全 文 ：厌氧产脂肽工程菌的构建及其代谢活性评价∗
梁小龙１，２　 赵　 峰３　 史荣久１　 班允赫４　 周纪东１，２　 韩斯琴１　 张　 颖１∗∗
（ １中国科学院沈阳应用生态研究所污染生态与环境工程重点实验室， 沈阳 １１００１６； ２中国科学院大学， 北京 １０００４９； ３哈尔滨
工业大学市政环境工程学院城市水资源与水环境国家重点实验室， 哈尔滨 １５００９０； ４沈阳师范大学化学与生命科学学院， 沈
阳 １１００３４）
摘　 要　 利用微生物产生生物表面活性剂驱油，是微生物采油的重要技术之一．但油藏的缺
氧环境使得大多数生物表面活性剂产生菌的代谢活性受到限制．本研究以筛选自油田采出水
中的好氧产脂肽类表面活性剂的解淀粉芽孢杆菌 ＢＱ⁃２和兼性厌氧的施氏假单胞菌 ＤＱ⁃１为
亲本菌，通过原生质体融合的方法构建了一株能在厌氧条件下迅速生长并能产脂肽类表面活
性剂的融合子 ＪＤ⁃３．融合子 ＪＤ⁃３的菌落形态与亲本菌株 ＢＱ⁃２相似，其 １６Ｓ ｒＤＮＡ序列与 ＢＱ⁃２
的相似度达 ９９％；在厌氧条件下培养 ３６ ｈ，融合子 ＪＤ⁃３ 发酵液的表面张力由初始的６３．０
ｍＮ·ｍ－１降至 ３２．５ ｍＮ·ｍ－１；薄层层析及红外光谱分析结果显示，ＪＤ⁃３在厌氧条件下的产物
为脂肽类表面活性剂；该表面活性剂的临界胶束浓度（ＣＭＣ）为 ９０ ｍｇ·Ｌ－１，且对原油、液体石
蜡、煤油等有较好的乳化活性．ＪＤ⁃３在厌氧条件下可以蔗糖、葡萄糖或甘油为碳源，以蛋白胨
等为氮源合成脂肽类表面活性剂，且经多次厌氧传代培养仍保持稳定的产生物表面活性剂功
能，显示该菌株在油藏厌氧条件下对提高原油采收率具有较好的应用潜力．
关键词　 微生物驱油； 原生质体融合； 厌氧表面活性剂产生菌； 脂肽
∗国家高技术研究发展计划项目（２０１３ＡＡ０６４４０２）和大庆油田合作项目资助．
∗∗通讯作者． Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｙｚｈａｎｇ＠ ｉａｅ．ａｃ．ｃｎ
２０１４⁃０９⁃０９收稿，２０１５⁃０５⁃２２接受．
文章编号　 １００１－９３３２（２０１５）０８－２５５３－０８　 中图分类号　 Ｔ３７９　 文献标识码　 Ａ
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ ｕｎ⁃
ｄｅｒ ａｎｏｘｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． ＬＩＡＮＧ Ｘｉａｏ⁃ｌｏｎｇ１，２， ＺＨＡＯ Ｆｅｎｇ３， ＳＨＩ Ｒｏｎｇ⁃ｊｉｕ１， ＢＡＮ Ｙｕｎ⁃ｈｅ４， ＺＨＯＵ
Ｊｉ⁃ｄｏｎｇ１，２， ＨＡＮ Ｓｉ⁃ｑｉｎ１， ＺＨＡＮＧ Ｙｉｎｇ１ （ １Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ Ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１００１６， Ｃｈｉｎａ；
２Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４９， Ｃｈｉｎａ； ３Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｕｒｂａｎ
Ｗａｔｅｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｕｎｉｃｉｐａｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｈａｒｂｉｎ Ｉｎｓｔｉ⁃
ｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈａｒｂｉｎ １５００９０， Ｃｈｉｎａ； ４Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ｎｏｒ⁃
ｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１００３４， Ｃｈｉｎａ） ． ⁃Ｃｈｉｎ． Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｅｃｏｌ．， ２０１５， ２６（８）： ２５５３－２５６０．
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ⁃ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｏｉｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｎ⁃
ｈａｎｃｅｄ ｏｉｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ （ＭＥＯＲ）． Ｈｏｗｅｖｅｒ， ｔｈｅ ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， ｍｏｓｔ ｏｆ ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ａｅｒｏｂｅｓ， ｉｓ ｓｅｖｅｒｅｌｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｄｕｅ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎ⁃ｓｉｔｕ ａｎｏｘｉｃ ｃｏｎｄｉ⁃
ｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈｉｎ ｏｉｌ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒｓ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｗｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａ ｓｔｒａｉｎ ＪＤ⁃３， ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ
ｇｒｏｗ ｒａｐｉｄｌｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｅ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ ｕｎｄｅｒ ａｎｏｘｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｂｙ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｃｏｎｆｕｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ Ｂａ⁃
ｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ ＢＱ⁃２ ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ， ａｎｄ ａ ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ ａｎ⁃
ａｅｒｏｂｉｃ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ ｓｔｒａｉｎ ＤＱ⁃１ ａｓ ｐａｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｔｈｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
（９９％ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ） ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｏｌｏｎｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｆｕｓａｎｔ ＪＤ⁃３ ｗａｓ ｃｌｏｓｅｒ ｔｏ
ｔｈｅ ｐａｒｅｎｔａｌ ｓｔｒａｉｎ Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＢＱ⁃２． Ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｒｏｔｈ ｏｆ ｆｕｓａｎｔ ＪＤ⁃３，
ａｆｔｅｒ ３６⁃ｈｏｕｒ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｉｔｉａｌｌｙ ６３．０ ｔｏ ３２．５
ｍＮ·ｍ－１ ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ
ｔｈｅ ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ＪＤ⁃３ ｗａｓ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ． Ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ⁃ａｃｔｉｖｅ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ ｈａｄ ａ ｌｏｗ ｃｒｉｔｉｃａｌ
ｍｉｃｅｌｌｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ （ＣＭＣ） ｏｆ ９０ ｍｇ·Ｌ－１ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａ ｇｏｏｄ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｅｍｕｌｓｉｆｙ ｖａｒｉｏｕｓ ｈｙｄｒｏ⁃
ｃａｒｂｏｎｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｃｒｕｄｅ ｏｉｌ， ｌｉｑｕｉｄ ｐａｒａｆｆｉｎ， ａｎｄ ｋｅｒｏｓｅｎｅ． Ｓｔｒａｉｎ ＪＤ⁃３ ｃｏｕｌｄ ｕｔｉｌｉｚｅ ｐｅｐｔｏｎｅ ａｓ ｎｉｔｒｏ⁃
ｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ａｎｄ ｓｕｃｒｏｓｅ， ｇｌｕｃｏｓｅ， ｇｌｙｃｅｒｉｎ ｏｒ ｏｔｈｅｒ ｃｏｍｍｏｎ ｏｒｇａｎｉｃｓ ａｓ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｆｏｒ ａｎａｅｒｏｂｉｃ
ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｔｈｅ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｆｕｓａｎｔ ＪＤ⁃３ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｓｔａｂｌｅ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ
应 用 生 态 学 报　 ２０１５年 ８月　 第 ２６卷　 第 ８期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ， Ａｕｇ． ２０１５， ２６（８）： ２５５３－２５６０
ｅｖｅｎ ａｆｔｅｒ ｔｅｎ ｓｅｒｉａｌ ｐａｓｓａｇｅｓ． Ａｌｌ ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｆｕｓａｎｔ ＪＤ⁃３ ｈｏｌｄｓ ａ ｇｒｅａｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｏ
ｍｉｃｒｏｂｉａｌｌｙ ｅｎｈａｎｃｅ ｏｉｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｕｎｄｅｒ ａｎｏｘｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｏｉｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ； ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ； ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｂａｃｔｅｒｉａ； ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ．
　 　 微生物提高原油采收率（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｏｉｌ
ｒｅｃｏｖｅｒｙ， ＭＥＯＲ）主要指调控特定微生物种群的代
谢活性或利用微生物的代谢产物（如表面活性剂、
胞外聚合物等），改善油藏或原油物性从而提高原
油采收率的综合性技术． ＭＥＯＲ 技术成本相对低
廉、操作简便、对油藏损害轻、无污染，是一项具有广
阔应用前景的采油技术［１－２］ ．
利用微生物产生物表面活性剂提高原油采收率
是 ＭＥＯＲ 的重要研究领域之一．生物表面活性剂是
一大类兼具亲水 ／疏水活性的两性化合物，同化学合
成的表面活性剂相比，其结构更加多样、稳定性高、
环境友好，在微生物采油［３－５］等领域显示了重大应
用潜力． 但是，目前筛选到的表面活性剂产生菌绝
大多数为好氧微生物，在缺氧环境下无法生存或不
能产生物表面活性剂，而油藏环境却是一个厌氧或
缺氧环境［６－９］，在微生物采油应用中需要注空气来
维持其代谢活性，这就带来了成本高、操作性差、效
果不稳定等问题．而厌氧产生物表面活性剂产生菌
很难筛选到［１０－１１］，目前还没有较好的厌氧表面活性
剂产生菌进行微生物驱油的技术的应用．原生质体
融合是遗传改造微生物代谢活性的重要技术手段，
通过原生质体融合可获得高性能的菌株，该技术是
一种安全、操作简便、可跨越种属限制的育种方
法［１２］ ．
本研究选用筛选自新疆油田的只能在好氧条件
下产生脂肽的解淀粉芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ⁃
ｆａｃｉｅｎｓ）ＢＱ⁃２和分离自大庆油田的一株不产表面活
性剂的兼性厌氧的反硝化细菌施氏假单胞菌
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ） ＤＱ⁃１ 为亲本，通过原生质体
融合技术，构建了能在厌氧条件下快速生长且能产
生脂肽类表面活性剂的融合菌株 ＪＤ⁃３，并对融合子
ＪＤ⁃３的生长代谢特征和产物活性进行评价，旨在为
拓展油藏原位厌氧条件下 ＭＥＯＲ 研究提供理论与
技术基础，并为采用厌氧微生物提高原油采收率提
供高效菌种资源．
１　 材料与方法
１􀆰 １　 供试材料
１􀆰 １􀆰 １供试菌株　 供试菌株为解淀粉芽孢杆菌（Ｂａ⁃
ｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＢＱ⁃２、施氏假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏ⁃
ｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）ＤＱ⁃１，均为本实验室保存菌种．
１􀆰 １􀆰 ２培养基与溶液　 １）完全培养基（ｇ·Ｌ－１）：蛋
白胨 １０．０，酵母粉 ５．０，牛肉浸膏 ５．０，氯化钠 ５．０，葡
萄糖 ５．０，ｐＨ ７．０～７．２．固体培养基加 １７～２０ ｇ 琼脂，
１２１ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎ． ２）高渗再生培养基（ｇ·Ｌ－１）：在
ＣＭ培养基中加入甘露醇 ４５．５，ＮａＣｌ ２９．２，ＭｇＣｌ２·
６Ｈ２Ｏ ４．１，明胶 ２０．０，１１５ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎ． ３）ＳＭＭ 高
渗透压缓冲液（ｍｏｌ·Ｌ－１）：蔗糖 ０． ５，顺丁烯二酸
０􀆰 ０２，ＭｇＣｌ２·６Ｈ２ Ｏ ０． ０２， ｐＨ ７． ０，１１５ ℃灭菌 ２０
ｍｉｎ． ４）溶菌酶溶液：用 ＳＭＭ 高渗透压缓冲液配置
成 ５０ ｍｇ·ｍＬ－１的溶菌酶溶液，用 ０．２２ μｍ 滤膜过
滤除菌． ５） ＰＥＧ６０００ 促融剂溶液：含 ４０％ＰＥＧ６０００
的 ＳＭＭ高渗透压缓冲液，１１５ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎ． ６）好
氧发酵培养基（ ｇ·Ｌ－１）：甘油 ２８．０，ＮａＣｌ ３． ０，ＫＣｌ
１􀆰 ０，ＫＨ２ＰＯ４ ５．７ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ５．２５，ＮａＮＯ３ ３．１，ＭｇＳＯ４
０􀆰 ２５，ＣａＣｌ２ ０．１６，酵母提取物 ３．０，ｐＨ ７．０． ７）厌氧发
酵培养基（ｇ·Ｌ－１）：在好氧发酵培养基的基础上添
加终浓度为 ０．０００１％刃天青，Ｎａ２ Ｓ·９Ｈ２Ｏ 终浓度
０􀆰 ０２％，将培养基煮沸，在 ９９．９９％高纯氮气保护下
装入厌氧管中［１３］ ．
１􀆰 １􀆰 ３主要试剂与仪器　 ｒＴａｑ ＤＮＡ 聚合酶、λ⁃Ｈｉｎｄ
Ⅲ ｄｉｇｅｓｔ 分子质量标准购自大连宝生物工程有限公
司，基因组提取纯化试剂盒为 Ｔｈｅｒｍｏ 试剂公司产
品，溶菌酶、聚乙二醇购自北京索莱宝科技有限公
司，其他试剂均为分析纯试剂．主要仪器为低温离心
机（美国 Ｔｈｅｒｍｏ 公司的 ＢＩＯＦＵＧＥ ＰＲＩＭＯＲ）、环境
扫描电镜（美国 ＦＥＩ 公司的 ＱｕａｎｔａＴＭ２５０）、ＰＣＲ 仪
（美国 ＡＢＩ公司的 Ｖｅｒｉｔｉ ９６ ｗｅｌｌ Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ）、微
型紫外分光光度计（美国 Ｔｈｅｒｍｏ 公司的 Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ
２０００）、电泳仪（北京六一仪器有限公司）、凝胶成像
系统（美国 Ｂｉｏ⁃ＲＡＤ 公司的 Ｇｅｌ Ｄｏｃ２０００ＴＭ）、旋转
蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂的 ＲＥ⁃２０００）、全自动
表面张力仪（上海衡平仪表厂的 ＢＺＹ⁃１）．
１􀆰 ２　 原生质体制备、灭活及融合
１􀆰 ２􀆰 １原生质体制备　 取活化的亲本菌株解淀粉芽
孢杆菌 ＢＱ⁃２和施氏假单胞菌 ＤＱ⁃１，分别接种于 ５０
ｍＬ新鲜的液体完全培养基中，３７ ℃、１８０ ｒ·ｍｉｎ－１
振荡培养 ７ ｈ；将菌液转移至 ５０ ｍＬ 离心管中，４ ℃
４５５２ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
３５００ ｒ·ｍｉｎ－１离心 １０ ｍｉｎ 收集菌体，用 １０ ｍＬ 的
ＳＭＭ缓冲液悬浮菌体，加入溶菌酶溶液至终浓度为
３ ｍｇ·ｍＬ－１，在 ４２ ℃下保温 ４０ ｍｉｎ；２５００ ｒ·ｍｉｎ－１
离心收集菌体，将其悬浮于 ＳＭＭ缓冲液中．
１􀆰 ２􀆰 ２原生质体非对称灭活　 热灭活解淀粉芽孢杆
菌 ＢＱ⁃２原生质体：取 １ ｍＬ 制得的原生质体悬液，
分装至 ２ ｍＬ离心管，置于 ６５ ℃恒温水浴箱中保温
灭活 １６０ ｍｉｎ，使灭活率达到 １００％，以未被热处理的
原生质体为对照．
紫外灭活施氏假单胞菌 ＤＱ⁃１：吸取 ２ ｍＬ 原生
质体悬液至设有转子的无菌 ５ ｃｍ直径培养皿中，置
于 １５ Ｗ紫外灯下 ２０ ｃｍ照射 ３０ ｍｉｎ，使灭活率达到
１００％，关闭紫外灯，暗培养 １ ｈ．
１􀆰 ２􀆰 ３原生质体融合　 各取 １ ｍＬ 解淀粉芽孢杆菌
ＢＱ⁃２和施氏假单胞菌 ＤＱ⁃１灭活原生质体悬浮液，
置于 １０ ｍＬ 离心管中，混合均匀，于 ３０ ℃培养箱中
放置 ５ ｍｉｎ，３０００ ｒ·ｍｉｎ－１离心 １０ ｍｉｎ，弃上清液，
收集菌体，立即加入 ０． ２ ｍＬ ＳＭＭ 溶液和 １． ８ ｍＬ
ＰＥＧ６０００促融剂溶液，混合均匀，放置于 ３０ ℃培养
箱 ５ ｍｉｎ，２５００ ｒ·ｍｉｎ－１离心 １０ ｍｉｎ，弃上清液，收集
菌体，加入 ２ ｍＬ ＳＭＭ溶液，混合均匀；采用 ＳＭＭ溶
液，依次稀释至 １０－７、１０－８、１０－９，涂布 ０．２ ｍＬ于再生
羊血平板上，在充氮气环境下，将平板放置在放有除
氧袋及 ０． ０００１％刃天青的厌氧盒（日本三菱 ＭＧＣ
ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ Ｃ－３１）中，３０ ℃培养 ２ ｄ，观察融合子生
长情况．
１􀆰 ３　 融合子的筛选及遗传稳定性检测
１􀆰 ３􀆰 １融合子的筛选　 经双亲灭活再融合得到的再
生菌落即为两亲本的融合子，挑取在血平板上产生
溶血圈的单菌落，于液体完全培养基中培养 １６ ｈ；离
心后以无菌水洗菌体 ３ 次，接种至厌氧发酵培养基
中，３７ ℃培养 ２ ｄ，测定发酵液表面张力，能使发酵
液表面张力显著下降的菌株，即为目的菌株．
１􀆰 ３􀆰 ２遗传稳定性检测 　 采用群体传代培养的方
法［１４］对筛选出的融合子进行遗传稳定性评价．将融
合子进行传代培养，以斜面⁃平板⁃厌氧管为 １ 个世
代，每代均做 ３个平行样，传至 １０代，以第 １代的厌
氧发酵液表面张力值为对照，考察融合子的传代稳
定性．
１􀆰 ４　 融合子的特性
１􀆰 ４􀆰 １融合子扫描电镜形态观测　 扫描电子显微镜
可以直接观测样品表面的三维立体结构，放大倍数
可从十倍到数万倍，且图像更易存储［１５］ ．收集融合
子对数生长期的新鲜菌液，无菌水洗涤，置于 ２．５％
戊二醛磷酸缓冲液（ｐＨ ７．２）中，于 ４ ℃固定过夜；次
日以 ０．１５％的同一缓冲液冲洗，然后依次用 ４０％、
７０％、９０％和 １００％的乙醇分别脱水 １５ ｍｉｎ；脱水后
用醋酸戊脂置换乙醇，将上述样品于真空冷冻干燥
机中干燥，使菌体呈粉末；将样品放在真空镀膜机
内，把金喷镀到样品表面，取出样品在扫描电镜中进
行观察［１６］ ．
１􀆰 ４􀆰 ２融合子 １６Ｓ ｒＤＮＡ 基因序列分析 　 用基因组
提取纯化试剂盒（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｅｎｅＪＥＴ Ｇｅｎｏｍ⁃
ｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）从融合子的过夜培养物中提
取基因组 ＤＮＡ，经 ０． ８％琼脂糖凝胶电泳检测，并
用微型紫外分光光度计（美国 Ｔｈｅｒｍｏ 公司的 Ｎａｎｏ
ｄｒｏｐ ２０００） 检测浓度和纯度；以基因组 ＤＮＡ 为
模板，采用细菌通用引物 ２７ｆ⁃１４９２ｒ 引物对 （２７ｆ：
ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ； １４９２ｒ： ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧ⁃
ＴＴＡＣＧＡＣＴＴ）扩增 １６Ｓ ｒＤＮＡ，ＰＣＲ反应体系及反应
条件参考 Ｌｉ等［１７］的研究．并用 Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ ２０００ 检测
浓度和纯度，将 ＰＣＲ 产物送检测序，并将获得的序
列用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０ 软件与两亲本 １６Ｓ ｒＤＮＡ序
列进行比对．
１􀆰 ４􀆰 ３厌氧发酵试验　 发酵罐的总体积为 １０ Ｌ，配
制 ６ Ｌ厌氧发酵培养基，煮沸后在氮气的保护下，装
入发酵罐中，并持续通入 ９９．９９％高纯氮气 １ ｈ，立刻
密闭发酵罐，使发酵罐与充满氮气的袋子连通．待发
酵液冷却后，按 ５％的接种量，在通氮气环境下接入
发酵罐中，在 ３７ ℃下发酵，发酵初期每 ３ ｈ 取样一
次，稳定期后期约 １０ ｈ取样一次，测菌体浓度、发酵
液 ｐＨ、表面张力、溶解氧浓度及氧化还原电位．
１􀆰 ４􀆰 ４融合子利用碳源及氮源情况试验　 分别用蛋
白胨、酵母粉、硝酸钠、硝酸铵、氯化铵为融合菌株
ＪＤ⁃３厌氧发酵的氮源，浓度均为 ０．８％，其他培养基
组成同厌氧培养基的基础部分，以不接菌的培养基
作对照；以蔗糖、甘油、葡萄糖、糖蜜、大豆油、玉米浆
粉分别作为 ＪＤ⁃３厌氧发酵的碳源，浓度均为 ２％，以
不接菌的培养基为对照．每处理 ４ 次重复，测定发酵
液的表面张力，比较不同氮源和不同碳源对 ＪＤ⁃３发
酵的影响．
１􀆰 ４􀆰 ５融合子在不同温度及 ｐＨ 条件下的代谢活性
试验　 接种融合子单菌落至厌氧发酵培养基中，３７
℃培养 ３６ ｈ，５０００ ｒ·ｍｉｎ－１离心 １０ ｍｉｎ，无菌水洗菌
体，重悬后，以 ５％接种量接种至 ２０ ｍＬ 厌氧发酵培
养基中，每组设 ３ 个平行，２５、３０、３５、４０、４５ ℃分别
培养 ２ ｄ， １００００ ｒ·ｍｉｎ－１离心 １０ ｍｉｎ，分别测定发
酵液的表面张力及细胞干质量．不同 ｐＨ对融合子代
５５５２８期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 梁小龙等： 厌氧产脂肽工程菌的构建及其代谢活性评价　 　 　 　 　 　
谢活性的影响，通过测定融合子在 ｐＨ ３．５ ～ １０．０ 厌
氧发酵液 ３７ ℃培养 ２ ｄ 的表面张力与细胞干质量
来评价．
１􀆰 ５　 融合子 ＪＤ⁃３发酵液乳化性能及产物性质测定
１􀆰 ５􀆰 １测定发酵液乳化系数（ＥＩ２４）　 将 ５ ｍＬ发酵液
分别与 ５ ｍＬ新疆克拉玛依油田的原油、液体石蜡、
煤油、二甲苯、正庚烷混合，用微型涡旋器充分振荡，
避光静置过夜，乳化系数 ＥＩ２４即为乳化层高度与总
相高度之比乘以 １００％［１８］ ．乳化系数可以在一定程
度上反映发酵液的乳化能力．
１􀆰 ５􀆰 ２生物表面活性剂的提纯 　 将发酵液于 １００００
ｒ·ｍｉｎ－１离心 ２０ ｍｉｎ，冷冻离心去除菌体；用 ６
ｍｏｌ·Ｌ－１盐酸调 ｐＨ至 ２．０，４ ℃静置过夜后，离心收
集沉淀，加入氯仿 ／甲醇溶液（２ ∶ １，Ｖ ／ Ｖ）抽提两次，
合并有机相于旋转蒸发仪中减压蒸干，转移至样品
瓶冷冻真空干燥［１９］ ．
１􀆰 ５􀆰 ３薄层色谱（ＴＬＣ）分析　 将粗提物点样在硅胶
板上，以氯仿 ／甲醇（１０ ∶ ４，Ｖ ／ Ｖ）为展开剂，使层析
试剂移至距薄层板上端 ０．５ ～ １．０ ｃｍ 处，停止展层，
将薄板放平蒸干，以茚三酮显色剂均匀喷洒薄板．
１􀆰 ５􀆰 ４傅立叶红外变换光谱（ＦＴＩＲ）分析　 傅立叶红
外变换光谱是一种定性分析的工具，可在不破坏样
本的情况下检测有机物的分子组成和结构［２０］ ． 将表
面活性剂样品溶解在二氯甲烷中，采用傅里叶变换
红外光谱仪 （ ＮＩＣＯＬＥＴ３８０， ＵＳＡ），在 １００ ～ ４０００
ｃｍ－１区域对样品进行红外吸收光谱的扫描分析．
１􀆰 ５􀆰 ５临界胶束浓度（ＣＭＣ）的测定　 将提取的表面
活性剂粗品配置成 １０ ～ １２０ ｍｇ·Ｌ－１浓度梯度的表
面活性剂溶液，分别测定表面张力，绘制表面张力⁃
质量浓度曲线以求得 ＣＭＣ．
２　 结果与分析
２􀆰 １　 融合子的筛选
好氧血平板初筛获得 ３株产溶血圈菌株：ＪＤ⁃３、
ＪＤ⁃５、ＪＤ⁃６，好氧条件下可将表面张力由最初的 ６０．６
ｍＮ·ｍ－１降至 ２９．０ ｍＮ·ｍ－１以下，转至厌氧培养后，
仅融合子 ＪＤ⁃３在厌氧管中生长迅速，表面张力降低
到 ３２．５ ｍＮ·ｍ－１，其他两株融合子 ＪＤ⁃５ 和 ＪＤ⁃６ 在
厌氧条件下不生长．因此，选择 ＪＤ⁃３ 作为后续研究
对象．
２􀆰 ２　 融合子 ＪＤ⁃３菌落形态、１６Ｓ ｒＤＮＡ 序列及遗传
稳定性
ＪＤ⁃３在完全培养基上的菌落表面褶皱且黏稠，
乳白色，中央凸起，呈火山状，边缘圆整（图１ａ） ．
图 １　 融合子 ＪＤ⁃３ 的菌落形态（ ａ）及扫描电镜图片 （ ｂ）
（×２４０００）
Ｆｉｇ．１　 Ｃｏｌｏｎｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ＪＤ⁃３ （ａ） ａｎｄ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈ ｏｆ ＪＤ⁃３ （ｂ） （×２４０００）．
ＱｕａｎｔａＴＭ ２５０ 环境扫描电镜照片显示 ＪＤ⁃３ 为杆
状，大小约 １．０～ １．８ μｍ × ０．３ ～ ０．４ μｍ（图 １ｂ）．１６Ｓ
ｒＤＮＡ序列比对显示，ＪＤ⁃３ 的 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列更倾向
于亲本菌株解淀粉芽孢杆菌 ＢＱ⁃２，相似度为 ９９％． 连
续 １０次传代培养后，ＪＤ⁃３在厌氧条件下仍可快速生
长，且厌氧发酵液的表面张力降低到 ３５ ｍＮ·ｍ－１以
下，表现出了良好的遗传稳定性．
２􀆰 ３　 融合子的厌氧发酵
ＪＤ⁃３厌氧发酵结果见图 ２，ＯＤ６００值在 ０ ～ ３０ ｈ
迅速上升，此时 ＪＤ⁃３ 处于对数生长期，这一阶段的
表面张力也随之降低，并于 ２４ ｈ达到最低；３０～４５ ｈ
为稳定期，ＯＤ６００及表面张力值均较稳定；４５ ｈ 后，
ＯＤ６００值开始缓慢下降，该菌进入衰退期，表面张力
也相应升高，一部分表面活性剂可能被微生物利用．
综上可以判断，ＪＤ⁃３ 在厌氧环境下生长迅速，能快
速产生表面活性剂，降低发酵液表面张力．由于发酵
过程始终保持在氮气环境下，发酵液溶解氧一直
控制在 ０．４ ｍｇ·Ｌ－１浓度以下，保证了较好的厌氧
条件．
２􀆰 ４　 发酵液乳化指数 ＥＩ２４
ＪＤ⁃３发酵液对 ５ 种烃类化合物的乳化效果如
图 ３所示，乳化指数 ＥＩ２４为 ５３％ ～ ６０％，表明融合子
产生的生物表面活性剂对 ５种不同长度碳链的烃类
均具有良好的乳化活性，其中对新疆油田的原油乳
化活性最高．
６５５２ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
图 ２　 融合子 ＪＤ⁃３发酵液表面张力与菌体浓度变化及发酵
过程中溶解氧浓度及 ｐＨ变化
Ｆｉｇ．２　 Ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ｔｅｎｓｉｏｎ， ＯＤ６００， ＤＯ ａｎｄ ｐＨ ｄｕｒｉｎｇ
ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｆｕｓａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ＪＤ⁃３ ｉｎ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ．
Ⅰ： 表面张力 Ｓｕｒｆａｃｅ ｔｅｎｓｉｏｎ． 下同 Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ．
２􀆰 ５　 融合子对不同氮源及碳源的利用情况
融合子 ＪＤ⁃３ 对不同氮源及碳源的利用情况如
图 ４ 所示，有机氮源（酵母粉和胰蛋白胨）更利于
ＪＤ⁃３产生表面活性剂． 在有机氮源存在的条件下，
发酵液表面张力降幅较大，以酵母粉为唯一氮源
的发酵液表面张力降幅为 ２１．６ ｍＮ·ｍ－１，以胰蛋
白胨为唯一氮源的发酵液表面张力降幅为 ２５􀆰 ７
ｍＮ·ｍ－１，表明其产表面活性剂的功能较强，ＪＤ⁃３在
以蔗糖、玉米浆粉、葡萄糖为碳源时，发酵效果更佳，
发酵液表面张力降幅均大于 ２０ ｍＮ·ｍ－１ ．
图 ３　 ＪＤ⁃３发酵液对不同烃类的乳化活性
Ｆｉｇ．３　 Ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＪＤ⁃３ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｙｄｒｏｃａｒ⁃
ｂｏｎｓ．
Ａ： 原油 Ｃｒｕｄｅ ｏｉｌ； Ｂ： 液体石蜡 Ｌｉｑｕｉｄ ｐａｒａｆｆｉｎ； Ｃ： 煤油 Ｋｅｒｏｓｅｎｅ；
Ｄ： 二甲苯 Ｄｉｍｅｔｈｙｂｅｎｚｅｎｅ； Ｅ： 正庚烷 ｎ⁃ｈｅｐｔａｎｅ．
图 ４　 不同氮源及碳源对融合子 ＪＤ⁃３发酵液表面张力变化
的影响
Ｆｉｇ．４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ
ｏｎ ｆｕｓａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ＪＤ⁃３ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ．
ＣＫ： 对照 Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ａ： 酵母提取物 Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； Ｂ： 硝酸钠
ＮａＮＯ３； Ｃ： 硝酸铵 ＮＨ４ＮＯ３； Ｄ： 氯化铵 ＮＨ４Ｃｌ； Ｅ： 胰蛋白胨 Ｔｒｙｐ⁃
ｔｏｎｅ； Ｆ： 甘油 Ｇｌｙｃｅｒｏｌ； Ｇ： 蔗糖 Ｓｕｃｒｏｓｅ； Ｈ： 玉米浆粉 Ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ
ｐｏｗｄｅｒ； Ｉ： 糖蜜 Ｍｏｌａｓｓｅｓ； Ｊ： 大豆油 Ｓｏｙｂｅａｎ ｏｉｌ； Ｋ： 葡萄糖 Ｇｌｕｃｏｓｅ．
２􀆰 ６　 融合子在不同温度及 ｐＨ条件下的代谢活性
如图 ５所示，ＪＤ⁃３在 ２５ ～ ４５ ℃范围内，发酵液
表面张力均有明显下降，但在 ３５～ ４０ ℃时产物表面
张力最低．从菌体生长量来看，融合子在２５ ～ ３０ ℃
图 ５　 不同温度及 ｐＨ对融合子 ＪＤ⁃３生长的影响
Ｆｉｇ．５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｐＨ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｆｕｓａｎｔ
ＪＤ⁃３．
Ⅰ： 细胞干质量 Ｄｒｙ ｍａｓｓ ｏｆ ｃｅｌｌｓ； Ⅱ： 表面张力 Ｓｕｒｆａｃｅ ｔｅｎｓｉｏｎ．
７５５２８期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 梁小龙等： 厌氧产脂肽工程菌的构建及其代谢活性评价　 　 　 　 　 　
图 ６　 亲本 ＢＱ⁃２及融合子 ＪＤ⁃３表面活性粗提物的 ＴＬＣ图
Ｆｉｇ．６　 ＴＬＣ ｉｍａｇｅ ｏｆ ｃｒｕｄｅ ｓｕｒｆａｃｅ⁃ａｃｔｉｖｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ ｐａｒｅｎｔａｌ
ｓｔｒａｉｎ ＢＱ⁃２ ａｎｄ ｆｕｓａｎｔ ＪＤ⁃３．
条件下 ＪＤ⁃３生长缓慢，培养 ３ ｄ 发酵液菌体浓度最
大，所含细胞干质量约为 ８９６ ｍｇ·Ｌ－１，在 ３５～４５ ℃
时，菌体生长较快，约 １ ｄ 后，发酵液的菌体浓度达
到最大．ＪＤ⁃３在碱性环境下，发酵液表面张力降幅更
大，起始 ｐＨ为 ９ 时，发酵液表面张力最低，而在酸
性条件下，ＪＤ⁃３也能生长且产表面活性剂．表明 ＪＤ⁃３
能适应较广的 ｐＨ范围（３．５～９．５）．
２􀆰 ７　 产物提取及薄层色谱分析结果
取厌氧发酵罐 ３０ ｈ 的发酵液，采用酸沉降⁃有
机萃取的方法，提取了融合子 ＪＤ⁃３ 的发酵粗产物，
生物表面活性剂产量约为 １．０６２ ｇ·Ｌ－１ ．采用薄层色
谱分析分别对提取的亲本解淀粉芽孢杆菌 ＢＱ⁃２和
融合子 ＪＤ⁃３的表面活性物质的成分进行初步判别，
从图 ６可以看出，两菌株发酵液的提取产物在茚三
酮显色剂下均显红色，而在硫酸苯酚显色剂下不显
黄色，这证明 ＪＤ⁃３在厌氧条件下产生的表面活性剂
与解淀粉芽孢杆菌 ＢＱ⁃２在好氧条件下产生的表面
活性剂相同，均为脂肽类物质．
２􀆰 ８　 傅立叶红外变换光谱（ＦＴＩＲ）分析结果
为进一步确定分子的官能团结构，对 ＢＱ⁃２ 及
ＪＤ⁃３的发酵产物进行了红外光谱分析（图 ７）．两样
品分别在 ３３５１和 ３３０７ ｃｍ－１的吸收峰是分子间 Ｎ⁃Ｈ
键的伸缩振动，ＢＱ⁃２发酵产物在 １７２４、１４５８ ｃｍ－１与
ＪＤ⁃３发酵产物在 １７１６、１６４９ ｃｍ－１的吸收为酰胺键的
吸收谱带，表明两种表面活性剂均具有肽键；ＢＱ⁃２
发酵产物在 ２９２２～２８５０、１４５８～１３７０ ｃｍ－１与 ＪＤ⁃３发
酵产物在 ２９６５ ～ ２９２２、１５４２ ～ １３７８ ｃｍ－１的吸收为脂
肪碳链的 Ｃ⁃Ｈ 键伸缩振动；ＢＱ⁃２ 发酵产物在 １２６３
ｃｍ－１与 ＪＤ⁃３发酵产物在 １２６５ ｃｍ－１的吸收是内酯的
特定吸收峰，表明该两种表面活性剂分子的疏水基
为脂肪酸分子．因此，可判定该分子是脂肽类物质．
２􀆰 ９　 临界胶束浓度（ＣＭＣ）
将测得的不同浓度的表面活性剂溶液的表面张
图 ７　 亲本 ＢＱ⁃２ （ａ）及融合子 ＪＤ⁃３ （ｂ）表面活性粗提物的
红外光谱图
Ｆｉｇ． ７ 　 ＦＴＩＲ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｃｒｕｄｅ ｓｕｒｆａｃｅ⁃ａｃｔｉｖｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ
ｐａｒｅｎｔａｌ ｓｔｒａｉｎ ＢＱ⁃２ （ａ） ａｎｄ ｆｕｓａｎｔ ＪＤ⁃３ （ｂ）．
图 ８　 表面张力与表面活性物质浓度关系曲线
Ｆｉｇ．８　 Ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ⁃ａｃｔｉｖｅ ｓｕｂ⁃
ｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．
力，绘制成表面张力浓度曲线 （图 ８），在 ０ ～ ９０
ｍｇ·Ｌ－１表面活性剂浓度时，表面张力随着浓度增大
而逐渐下降至 ３４． ５ ｍＮ·ｍ－１，当表面活性剂浓度
＞９０ ｍｇ·Ｌ－１时，表面张力不再随表面活性剂浓度变
化，表明此表面活性物质的临界胶束浓度（ＣＭＣ）为
９０ ｍｇ·Ｌ－１ ．
３　 讨　 　 论
目前，关于微生物厌氧条件下合成表面活性剂
的机理研究不足，仅有研究显示微生物缺少厌氧合
成表面活性剂及其前提物质的代谢途径，或者某些
重要代谢途径在厌氧条件下受到抑制，导致菌株不能
８５５２ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷
在厌氧条件下正常生长并产生生物表面活性剂［２１－２３］ ．
迄今为止，已报道的在厌氧条件下产生生物表面
活性剂的微生物种类极少，莫哈韦芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ）ＪＦ⁃２是俄克拉荷马大学石油与地质工程实
验室 １９８３年从卡特县油田采出水中筛选出来的［２４］，
在厌氧条件下能够将发酵液表面张力降到 ３０
ｍＮ·ｍ－１ ［２５］，并针对该菌的厌氧产表面活性剂活性
进行了深入研究［２６－３１］，但因其厌氧产表面活性剂能
力需要添加辅助生长因子如寡核苷酸［２８，３１］，成本高
且重复性差，还不能进行现场应用［２８］ ．
原生质体融合技术可以使两亲本的菌体发生融
合，进而发生基因组重排，使融合子获得两亲本的优
良性状．采用非对称双亲灭活进行原生质体融合，省
去了为便于融合子筛选而使出发菌株获得稳定遗传
标记的过程，且不同灭活方式对原生质体的作用部
位不同［３２］，双亲原生质体非对称灭活后，只有与经
不同灭活方式灭活的另一亲本菌体发生融合，才能
再生，因此排除了双方亲本类型的融合株，提高了重
组融合子的筛选效率［３３－３４］ ．该方法已成功应用于生
物发酵［３５］、生物防治［３６］、食用真菌［３７］等领域，在微
生物提高采收率技术方面，已报道的研究主要在培
育耐高温及耐高矿化度菌株方面，例如，Ｓｕｎ 等［３８］
以最适温度为 ３０ ℃的产胞外多糖的阴沟肠杆菌
（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ） ＪＤ 及嗜热的 Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ 菌株
为亲本，通过原生质体融合构建了一株能在更高温
度下 （ ４５ ℃）产胞外多糖的融合子 ＺＲ３；宋绍富
等［３９］通过原生质体融合构建的工程菌比亲本的产
胞外多糖的温度提升了 １５ ℃，耐盐性提高了 ２ 倍．
但是，原生质体融合技术在厌氧表面活性剂产生菌
构建方面还未见报道．
本研究首次报道了通过原生质体融合构建厌氧
产生物表面活性剂工程菌，通过双亲灭活原生质体
融合的方法，使好氧产脂肽的解淀粉芽孢杆菌 ＢＱ⁃２
与厌氧生长迅速的施氏假单胞菌 ＤＱ⁃１ 发生融合，
获得一株在厌氧条件下产脂肽的融合子菌株 ＪＤ⁃３．
融合子 ＪＤ⁃３为兼性厌氧，在厌氧条件下生长迅速，
在 ３６ ｈ内可使发酵液的表面张力从 ６２􀆰 ７ 降到 ３２．５
ｍＮ·ｍ－１ ．且无特殊营养需求，即可产生表面活性剂．
ＪＤ⁃３能适应较宽的温度和 ｐＨ 环境条件，显示了
ＪＤ⁃３在不同油藏环境下的应用潜力．本研究首次报
道了运用原生质体融合技术构建厌氧产表面活性剂
的工程菌，为厌氧微生物驱油技术提供了重要的菌
种资源．
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ｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｏｉｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
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林）． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ
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波）， ｅｔ ａｌ． Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｗａｔｅｒ ｆｒｏｍ ｏｉｌ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒｓ ｉｎ Ｄａｑｉｎｇ ｏｉｌｆｉｅｌｄ． Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒ⁃
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宏）， ｅｔ ａｌ． Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｅｎｄｏ⁃
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Ｋ （杨颐康）， ｅｔ ａｌ． Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ
ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ
ｈｅａｔ⁃ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ． Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒ⁃
ｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （生物工程学报）， １９８８， ４（４）：
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［３４］　 Ｌｉ Ｍ （李　 淼）， Ｚｅｎｇ Ｂ⁃Ｑ （曾柏全）， Ｆｅｎｇ Ｊ⁃Ｒ （冯
金儒）． Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉ⁃
ｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ Ｑ５ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｋ３． Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （中
南林业科技大学学报）， ２０１３， ３３（１２）： １７４－１８０ （ ｉｎ
Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［３５］　 Ｘｕｅ Ｚ⁃Ｌ （薛正莲）， Ｌｉｕ Ｙ （刘 　 阳）， Ｗａｎｇ Ｚ （王
洲）， ｅｔ ａｌ． Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｅｓｔｅｒｉｆｙｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ． Ｃｈｉｎａ Ｂｉｏ⁃
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （中国生物工程杂志）， ２０１３， ３３（８）： ４３－
４８ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［３６］　 Ｚｈａｏ ＪＦ， Ｌｉ ＹＨ， Ｚｈａｎｇ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｍｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＦＱ ＲＴ⁃ＰＣＲ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ＆
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０１２， ３９： ８８９－８９６
［３７］　 Ｈｕｏ Ｇ⁃Ｈ （霍光华）， Ｓｕｎ Ｊ⁃Ｊ （孙娇娇）， Ｌｕｏ Ｇ⁃Ｘ （罗
桂祥）， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｌａｃｔａｒｉｕｓ
ｄｅｌｉｃｉｏｓｕｓ ａｎｄ Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ ｆｕ⁃
ｓａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （中国食品学报）， ２０１４， １４（１）： ３９－
４６ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［３８］　 Ｓｕｎ ＳＳ， Ｌｕｏ ＹＪ， Ｃａｏ ＳＹ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖａｌｕ⁃
ａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｂａｃ⁃
ｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ ｂｙ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｎｈａｎｃｅｄ
ｏｉｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ． Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０１３， １４４： ４４－４９
［３９］　 Ｓｏｎｇ Ｓ⁃Ｆ （宋绍富）， Ｚｈａｎｇ Ｚ⁃Ｚ （张忠智）， Ｙｕ Ｌ （俞
理）， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｏｒ
ＭＥＯＲ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ． Ｏｉｌｆｉｅｌｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （油
田化学）， ２００４， ２１（２）： １８７－１９０ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ）
作者简介　 梁小龙， １９８９年生， 男， 硕士研究生． 主要从事
采油微生物菌种资源研究． Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｌｉａｎｇｘｉａｏｌｏｎｇ１２＠ ｍａｉｌｓ．
ｕｃａｓ．ａｃ．ｃｎ
责任编辑　 肖　 红
０６５２ 应　 用　 生　 态　 学　 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ２６卷