因而难以
得出统一的观点.尽管现代分子生物学方法的运用
便于人们探知 PAOs 和 DPAOs 的种群数量变化,但
是仍然无法清晰辨别两者之间的从属地位及分类关
系,原因仍在于 PAOs 的微生物组成和系统发育体
系有待完善.
已有学者针对 Accumulibacter 开展了试验探
索. Kong等[11]采用 MAR鄄FISH技术观察到 Accumu鄄
libacter能够利用氧气、硝态氮和亚硝态氮 3 种电子
受体. Carvalho 等[25]首次观察到 Accumulibacter 种
群存在杆状和球状两种基本细胞形态. 杆状菌能够
直接利用硝态氮作为电子受体,球状菌不能利用硝
态氮,可能利用亚硝态氮作为电子受体.一些学者通
过富集试验染色观察结合相关生化数据和 FISH 分
析, 得到以下推论:Accumulibacter 种群具有不同程
度的反硝化功能,Type玉能够从硝氮的水平进行反
硝化,而 Type域能够从亚硝氮的水平进行反硝
化[12,26-27] . Mart侏n 等[28]从基因水平印证了 Type域A
不能够直接从硝氮水平进行反硝化,能够将亚硝态
氮转化为氮气,但不排除这种可能:EBPR 系统中存
在其他菌种能够将硝氮转化为亚硝氮,Accumuli鄄
bacter 利用积累的亚硝态氮进行反硝化. Accumuli鄄
bacter每一进化分支(包括子进化分支)的反硝化功
能仍有待通过 DNA 序列或功能基因的表达产物得
到确认.以上研究结果表明,反硝化功能及其利用的
电子受体种类能够作为鉴定菌种的标准之一.此外,
如 1. 1 中所述的 PAOs 定义实际上涵盖了 DPAOs,
DPAOs是属于 PAOs的一类,在概念上不应与 PAOs
并列.为了区分 PAOs的不同类型,有文献将仅能利
用氧气不能利用硝态氮和亚硝态氮的 PAOs 称为
non鄄PAOs[29],或根据利用电子受体的不同,将
DPAOs细分为 PO、PON和 PONn [30] .这种根据 PAOs 的
反硝化功能特点加以区分的称呼更为严谨.
1郾 2摇 聚糖微生物
聚糖微生物 ( glycogen accumulating organisms,
GAOs),也称聚糖菌,易存在于除磷效果恶化的 EB鄄
PR系统中,其代谢特征与 PAOs 类似,也具有厌氧 /
好氧的循环,但两者存在明显差异:GAOs 缺少释
磷 /吸磷的循环过程,不具备除磷能力,但 GAOs 亦
是将 VFAs作为主要碳源,因此能够在工艺的厌氧
段与 PAOs 产生竞争[31] . GAOs 的定义除了建立在
其代谢特征基础上,还需能够与 PAOs参与竞争.
目前研究最为广泛的 GAOs 是 “ Candidatus
Competibacter phosphatis冶和一种发育地位与 Defluvi鄄
icoccus vanus 相近的细菌 (包括 Defluviicoccus va鄄
nus),检测这两类 GAOs的常用探针在表 1 中列出.
在正常的污水处理厂规模的 EBPR系统中数量最多
时能够分别占总细菌数量的 12%和 9% [10,32],在由
GAOs占据竞争优势的 EBPR系统内,所占比例会相
应增加,但两种微生物各自的数量比例不等. “Can鄄
didatus Competibacter phosphatis 冶 [13-14] 常缩略为
Competibacter,属于 Gammaproteobacteria 纲[33],包括
至少 7 个不同的进化分支 GB1 ~ GB7[13] . 其中,
GB1、GB4 和 GB5 仅能从硝态氮水平进行反硝化,
GB6 能够利用硝态氮和亚硝态氮,而 GB3 和 GB7 不
具有反硝化功能[32,34] .与 Defluviicoccus vanus相近的
细菌常略写为 Defluviicoccus[32],属于 Alphapro鄄
teobacteria纲[15],由 Cluster玉 ~ Cluster 郁 4 个进化
分支组成.其中 Cluster玉能够从硝态氮的水平进行
反硝化,而 Cluster 域不具备反硝化功能[35],Cluster
芋和 Cluster 郁的反硝化功能尚未见报道. Competi鄄
bacter 和 Defluviicoccus之间的区别在于两者对不同
的碳源具有不同程度的亲和性,Competibacter 吸收
乙酸的速率较快,Defluviicoccus 对丙酸的吸收速率
更快[36],因此采用乙酸 /丙酸交替作为碳源有利于
PAOs在种群竞争中取得优势[37] .
2摇 EBPR系统主要微生物代谢机理
废水生物除磷工艺实质上是生物反应过程,
PAOs是除磷生物反应的主体.细胞内的代谢途径和
生化反应构成了分子尺度上的生物除磷工艺. 因此
PAOs的代谢机理一直是废水生物处理领域的研究
重点.
2郾 1摇 底物吸收机制
生物反应是酶促反应,绝大多数酶位于细胞内,
营养物质只有进入细胞才能参与代谢. 细胞内电子
传递的结果是在细胞内积累 OH-,在细胞外积累
H+,由此产生跨膜 pH梯度和跨膜电位,形成质子运
动势( proton motive force,PMF),使膜处于蓄能的
状态.
Mino等[38]在 1987 年首先提出 PAOs 通过主动
运输的方式吸收乙酸,所需能量来自聚磷水解. 1994
年 Smolders 等[39]提出假设:在偏碱性的环境中,
PAOs吸收乙酸需要消耗更多的能量;当 pH 升高
时,乙酸的吸收速率可能会下降. 然而,试验结果却
显示 pH值的改变没有影响 PAOs的乙酸吸收速
5983 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 孙摇 雪等: 强化生物除磷系统主要微生物及其代谢机理研究进展摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 2摇 PAOs(a)和 GAOs(b)的底物吸收机制
Fig. 2摇 Substrate uptake mechanisms in PAOs (a) and GAOs (b) [42-43] .
率[40],释磷速率却随着 pH 值的上升有所增加.
Smolders等[39]推测释磷过程帮助 PAOs 维持了细胞
内 pH和 PMF的平衡,即当外界 pH升高时,更多的
聚磷被水解,产生更多的能量用来维持细胞膜上的
PMF,从而保证了细胞吸收乙酸的速率不受 pH 改
变的影响. 2001 年 Filipe等[40]通过研究 pH对 PAOs
和 GAOs的影响发现,当厌氧条件下 pH 增加时,与
GAOs大量消耗糖原相比,吸收 VFAs 引起 PAOs 释
放更多的磷,但是并不影响糖原的消耗量.在此基础
上相继有学者采用选择性抑制剂(CCCP、DCCD、缬
氨霉素和尼日利亚菌素等)对 Accumulibacter、Com鄄
petibacter 和 Defluviicoccus 的底物吸收机制(图 2)
开展试验研究.结果发现主动运输需要透酶和代谢
能,乙酸透酶 ( ActP)是参与乙酸吸收过程的透
酶[41] . Accumulibacter 和 Competibacter 吸收乙酸的
过程均是由 PMF推动的,而产生 PMF 的来源,两者
存在差异:Accumulibacter水解聚磷后通过专门的运
输系统 Pit释放无机磷(Pi)产生 PMF(图 2a);Com鄄
petibacter则是通过 F 型 ATP 酶催化 ATP 分解同时
向胞外输出质子产生 PMF(图 2b),所需 ATP 来自
于糖酵解和还原性三羧酸循环(reductive TCA)两个
过程中的底物水平磷酸化[42] .
摇 摇 Accumulibacter细胞膜上运输无机磷的专门系
统包含两种:Pit 和 Pst. Pit 对 Pi 的亲和性较低,Pst
对 Pi的亲和性较高[28] . 两套亲和程度不同的运输
系统是 PAOs自身调节吸磷能力的一种体现. 如图
2a,厌氧条件下 Pit 系统同向输出质子和无机磷,产
生 PMF用于乙酸吸收,通过 F 型 ATP 酶进行质子
输入生成 ATP保存能量[43];在好氧段初始,外界无
机磷浓度高,PAOs 通过 Pit 系统吸收磷,在好氧段
末尾,外界无机磷浓度降低,PAOs 通过 Pst 系统吸
收磷[28] . Competibacter 和 Defluviicoccus 吸收乙酸)
由延胡索酸还原酶 ( fumarate reductase, 图 2b 中
F鄄Rase)系统产生 PMF,乙酸透酶同向输入乙酸和质
子 / Na+,V 型 ATP 酶输入质子 / Na+同时催化合成
ATP储存能量. Competibacter 通过 F 型 ATP 酶催化
ATP分解同时向胞外输出质子,而 Defluviicoccus 通
过甲基丙二酰辅酶 A(Methyl鄄malonvl鄄CoA decarbo鄄
xylase,图 2b 中 M鄄M鄄CoA鄄Dase ) 脱碳产生钠电
位[43] . Accumulibacter用于乙酸吸收的 PMF 通过质
子和无机磷输出产生,Competibacter 则通过 F 型
ATP酶和延胡索酸还原酶的联合反应向胞外输出质
子产生 PMF,而 Defluviicoccus 的 PMF 产生除了来
自延胡索酸还原酶在细胞膜上的质子输出过程,还
来自甲基丙二酰辅酶 A 脱碳反应中的钠离子排出
过程.相比 GAOs依赖质子输出和钠电位产生 PMF,
PAOs利用专门的无机磷运输系统,能够在一定程度
上抵抗或缓解外界环境变化(例如 pH值改变)带来
的冲击,因此在有限范围内适当提高 pH 值将有助
于 PAOs在 EBPR系统中占据竞争优势.
2郾 2摇 糖酵解途径
糖原( glycogen)是 PAOs 和 GAOs 细胞内最主
要的储能物质之一.糖原的代谢是 PAOs和 GAOs细
胞内重要的物质和能量代谢过程. 糖原的无氧分解
代谢又称糖酵解(glycolysis),是 EBPR 系统微生物
厌氧代谢机理的研究重点. 目前在废水生物除磷领
域内关于糖酵解途径存在两种观点:EMP途径(Em鄄
bden鄄Meyerhof鄄Parnas pathway)和 ED 途径( Entner鄄
Doudoroff pathway).两种途径产生还原力 NADH 的
能力相当,但从产能效率言,ED途径只有 EMP途径
698 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
的 2 / 3[44] .
Mino等[38]提出 PAOs 在厌氧条件下通过 EMP
途径将糖原转化为丙酮酸的代谢模型. 基于13 C 标
记的 NMR技术试验结果结合化学计量学显示 ED
途径是主要的糖原降解途径[44-45] . Erdal[46]在不同
运行温度(5 和 20 益)的 EBPR 系统中均检测到了
EMP途径的关键酶———磷酸果糖激酶,没有检测出
葡萄糖鄄6鄄磷酸脱氢酶,这种酶是 ED 途径和戊糖磷
酸途径共有的酶.宏基因组分析技术发现 Accumuli鄄
bacter Type域A 包含 EMP 途径所有的基因信息,而
并未发现 ED途径相关的基因信息[28],这表明至少
Accumulibacter Type域A 分支的 PAOs 只能够利用
EMP途径进行糖原分解代谢. Wexler 等[47]采用基
于蛋白质组学和放射性标记的分析方法发现,EMP
途径相关酶在 20 益以 Type玉以及 Type玉和 Type域
A ~ D Accumulibacter 为主的两个 SBR 反应器污泥
中都存在. 这些看似矛盾的结果反映出 Accumuli鄄
bacter 不同菌株之间可能存在代谢能力差异,也可
能一些菌株具备采用两种途径代谢能力.
由于糖原是 GAOs 的唯一能源,糖原的降解途
径对 GAOs的新陈代谢产生更加深远的影响. Filipe
等[48]提出 Competibacter 经过 EMP 途径分解糖原,
因为 ED途径中的葡萄糖鄄6鄄磷酸脱氢酶在 Competi鄄
bacter 的富集培养物中没有显示活性. 然而 Lemos
等[49]采用13C标记的乙酸进行 NMR分析试验,发现
Competibacter和 Defluviicoccus 的混合富集培养物
通过 ED途径降解糖原. 目前 GAOs 的乙酸或丙酸
代谢模型多数是基于 EMP 途径[31,48,50] . GAOs 厌氧
代谢的糖原降解率与 PHA生成率通常与 EMP 代谢
模型的理论预测值保持一致[36,51] . 然而, Lopez鄄
Vazquez等[52]发现,Competibacter 富集物在厌氧条
件下存在更高的糖原利用率和 PHA生成率,这些代
谢特征符合 ED 代谢模型. 值得注意的是,Lemos 试
验和 Lopez鄄Vazquez 试验均是在 30 益进行的,也许
温度能够解释这些研究结果的差异:1)GAOs 同时
拥有 EMP和 ED的代谢能力,它们依赖温度调控糖
原分解途径;2)Competibacter 或 Defluviicoccus 的每
一进化分支只能利用 EMP 或 ED 单一途径,而温度
可以影响不同进化分支的种群数量,对不同的
GAOs菌株具有一定的选择性[53] . Bengtsson 等[54-55]
在 30 益条件下对 Competibacter 富集物进行试验观
察,其结果更接近 EMP 代谢模型的预测,且 Bengts鄄
son试验条件类似于 Lopez鄄Vazquez 试验. 这个结果
支持了第二种假设,至少部分 Competibacter 的菌株
具有 EMP或 ED的选择性.
这个依赖温度的选择性模型切换还可以用来解
释在高温条件下 GAOs 比 PAOs 更具备竞争优势的
现象.但以上推测引出另一个问题,即在高温环境
中,产能效率较低的 GAOs 菌株如何能够占据竞争
优势.一种解释是利用 ED 途径的 GAOs 能够将细
胞内 PHA 的厌氧储存量最大化,而 PHA 是好氧段
或缺氧段唯一的碳源和能源,这意味着在接下来的
好氧段这类 GAOs菌株的生物量和糖原生成量以最
大幅度增加[53] .由于 GAOs 类似于其他的化能异养
型细菌,趋向于在较高温度下显示出更高的增长率,
这类 GAOs在厌氧时最大化乙酸吸收率并在好氧时
最大化繁殖增长率很可能是一种竞争优势. 因此选
择较低的温度运行 EBPR 工艺将会有利于 PAOs 在
同 GAOs竞争中取得优势地位.然而,以上假设是否
真正成立需要进一步深入研究予以确定.
2郾 3摇 TCA途径的贡献
如前所述,糖酵解不仅提供 ATP 还能为电子传
递链提供 NADH.因此糖酵解是厌氧阶段电子传递
链上还原力的来源这一观点已被广泛接受[56] .然而
近年来一些试验发现三羧酸循环(TCA)参与提供还
原力. Zhou 等[57]发现,当糖原含量有限时,以 Accu鄄
mulibacter为主的富集物能够水解更多的聚磷来满
足 ATP的需求量;当糖原完全消耗时,TCA 用来作
为还原力的唯一来源,这个过程的化学计量学符合
Comeau鄄Wentzel模型[58-59] . Mino 等[38]指出,当糖原
含量不是限制因子时,TCA 循环不提供还原力. 然
而,Zhou等[57]估算出即使在没有糖原限制的条件
下,TCA仍贡献出大约 25%的 NADH. 这一结果与
Pereira 等[60] 的修正模型吻合. Schuler 和 Jen鄄
kins[61-62]从文献研究中分析厌氧化学计量学时也注
意到仅依赖糖酵解并不能够满足厌氧段 NADH 的
需求量. 通过质谱技术蛋白质组学研究,Wexler
等[47]发现 Accumulibacter Type玉的富集物在厌氧段
缺少 TCA活性,然而另一种 Accumulibacter Type玉
和 Type域A ~ D的混合富集物却显示出 TCA 活性.
这个结果表明,至少一些 Accumulibacter Type域菌
株能够在厌氧段通过 TCA途径产生还原力,这种代
谢能力可以为这些菌株提供比 Type玉更大的竞争
优势,特别是在糖原含量有限的情况下. 此外,TCA
的分支途径也参与了 GAOs 的代谢过程. Lemos
等[49]发现在 Competibacter 和 Defluviicoccus 混合培
养物中 TCA途径参与厌氧段 NADH的生成.可以推
测,即使在不包含 GAOs 的 PAOs 系统中,关于还原
7983 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 孙摇 雪等: 强化生物除磷系统主要微生物及其代谢机理研究进展摇 摇 摇 摇 摇 摇
力的来源,一些 PAOs菌株可能主要依赖糖原代谢,
另一些 PAOs菌株更多地依赖 TCA 循环. 具体依赖
哪种代谢途径则取决于细胞个体水平上储存的糖原
含量.未来的研究工作应当阐明这个生化机制,并考
虑 TCA循环在 PAOs和 GAOs细胞内的活性.
2郾 4摇 PAOs和 GAOs的代谢相似性
尽管 GAOs常出现在除磷效果恶化的 EBPR 系
统中,但并不能就此说明 EBPR 系统的除磷效率大
幅降低的原因是 GAOs 取代 PAOs 成为优势种群的
结果. Schuler和 Jenkins[61]曾提出假设:在特殊条件
下,以 PAOs为主的富集培养物会呈现 GAOs的代谢
模式. 一些学者针对这一疑问进行了试验研究. Er鄄
dal等[63]通过批次试验发现,糖原不仅能够作为合
成 PHA过程中电子传递链上还原力的来源,而且当
PAOs细胞内的聚磷大量消耗时,糖原可以作为一种
“应急能源冶,特别是在温度高于 20 益的条件下.由
此推测,当 EBPR系统在较高温度的环境中运行时,
PAOs倾向于采用代谢糖原的途径来进行生命活动,
PAOs细胞内将储存更多的糖原,同时减少无机磷的
吸收量,EBPR系统的除磷效率因此大幅下降. Zhou
等[64]采用逸80%的 Accumulibacter富集培养物在聚
磷含量有限时监测厌氧条件下 PAOs 的乙酸利用情
况,观察到当 PAOs 不再释磷时依然继续吸收乙酸
合成 PHB和 PHV,糖原的分解成为该阶段细胞代谢
的主要能量来源,并且化学计量学分析发现 PAOs
的乙酸吸收量、PHA的合成量以及糖原的分解量都
与 GAOs 的代谢模型[45,65-67]一致. Acevedo 等[68]研
究了 Accumulibacter富集培养物在不同聚磷水平时
的代谢状况,结果发现,当聚磷含量高时,PAOs通过
聚磷水解获得 ATP,通过糖原分解获得 NADH 和部
分 ATP;当聚磷含量低时,PAOs 不断吸收乙酸却不
释放无机磷,糖原被大量消耗用于产能,用来填补由
于聚磷水解缺少引起的能量失衡,在合成的 PHA中
PHV的含量有所增加. Acevedo 等[68]将 PAOs 的代
谢 特 征 称 为 PAM ( polyphosphate鄄accumulating
metabolism),GAOs的代谢特征称为 GAM(glycogen鄄
accumulating metabolism).当聚磷水平逐渐下降时,
PAOs的表观代谢特征由 PAM 转换为 GAM;当聚磷
水平恢复时,GAM转换为 PAM.此外,在 PAM / GAM
转换过程中运用 FISH 探针观察到 Accumulibacter
Type玉数量减少而 Type域数量增加,可以推测 PAOs
胞内聚磷水平和类似 GAOs的代谢模式影响着不同
类型 PAOs 的种群分布数量[68] .关于 PAM / GAM 的
转换争议目前尚无定论,但其中涉及的生化反应、代
谢途径和不同类型的 PAOs、GAOs 种群数量变化的
影响因素等方面,值得开展广泛深入的研究.
3摇 EBPR 系统微生物及其代谢机理研究方法与
技术
摇 摇 前文中已经描述过现代分子生物学技术在研究
EBPR系统微生物及其代谢机理方面发挥着极其重
要的作用. 目前使用最为普遍的是基于 16S rDNA
或 rRNA (例如 FISH) 或功能基因 ( ppk) (例如
q鄄PCR)等能够显示微生物种群系统发育状况的分
子生物学方法.系统发育信息和微生物的表现特征
相结合可以对 EBPR 系统 PAOs 和 GAOs 微生物及
其功能进行比较和分析.
许多分子生物学方法都是定性而非定量的,但
是能够帮助阐明微生物特殊的代谢性能. 化学染色
法与 FISH 技术结合有助于说明 EBPR 微生物种群
结构和功能,已经被广泛应用于 PAOs或 GAOs在厌
氧 /好氧条件下胞内聚合物的检测[5,14-16] . G俟nther
等[69]曾联合化学染色、血细胞计数和细胞分选 3 种
方法测定 EBPR系统内聚磷细胞数量百分比. 近年
来 Raman光谱法被用于细胞个体水平的聚合物含
量测定,分析厌氧 /好氧循环条件下 PAOs 和 GAOs
的胞内聚合物的动态变化[70-72] . FISH 结合底物标
记法(放射性或稳定同位素标记底物)、MAR鄄FISH
技术、nano鄄SIMS技术以及 Raman鄄FISH等技术[73-74]
纷纷被应用于 EBPR系统微生物及其功能的分析研
究.这些方法的运用不仅可以观察系统中的微生物
变化,而且还能分析标记化合物在细胞个体水平上
的吸收状况.此外,选择性酶抑制剂的使用在揭示代
谢途径中的特定步骤,特别是底物吸收方面发挥了
显著的作用[42-43] . 然而采用这种方法应当谨慎,因
为当一种途径受到抑制时,可能导致 PAOs 或 GAOs
利用其他未知的途径进行代谢[75] .
近年来,研究者通过运用“ omics冶技术,例如宏
基因组学( genomics)和蛋白质组学( proteomics)在
EBPR系统微生物及其代谢机理研究方面取得了一
些突破性的进展. Accumulibacter Type域A富集物基
因组信息分析结果[28,76]从基因水平验证了 EBPR
代谢模型中的大部分假设.尽管如此,宏基因组学多
数用于阐明某一种微生物的代谢潜力,尚不能提供
任何与基因表达信息有关的证据. 而转录物组学
(transcriptomics)和蛋白质组学的结合能够探测和
鉴定 mRNA 与蛋白质,因而能够较好地反映出
EBPR系统微生物在厌氧 / 好氧条件下的特征变
898 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
表 2摇 EBPR系统微生物及其代谢机理研究中应用的分子生物学技术
Table 2摇 Molecular biology techniques applied in the studies on microbial mechanisms in EBPR systems[53]
技术手段
Technique
作用对象
Target
作用
Function
局限性
Limitations
q鄄FISH rRNA 确定微生物种群的数量 不能反映功能 /活性
q鄄PCR 功能基因(ppk) 确定微生物种群的数量 不能反映实际活性
化学染色 Chemical staining Poly鄄P / PHA 检测 PAOs或 GAOs细胞 不能细胞计数;不能与动力学相结合
Raman光谱 Raman spectroscopy Poly鄄P / PHA / Gly 确定储存聚合物的数量 与传统模型相结合尚存在困难
MAR鄄FISH / nano鄄SIMS / Raman鄄FISH 标记的底物 / rRNA 将系统发育和功能建立关联;明
确底物的吸收
缺少定量,限于底物吸收研究
代谢抑制剂 /选择性化学药剂
Metabolic inhibition / selective chemicals
酶活性 明确生化途径 可能促进非目标微生物的代谢
宏基因组学 Genomics 基因组 DNA 阐明某一类微生物的遗传特性 缺少关于基因信息的表达和活性
蛋白质组学 Proteomics 蛋白质 鉴定蛋白质的合成 合成的蛋白可能被抑制 /条件改变时蛋白的
合成可能被推迟
化[47,77] .值得注意的是,基因转录并不意味着翻译
的必然发生,在操作条件改变的情况下,原本需要表
达的酶可以被选择性抑制剂阻碍其合成过程,或当
外界条件变换时(例如由厌氧到好氧),细胞内蛋白
质的合成可能会推迟.因此通过“omics冶技术获得的
分子生物信息应当与其他的试验手段相配合,才具
有足够的说服力.
4摇 研究展望
废水除磷是保护水环境避免水体富营养化的重
要保证. EBPR 工艺作为最经济有效且被广泛采用
的废水除磷处理方法,其是否能够长期高效稳定的
运行,将对环境中的水体产生巨大而深远的影响.
PAOs的吸磷能力是 EBPR工艺的核心内容.关
于 PAOs的种群多样性及其代谢机理,尽管目前已
取得了众多的研究成果,但针对具有不同功能的
PAOs种群的分类和菌种鉴定等方面还存在争议和
未知领域,因此仍然需要对 EBPR 系统功能微生物
进行深层次的分析,包括系统发育地位的鉴定与划
分,以及各功能微生物间的系统发育关系.在代谢机
理方面,功能微生物的代谢多样性和特异性尚需进
一步探讨.在以上研究的基础上,才能试图揭示 EB鄄
PR系统内的这些微生物在不同环境条件下的代谢
模式转换规律和种群数量变化规律,这对于 EBPR
工艺的稳定运行与效能提升意义重大. 现代分子生
物学技术的应用将会对 EBPR系统功能微生物及其
代谢机理的研究起到积极的推动作用[78-79] .
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作者简介摇 孙摇 雪,女,1985 年生,博士研究生.主要从事废
水生物处理研究. E鄄mail: natalia_sun@ 163. com
责任编辑摇 肖摇 红
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