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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第5期
进入 21 世纪以来，我国地表水污染问题依然较
为严重，湖泊（水库）富营养化问题依然突出。导
致水体富营养化的主要营养物质为氮和磷，而目前
城市污水处理中对氮、磷的去除率并不高［1］，所以
防治水体富营养化首要目的就是研究如何进行脱氮
除磷。
反硝化聚磷菌（Denitrifying phosphate accumula-
ting organisms，DNPAOs）是应用于反硝化除磷技术
的有效菌群，它能在缺氧条件下以硝酸盐作为电子
受体进行同步反硝化（脱氮）和过量吸磷（除磷）
收稿日期 ：2012-11-10
基金项目 ：国家自然科学基金项目（51264029）
作者简介 ：张武刚，男，工程师，研究方向 ：水污染控制工程、应用微生物学 ；E-mail ：wugang_zhang@gmail.com
反硝化聚磷菌的分离鉴定及其特性研究
张武刚1  洪武林2  郑春丽3
（1. 上海清华紫光环境工程有限公司，上海 201204 ；2. 上海立源水处理技术有限责任公司，上海 201108 ；
3. 内蒙古科技大学数理与生物工程学院，包头 014010）
摘 要 : 通过除磷试验、反硝化产气试验以及异染颗粒和聚 -β-羟基丁酸（PHB）颗粒染色试验，从内蒙古乌梁素海湖水中
筛选出一株高效反硝化聚磷菌株 P1-1。经过形态、生理生化试验、BIOLOG 碳源利用分析以及 16S rRNA 基因序列分析，鉴定该菌
株为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）。测定了菌株 P1-1 的生长曲线，主要研究了温度、pH 对菌株 P1-1 的生长和除磷率的
影响，结果表明培养 12 h 以后菌株 P1-1 就开始进入稳定期 ；菌株 P1-1 的最佳生长和除磷条件为温度 30℃，pH8.0。
关键词 : 反硝化聚磷菌 筛选 鉴定 温度 pH
Isolation，Identification and Characteristics of Denitrifying
Polyphosphate-Accumulating Organisms
Zhang Wugang1 Hong Wulin2 Zheng Chunli3
（1. Shanghai Tsinghua Unisplendour Environmental Engineering Co.，Ltd，Shanghai 201204 ；2. Shanghai Liyuan Water Treatment
Technology Co.，Ltd，Shanghai 201108 ；3. School of Mathematics，Physics and Biological Engineering，Inner Mongolia University of
Science & Technology，Baotou 014010）
Abstract:  Being screened by a phosphate uptake experiment, where nitrates were denitrified to gas and through inspection of
metachromatic and Polyphydroxybutyrate （PHB） granules, denitrifying phosphate-accumulating organisms （DNPAOs） P1-1 was isolated from a
water sample in Lake Wuliangsuhai of Inner Mongolia. According to its morphological, physiological characteristics, BIOLOG identification and
the analysis of its 16S rRNA sequence, it was identified as a strain of Pseudomonas fluorescens. The growth curve shows that strain P1-1 enters
stationary phase in 12 hours’ training. Meanwhile, some important factors, temperature and pH value were studied to evaluate their effect on
the growth and phosphorus removal ratios of strain P1-1. The results showed that the optimal conditions for the strain’s growth and phosphorus
removal are 30℃ and pH8.0.
Key words:  Denitrifying phosphate-accumulating organisms （DNPAOs） Screening Identification Temperature pH
过程［2，3］。因此，反硝化除磷技术具有反硝化脱
氮时无需碳源、吸磷时无需曝气并且排泥量少等优
点［4， 5］，已成为当前废水处理技术领域的研究热点
之一。
目前国内外对反硝化聚磷菌的种属都有了一定
的研究，而且反硝化聚磷菌的筛选技术也有了一定
的发展，但较权威、特别是具有说服力的研究并不
多［6］。本研究利用现有的反硝化聚磷菌筛选技术，
从内蒙古乌梁素海湖水中找到了一株反硝化聚磷菌
P1-1，通过形态、生理生化特性、BIOLOG 碳源利用
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期172
分析以及 16S rRNA 基因序列分析对其进行了鉴定，
再从生物学角度出发，对筛到的菌株进行了生物学
特性研究，旨在为反硝化除磷这项新技术的应用推
广提供一定的理论依据和技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 化学试剂 KH2PO4 等试验用到的试剂均为
AR 级，中国医药上海化学试剂公司生产 ；水样取自
内蒙古乌梁素海湖水。
1.1.2 培养基 聚磷菌分离培养基（L-1）［7］：3.68 g
CH3COONa·3H2O、131.82 mg MgSO4·7H2O、57.27
mg NH4Cl、28.73 mg Na2HPO4·2H2O、26.74 mg K2SO4、
17.2 mg CaCl2·2H2O、12 g HEPES 缓冲溶液、2 mL
微量元素和琼脂 20 g，pH7.0，用于聚磷菌的分离。
牛肉膏蛋白胨培养基（L-1）：10 g 蛋白胨、5 g
牛肉膏、5 g NaCl、20 g 琼脂，pH7.0，用于反硝化
聚磷菌的纯化。
缺磷培养基（L-1）［6，8］：3.32 g CH3COONa·3H2O、
152.8 mg NH4Cl、17.83 mg K2SO4、23 mg Na2HPO4·
2H2O、81.12 mg MgSO4·7H2O、11 mg CaCl2·2H2O、
2 mL 微量元素和 7 g HEPES 缓冲溶液，pH7.0。
富磷培养基（L-1）［6，8］：3.32 g CH3COONa·3H2O、
91.26 mg MgSO4·7H2O、305.52 mg NH4Cl、25 mg
KH2PO4、25.68 mg CaCl2·2H2O、2 mL 微量元素和 8.5
g PIPES 缓冲液，pH7.0 ；可作为模拟废水。
微量元素溶液（L-1）［6，8］：5 g EDTA、5 g MnCl2·
4H2O、1.6 g CuSO4·5H2O、5 g FeSO4·7H2O、50 mg
CoCl2·6H2O、10 mg KI、50 mg （NH4） 6Mo7O24·
4H2O 和 50 mg H3BO3。
培养基中所有 pH 都用 1 mol/L 的氢氧化钠溶液
和 1 mol/L 的盐酸溶液调至 7.0 ；培养基都用 1×105
Pa 灭菌 30 min。
1.1.3 主要仪器 HITACHI U-2910 型紫外可见分光
光度计，雷磁 PHS-3C 型 pH 计，OLYMPUS CX31 双
目微生物学显微镜，日本电子 JSM-5600 LV 扫描电
子显微镜，BIOLOG 微生物自动分析系统。
1.2 方法
1.2.1 菌株的分离、纯化及筛选
1.2.1.1 菌株的分离、纯化 先将水样混合均匀，
用移液管移取 10 mL 水样，移入盛有 90 mL 无菌水
的三角瓶中，振荡使其混合均匀，按倍比稀释，分
别得到 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 和 10-6 的稀释溶
液。分别取 10-3、10-4、10-5 和 10-6 不同浓度的 0.1
mL 水样溶液在聚磷菌分离培养基上进行涂布培养，
在恒温隔水式培养箱中，30℃条件下培养 2 d。从这
几个稀释梯度中挑选出 1 个最合适的梯度，要求平
板上菌落分布清晰均匀（菌落数在 30-300 个），然
后用此梯度的水样再进行 3 个重复平行涂布，挑取
形态清晰、易于挑取的单菌落用牛肉膏蛋白胨培养
基进行分离纯化，重复 3 次以上菌落形态特征一致，
无异常菌落出现，可认为是单菌落。最后挑取纯化
好的单一菌落接种到斜面培养基上培养 2 d，4℃保
存备用。
1.2.1.2 菌株的筛选 选取上面分离纯化后所得的
菌株，首先接种在缺磷培养基中，通过 30℃，140
r/min 进行 1-2 d 的富集预培养 ；接着取预培养后的
5 mL 菌液，在 1×104 r/min 的条件下离心 2 min，倾
去上清液，并用无菌蒸馏水洗 2 次，将得到的菌株
悬浮于富磷培养基中，整个过程在无菌操作台上进
行 ；然后将接种好菌株的富磷培养基在 30℃，140
r/min 进行扩大培养，培养 24 h，每种菌取 15 mL 菌
液，在 1×104 r/min 的条件下离心 2 min，取上清液
用钼酸铵分光光度法（GB 11893-89）测定接种前后
PO4
3--P 含量的变化 ；最后取除磷率高于 50% 的菌
株进行硝酸盐还原产气试验、异染颗粒染色试验和
聚 -β-羟基丁酸（PHB）颗粒染色试验，将既能过量
吸磷，又具有反硝化脱氮功能并有 PHB 颗粒和异染
颗粒的菌株定为反硝化聚磷菌（DNPAOs）［9］。
1.2.2 DNPAOs 的脱氮除磷试验 将富磷培养基作
为模拟废水，首先在原有富磷培养基的基础上加入
一定量的 KNO3，使硝态氮的含量为 60 mL/L
［6］，装
入密封的三角锥形瓶，取预培养 24 h 后的 DNPAOs
进行无菌蒸馏水洗涤 2 次，离心后投入到加有 KNO3
的富磷培养基中 ；最后在 30℃恒温隔水式培养箱
中培养 24 h 后用钼酸铵分光光度法（GB 11893-89）
测定培养前后磷含量的变化，并用紫外分光光度法
（HJ/T 346-2007）测定硝态氮含量的变化。
1.2.3 菌株的鉴定
1.2.3.1 形态及生理生化特征 将处于稳定期的菌
2013年第5期 173张武刚等 ：反硝化聚磷菌的分离鉴定及其特性研究
液制片，在光学显微镜下观察，并做革兰氏染色，
利用扫描电镜分析梯度脱水处理后的剩余菌液。菌
株的生理生化特征试验及鉴定见《伯杰细菌鉴定手
册（第八版）》［10］。
1.2.3.2 BIOLOG 碳源利用分析 利用 BIOLOG 微生
物自动分析系统，以 DNPAOs 对微平板上 95 种碳源
的利用情况为基础进行分析鉴定。
1.2.3.3 16S rRNA 基因测序与构建系统发育树的分
析 在液体培养基将菌体培养至对数期，取 1 mL 菌
液利用试剂盒（TIANamp Bacteria DNA Kit）提取基
因组 DNA，用常见细菌通用引物对（正向引物 27F
5-AGAGTTYGATCCTGGCTCAG-3 ；反向引物 1492R
5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3［11］）扩增菌株的
16S rRNA 基因。PCR 反应体系总共为 50 μL，组成
为：无菌水 34 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTPs（2.5
mmol/L）4 μL、引物 27F 和 1492R 各 1 μL、Taq DNA
聚合酶 1 μL、MgCl2（25 mmol/L）3 μL、DNPAOs 的
基因组 DNA 1 μL。所用程序为 ：94℃ 3 min ；94℃
40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 个 循 环 ；72 ℃ 10
min。PCR 扩增产物的纯化和测序由上海生工生物
技术有限公司来完成。然后将菌株的 16S rRNA 基
因序列结果提交到 GenBank 核酸序列数据库中与已
有的相关序列比较，再通过 ClustalX 1.8 软件进行
全序列的比对［12］，最后利用 MEGA3.1 构建系统发
育树［13］。
1.2.4 菌株的生物学特性研究
1.2.4.1 生长曲线的测定 细菌的生长情况采用光
电比浊法进行测定，利用 HITACHI U-2910 型紫外
可见分光光度计以 OD600 值表示 ；培养条件 ：温度
30℃，pH7.0，转速 140 r/min，每 2 h 取样测一次，
共测 24 h。
1.2.4.2 温度、pH 值、磷含量与菌株生长关系的
确定 温度分别设置为 15℃、20℃、25℃、30℃、
35℃和 40℃，将筛选到的 DNPAOs 活化 18 h 后，在
每个温度条件下以 10% 的接种量（接种后 OD600=
0.14±0.01）分别接入 3 份同样的模拟废水即富磷培
养基中，恒温、140 r/min 的条件下培养 24 h 后，测
定细菌悬浮液的 OD600 以及接种前后模拟废水中的
磷含量的变化。
pH 分别设置为 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和
10.0，以上述相同的接种方式，30℃恒温、140 r/min
条件下培养 24 h 后测定细菌悬浮液的 OD600 以及接
种前后模拟废水中的磷含量的变化。
2 结果
2.1 反硝化聚磷菌的分离、纯化及筛选
挑取的菌落经牛肉膏蛋白胨 3 次以上划线后得
单菌落菌株 8 株，按照“1.2 方法”在缺、富磷液体
培养基内培养后，选出除磷率在 50% 以上的 8 株菌，
经硝酸盐还原产气试验、PHB 颗粒染色及异染颗粒
染色试验，结果见表 1。
表 1 菌株的筛选结果
菌株名称 除磷率（%） 反硝化能力 异染颗粒 PHB
P1-1 98 有 有、大 有、明显
P1-2 99 无 有、大 有、不明显
P2-1 99 无 有、小 未观察到
P2-2 99 无 有、大 有、明显
P2-3 91 无 有、小 有、不明显
P3-1 75 无 有、小 无
P3-2 99 无 有、大 有、不明显
P4-1 96 无 有、小 无
2.2 反硝化聚磷菌的脱氮除磷试验
经过 24 h 缺氧培养后测定 NO3--N 和 PO4
3--P 的
含量变化，发现菌株 P1-1 除磷率达到 72.4%，脱氮
率达到 91.4%。
2.3 菌株P1-1鉴定
2.3.1 菌株 P1-1 形态学特征与生理生化特性 菌
株 P1-1 革兰氏染色反应呈阴性，光学显微镜和扫描
电镜显示该菌为典型的短杆状（图 1，图 2），大小
（0.3-0.4 μm）×（1.2-2.0 μm）。在固体牛肉膏蛋白
胨培养基上培养 24 h 菌落直径小于 1 mm，48 h 菌
图 1 菌株 P1-1 显微镜照片（1 000×）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期174
落基本长成，菌落直径 1-2 mm，不透明，米黄色，
拱顶球状，边缘整齐，易挑起。菌株 P1-1 主要生理
2.3.2 BIOLOG 碳源利用分析 将 BIOLOG 系统鉴
定结果与数据库中数据进行匹配，ID 地址栏显示最
佳匹配名称为 Pseudomonas fluorescens，系统得到的
3 个重要参数均比较理想，分别为 ：SIM 值 =0.514，
DIST=4.355，PROB=67.2%。BIOLOG 分析结果说明
该菌株与 Pseudomonas fluorescens 匹配度最高且达可
表 2 菌株 P1-1 的生理生化鉴定
生理生化试验 菌株 P1-1 生理生化试验 菌株 P1-1
接触酶 + 革兰氏染色 -
氧化酶 + M.R 试验 -
尿素酶 + 精氨酸双水解酶 +
葡萄糖发酵 - 胆汁七叶苷 -
动力 - 明胶液化 -
产 H2S - V.P 试验 -
吲哚 - 淀粉水解 -
+ ：阳性 ；- ：阴性图 2 菌株 P1-1 的扫描电镜照片
生化特性为革兰氏阴性，氧化酶阳性，接触酶阳性
（表 2）。
Escherichia coliGU968184
Pseudomonas veronii strain CA-4GU968184
Pseudomonas veroniiAB494445
Pseudomonas fluorescens strain PC33DQ178231
Pseudomonas fluorescens strain hswX151JQ236822
Strain P1-1JN030498
Pseudomonas fluorescensAB680092
Pseudomonas sp. BS12009GQ281048
Pseudomonas sp. KBOS 04AY653221
Pseudomonas sp. U2-4EU849100
87
89
93
49
79
62
100
信程度。
2.3.3 16S rRNA 基因序列分析 测序获得菌株 P1-1
的 16S rRNA 基因序列（1 440 bp），GenBank 序列登
录号为 JN030498。菌株 P1-1 的 16S rRNA 基因序列
与 GenBank 中已有的多株 Pseudomonas fluorescens 菌
株相似性都在 99%，并在 16S rRNA 基因序列同源性
图 3 菌株 P1-1 16S rDNA 序列的系统发育树
的基础上构建系统发育树（图 3）。
2.4 菌株P1-1的生物学特性研究
2.4.1 菌株 P1-1 的生长曲线测定 菌株 P1-1 的生
长曲线（图 4）显示，菌株的延滞期不足 2 h，说明
接种的菌株都处在生长旺盛期，4 h 以后菌株进入对
数生长期，而在 12 h 以后菌株进入了稳定期，说明
菌株 P1-1 易于培养。
2.4.2 温度对菌株 P1-1 生长及除磷效果的影响 为
确定菌株 P1-1 最佳生长温度和最佳除磷温度，以富
磷培养基为反应体系，改变反应物体系的温度，测
定 OD600 和反应前后磷浓度的变化，每个温度下的 3
个平行试验取平均值，结果如图 5 所示。菌株 P1-1
在温度 15-35℃生长良好，菌株的最佳生长温度为
30℃ ；菌株在 15-35℃除磷率接近 100% ；40℃下不
利于菌株生长而且没有除磷效果。
2.4.3 pH 对菌株 P1-1 生长及除磷效果的影响 为
确定菌株 P1-1 最佳生长 pH 和最佳除磷条件下的
pH，以富磷培养基为反应体系，改变反应物体系的
pH，每个 pH 值下的 3 个平行试验平均值，结果如
图 6 所示。菌株 P1-1 在 pH 6.0-9.0 生长良好，其中
在 pH 8.0 下是生长最好 ；菌株在 pH6.0-9.0 磷的去
除效果都很好，去除率都接近 100% ；在 pH<6.0 或
者 pH>9.0 时磷的去除效果都不好，特别是在偏酸性
条件下不利于菌株的生长。
2013年第5期 175张武刚等 ：反硝化聚磷菌的分离鉴定及其特性研究
及 16S rRNA 序列分析结果，鉴定该菌株为荧光假单
胞菌，命名为 Pseudomonas fluorescens strain P1-1。根
据马放等［6］所报道的高效反硝化聚磷菌的除磷和脱
氮效果，本试验筛选到的菌株已经表现出了较好的
反硝化除磷能力。虽然菌株 P1-1 在缺氧条件下具有
反硝化过量吸磷的能力，但是缺氧条件下磷的去除
效果没有好氧条件好，这是由于利用硝态氮吸磷时
可能不如利用分子氧效率高［14］。根据报道［4，5］，反
硝化除磷技术具有脱氮时无需碳源、吸磷时无需曝
气并且排泥量少等优点，而反硝化聚磷菌在反硝化
除磷技术中起到了关键作用。因此筛选分离反硝化
聚磷菌对研究反硝化除磷技术，提高反硝化除磷能
力具有重大意义。
4 结论
参考已有的反硝化聚磷菌的筛选方法，利用
聚磷分离培养基进行初筛，大大提高了筛菌的效
率，缩短了时间。从内蒙古乌梁素海湖水中筛选到
一株反硝化聚磷菌，鉴定为荧光假单胞菌，并命名
为荧光假单胞菌 P1-1（Pseudomonas fluorescens strain
P1-1）。菌株 P1-1 最佳生长和除磷的温度是 30℃，
pH 为 8.0，除磷率接近 100%，具有较好的应用前景。
参 考 文 献
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ᰦ䰤h
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8O
D
60
0
0.6
0.4
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
O
D
60
0
OD600
0.2
0
10 20 30 40 45
20
40
60
䲔⼧⦷%
䲔⼧⦷
⑙ᓖ℃
80
100
0
352515
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
O
D
60
0
0.2
0
3 5 7 8 10 11
20
40
60
䲔⼧⦷%
pH
80
100
0
964
OD600 䲔⼧⦷
图 5 温度对菌株 P1-1 的生长及除磷率的影响
图 4 菌株 P1-1 的生长曲线
图 6 pH 对菌株 P1-1 的生长及除磷率的影响
3 讨论
本研究结果显示，菌株 P1-1 具有反硝化能力，
且体内都含有 PHB 颗粒和异染颗粒，认为菌株 P1-1
为反硝化聚磷菌。菌株 P1-1 主要生理生化特性为革
兰氏阴性，氧化酶阳性，接触酶阳性，其基本生理
生化特性与《伯杰细菌鉴定手册》中描述的假单胞
菌（Pseudomonas）［10］很相似。结合菌株 P1-1 的主
要形态特征、生理生化特征，BIOLOG 分析结果以
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期176
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（责任编辑 马鑫）