全 文 ：第 １４卷第 ３期
２０１６年 ５月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １４ Ｎｏ􀆰 ３
Ｍａｙ ２０１６
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１６􀆰 ０３􀆰 ００９
收稿日期：２０１６－０２－０４
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１３ＡＡ０６４４０２）；国家自然科学基金（４１３７３０７４）
作者简介：李燕淑（１９９１—），女，河北雄县人，研究方向：石油微生物；马　 挺（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｔｉｎｇｍａ＠ ｎａｎｋａｉ．ｅｄｕ．ｃｎ
枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １强化内源
微生物驱油模拟实验
李燕淑１，李　 彦１，高配科１，代学成２，田会梅１，刘雪莲３，常　 宁３，李国强１，马　 挺１
（１． 南开大学 生命科学学院 分子微生物学与技术教育部重点实验室，天津 ３０００７１；
２． 新疆油田实验检测研究院，新疆 克拉玛依 ８３４０００；
３． 大庆油田责任有限公司 第二采油厂 第一作业区，黑龙江 大庆 １５００００）
摘　 要：以分离自油藏环境的产脂肽枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １为研究对象，探究了外源表面活性剂产生菌强化油
藏内源微生物驱油过程中的原油乳化分散效果和菌群间的相互作用。 配伍性实验表明，该菌株与油藏常见采油功
能菌———迪茨氏菌、红球菌和肠杆菌具有良好的配伍性。 荧光定量 ＰＣＲ和高通量测序分析结果表明，枯草芽胞杆
菌 Ｍ１５ １０ １对内源菌群结构无不利影响。 摇瓶激活实验和气象色谱分析结果显示，枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １
能够显著改善内源菌群激活初期油相乳化分散效果，促进原油降解，为后续广泛应用于现场试验提供基础。
关键词：枯草芽胞杆菌；生物强化；内源微生物；微生物驱油；原油乳化
中图分类号：ＴＥ３　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１６）０３－００４６－０７
Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｆｌｏｏｄｉｎｇ ｂｙ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＬＩ Ｙａｎｓｈｕ１，ＬＩ Ｙａｎ１，ＧＡＯ Ｐｅｉｋｅ１，ＤＡＩ Ｘｕｅｃｈｅｎｇ２，ＴＩＡＮ Ｈｕｉｍｅｉ１，ＬＩＵ Ｘｕｅｌｉａｎ３，
ＣＨＡＮＧ Ｎｉｎｇ３，ＬＩ Ｇｕｏｑｉａｎｇ１，ＭＡ Ｔｉｎｇ１
（１．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｋａｉ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３０００７１，Ｃｈｉｎａ； ２． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｏｉｌ Ｆｉｅｌｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｋａｒａｍａｙ ８３４０００，Ｃｈｉｎａ；
３． Ｔｈｅ １ｓｔ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｏｉｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｐｌａｎｔ，Ｄａｑｉｎｇ Ｏｉｌ Ｆｉｅｌｄ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｄａｑｉｎｇ １５００００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｅ ｕｓｅｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１５⁃１０⁃１ ａｓ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｂｊｅｃｔ． Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１５⁃１０⁃１ ｉｓ
ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｃａｎ ｐｒｏｄｕｃｅ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ． Ｗｅ ｅｘｐｌｏｒｅｄ ｔｈｅ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ
ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｏ ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｆｌｏｏｄｉｎｇ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ
ｃｒｕｄｅ ｏｉｌ ｅｍｕｌｓｉｏｎ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆｌｏｒａ． Ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１５⁃１０⁃１ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｉｌ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ， Ｄｉｅｔｚｉａ ｓｐ． ＺＱ⁃４，
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｍ，ａｎｄ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ Ｔ⁃１ ｈａｓ ｇｏｏｄ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ． Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ
ａｎｄ ｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１５⁃１０⁃１ ｗａｓ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ
ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｄｖｅｒｓｅ ｉｍｐａｃｔ． Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｉｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ
ｍｅｔｅｏｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１５⁃１０⁃１ ｃｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅ
ｔｈｅ ｏｉｌ ｗａｔｅｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｏｉｌ ｐｈａｓｅ ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ
ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｆｉｅｌｄ ｔｅｓｔ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ； ｂｉｏ⁃ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ； ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ ｍｉｃｒｏ⁃ｏｒｇａｎｉｓｍｓ； ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｆｌｏｏｄｉｎｇ；
ｏｉｌ ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ
　 　 油藏是一个缺氧、寡营养的极端环境，但其中
蕴含丰富的微生物群落［１－２］。 内源微生物采油技术
就是通过注入营养剂，激活油藏微生物的生长和代
谢，产生生物表面活性剂、生物聚合物、有机酸和气
体等物质，改善原油流动性，提高石油采收率［３－４］。
由于油藏的极端环境，营养物质对内源微生物的激
活需要一个漫长过程，这极大地制约了油藏内源微
生物的作用效果［５］。 如果将营养物质和由其他油
田分离的高效采油功能菌一同注入油藏储层中，外
源采油功能菌的快速生长和驱油物质的迅速生成
是否会对油藏内源微生物的激活和代谢产生较大
促进作用？
据此，本文中，笔者以分离自油藏环境的 １株产
脂肽枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １ 为研究对象，首先
探究了该菌株的生长和代谢对油藏常见采油功能
菌———红球菌、迪茨氏菌、肠杆菌的影响，然后将菌
株Ｍ１５ １０ １ 用于强化激活油藏内源微生物驱油
实验，进而从原油乳化分散、原油降解组分和菌群
结构变化等角度探究了枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １
强化激活油藏内源微生物的驱油效果，以期为微生
物驱油现场试验提供参考。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 油水样采集与分析
实验所用油水样采集自新疆陆梁油田中温水
驱油藏 ３０３７ 采油井。 该油藏深度约为 １ ２００ ｍ，
地层温度 ４０ ℃。 地层压力为 １０􀆰 ２ ＭＰａ，孔隙度达
２９􀆰 ９％。 油水样的理化性质经分析，其中氮、磷营
养盐含量极低，分别为 １２􀆰 ７ 和 １８􀆰 １ ｍｇ ／ Ｌ，是制约
油藏内源微生物生长代谢的主要限制性营养
因子。
１􀆰 １􀆰 ２　 菌种
枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １ 分离自大庆油田二
厂某区块采出液；红球菌 Ｍ、迪茨氏菌 ＺＱ ４ 和肠
杆菌 Ｔ １来源于笔者所在实验室保藏菌种。
１􀆰 １􀆰 ３　 培养基
ＬＢ培养基（ｇ ／ Ｌ）：酵母粉 ５，蛋白胨 １０，ＮａＣｌ １０。
无机盐培养基 （ ｇ ／ Ｌ）：Ｎａ２ ＨＰＯ４ ０􀆰 ６，ＫＨ２ ＰＯ４
０􀆰 ２，ＮａＮＯ３ ４，ＣａＣｌ２ ０􀆰 ０１，ＦｅＳＯ４ ０􀆰 ０１，ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ３，
酵母粉 ０􀆰 ２，ｐＨ ７􀆰 ２；
以上培养基均用蒸馏水配制，调 ｐＨ 至 ７􀆰 ２ 后
１２１ ℃灭菌 ３０ ｍｉｎ。
激活实验培养基（ｇ ／ Ｌ）：（ＮＨ４） ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ ２，
ＮａＮＯ３ ４，原油 ２０，葡萄糖、甘油、糖蜜或玉米浆 ２；
ｐＨ ７􀆰 ２。 采用产出水配制培养基，不必灭菌。
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １的鉴定
提取纯化菌株的基因组 ＤＮＡ，以基因组 ＤＮＡ
为模板，利用 ２７Ｆ 和 １５４１Ｒ 引物进行 ＰＣＲ 扩增反
应。 ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳检测，切胶纯化后
送至华大基因公司进行测序。 测序结果采用
ＢＬＡＳＴ软件分析，与 ＧｅｎＢａｎｋ 中 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因进
行同源性比对。 应用 ＭＥＧＡ ５􀆰 ０ 软件计算遗传距
离，通过 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｊｏｉｎｉｎｇ 距离距阵法构建系统发
育树状图［６］。 以基因组 ＤＮＡ为模板，利用 ｓｒｆＡ Ｆ和
ｓｒｆＡ Ｒ引物扩增产脂肽基因 ｓｒｆＡ，利用以上方法建
立 ｓｒｆＡ基因的系统发育树状图。
枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １ 强化内源微生物驱
油进行模拟实验后，使用 ＪＫ９９Ｂ 型全自动界面张力
仪测量表面张力，通过与激活培养前产出水中表面
张力大小的对比，进一步确定菌株 Ｍ１５ １０ １ 是
否可产生表面活性剂———脂肽。
１􀆰 ２􀆰 ２　 油藏微生物群落微环境的建立
人工模拟枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １、红球菌
Ｍ、迪茨氏菌 ＺＱ ４、肠杆菌 Ｔ １ 微生物共生菌群。
首先制备上述 ４ 种菌的种子液，在含有 ５ ｍＬ ＬＢ 培
养基的试管中培养 ４ 种菌，４０ ℃、１８０ ｒ ／ ｍｉｎ 条件下
过夜培养。 然后取 １ ｍＬ 菌液接入含有 １００ ｍＬ ＬＢ
培养基的 ２５０ ｍＬ 锥形瓶中扩大培养 １２ ｈ。 将 ４ 种
菌的种子液分别以相同接种量接入含有 １００ ｍＬ ＬＢ
培养基和 １００ ｍＬ 无机盐培养基的 ２５０ ｍＬ 锥形瓶
中。 实验组一：４ 种菌接种量 １ ｍＬ；实验组二：４ 种
菌接种量 １０ μＬ；对照组：在 ＬＢ 培养基和 ＢＳＭ培养
基中分别单独培养枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １，接种
量为 １００ μＬ，每组做 ２ 个平行。 实验在 ４０ ℃条件
下振荡培养 １５ ｄ，转速为 １２０ ｒ ／ ｍｉｎ。 分别在 ８、１７、
２８、７２、１６８、２６４和 ３３６ ｈ 保存菌液 １ ｍＬ。 使用磁珠
研磨法提取基因组，利用实时荧光定量 ＰＣＲ方法定
量群落丰度。
７４　 第 ３期 李燕淑等：枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １强化内源微生物驱油模拟实验
１􀆰 ２􀆰 ３　 枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １ 强化内源微生
物驱油模拟实验
选用以葡萄糖、甘油、糖蜜和玉米浆为碳源的
激活实验培养基，实验水样选用陆梁油田 ３０７３ 井的
产出水。 枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １ 首先在含 ２
ｇ ／ Ｌ葡萄糖的无机盐培养基中培养 １６ ｈ，然后按 ５％
（体积分数）接种量接入含 ６ ｇ ／ Ｌ葡萄糖的无机盐培
养基中培养。 将液体离心收集菌体后用等体积不
含原油的无机盐培养基重悬制得菌剂。 根据产出
水中微生物浓度确定枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １ 的
加入量，将菌剂接入含 １００ ｍＬ 激活实验培养基的
２５０ ｍＬ锥形瓶中，锥形瓶用胶塞封口以保持缺氧环
境，置于 ４０ ℃、１８０ ｒ ／ ｍｉｎ条件下振荡培养。 培养后
保存菌液，使用磁珠研磨法提取基因组 ＤＮＡ，以备
后续进行荧光定量 ＰＣＲ反应和高通量测序。
１􀆰 ２􀆰 ４　 基因组的提取
基因组提取使用磁珠研磨法。 菌液在 １２ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ条件下离心 １ ｍｉｎ，沉淀的菌体用 ６００ ｍＬ 裂
解缓冲液悬浮沉淀后加入研磨管，在研磨管中加
入 ０􀆰 ２ ｇ 磁珠。 利用研磨机进行研磨，冰浴交替 ３
ｍｉｎ。 再加入 １ ｍｇ ／ ｍＬ 溶菌酶 ５０ μＬ，４０ ℃水浴 １
ｈ，之后加入 １２０ μＬ １００ ｇ ／ Ｌ ＳＤＳ，６５ ℃水浴 １ ｈ。
接着使用 ＡｘｙＰｒｅｐＴＭ基因组 ＤＮＡ 小提试剂盒完成
操作。 所提基因组保存于－８０ ℃条件下，以便进
行后续分析。
１􀆰 ２􀆰 ５　 实时荧光定量 ＰＣＲ
荧光定量 ＰＣＲ 反应所用引物如表 １ 所示。 经
检测，枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １、红球菌 Ｍ、迪茨氏
菌 ＺＱ ４和肠杆菌 Ｔ １这 ４对引物具有特异性，只
对目的菌具有特异性扩增。 细菌分子标记 １６Ｓ
ｒＲＮＡ基因被用来检测激活实验培养基中油藏内源
微生物总菌群丰度，分子标记 ａｌｋＢ 基因用来评估烃
降解菌菌群丰度。 荧光定量 ＰＣＲ 标准曲线由重组
质粒建立。 将引物扩增的 ＰＣＲ产物纯化后，连接于
Ｔ１载体上，转化至大肠杆菌中，挑取转化后平板上
的白色单克隆提取质粒 ＤＮＡ，测序确定插入片段正
确。 测定质粒 ＤＮＡ浓度，绘制标准曲线。 针对不同
基因构建相对应的重组质粒［７］。 将重组质粒梯度
稀释至 １０２ ～ １０８，以稀释样品作为模板进行荧光定
量 ＰＣＲ反应，标准偏差（ ＳＤ）和变异系数（ＣＶ，％）
在规定范围内，且标准曲线具有较好的精确度和良
好的重复性。 利用此标准品进行荧光定量 ＰＣＲ 反
应，经过数据分析，得出最终定量结果。 荧光定量
ＰＣＲ程序在 ９５ ℃变性 ２ ｍｉｎ，接着 ９４ ℃反应 ３０ ｓ，
退火 ３０ ｓ，７２ ℃延伸 ３０ ｓ，共进行 ３０ 个循环。 荧光
采集在 ７２ ℃延伸阶段进行。
表 １　 实时荧光定量 ＰＣＲ引物
Ｔａｂｌｅ １　 Ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ
类别 引物 序列（５′→３′） 退火温度 ／ ℃ ＤＮＡ片段长度 ／ ｂｐ
枯草芽胞杆菌
Ｍ１５ １０ １
ｓｒｆＦ ＣＡＡ ＡＡＴ ＣＧＣ ＡＧＣ ＡＴＡ ＣＣＡ ＣＴＴ ＴＧＡ Ｇ
ｓｒｆＲ ＡＧＣ ＧＧＣ ＡＣＡ ＴＡＴ ＴＧＡ ＴＧＣ ＧＧＣ ＴＣ
５５ ２３８
红球菌 Ｍ
ＨＱ６２ ＡＧＴ ＧＧＧ ＣＧＣ ＴＣＧ ＣＣＣ ＣＧＴ ＣＧＴ ＴＣＴ ＡＣ
ＨＱ３４４ ＣＡＣ ＧＡＧ ＡＴＡ ＣＧＧ ＣＧＣ ＧＡＴ ＣＧＡ ＣＡＧ ＡＣ
６０ ２８３
迪茨氏菌 ＺＱ ４
Ａｌｇ１０７ ＧＴＣ ＣＡＣ ＣＡＣ ＧＡＡ ＧＣＡ ＧＣ
Ａｌｇ５４３ ＣＣＴ ＡＣＡ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＣＡ ＡＡＣ ＴＧ
５５ ４３７
肠杆菌 Ｔ １
８９５ ｕ ＧＧＣ ＡＧＣ ＧＴＧ ＴＣＡ ＡＡＣ ＴＣＡ Ａ
８９５ ｌ ＴＴＴ ＡＣＣ ＧＡＣ ＧＧＣ ＴＣＡ ＣＡＧ ＡＴ
５５ ２０３
１６Ｓ ｒＲＮＡ基因
８ｆ ＡＧＡ ＧＴＴ ＴＧＡ Ｔ（ＣＴ）（ＡＣ） ＴＧＧ ＣＴＣ
３３８Ｒ ＧＣＴ ＧＣＣ ＴＣＣ ＣＧＴ ＡＧＧ ＡＧＴ
５５ ３３０
ａｌｋＢ基因
ａｌｋＢｗｆ ＡＡＹ ＣＡＮＧＣＮ ＣＡＹ ＧＡＲ ＣＴＮ ＧＧＶ ＣＡＹ ＡＡ
ａｌｋＢｗｒ ＧＣＲ ＴＧＲ ＴＧＲ ＴＣＨ ＧＡＲ ＴＧＮ ＣＧＹ ＴＧ
５５ ６８１
１􀆰 ２􀆰 ６　 高通量测序
高通量测序样品提取基因组 ＤＮＡ，采用微生物
通用引物 ５１５ｆ （ ＧＴＧＣＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ） 和
８０６ｒ（ＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ）扩增细菌 １６Ｓ
ｒＲＮＡ基因的 Ｖ４区（３００～３５０ ｂｐ）。 ＰＣＲ反应条件参
照文献［８］。 ＰＣＲ产物经纯化后送至北京诺禾致源有
限公司的 Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ平台上进行测序，序列数据存
储于 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ。
８４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
数据分析使用专门进行微生物群落分析的
ＱＩＩＭＥ 软件，该软件用于分析和解释真菌、病毒、
细菌和古细菌群落核酸数据。 利用软件对测序数
据进行总体过滤，再利用 ＵＰＡＲＳＥ ｐｉｐｅｌｉｎｅ 将序列
进行聚类分析，ＯＴＵｓ 相似度大于 ９７％归为一类，
使用 ＲＤＰ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ 进行物种注释，确定序列对应
微生物的分类学地位，用柱状图表示每个样品的
构成。
１􀆰 ２􀆰 ７　 石油烃组分 ＧＣ ＭＣ气质色谱分析
参照 ＧＢ ／ Ｔ １８６０６—２００１《气相色谱质谱法测定
沉积物和原油中生物标志物》对微生物作用前后的
石油烃组分进行分析。 对于残油的处理按照文献
所描述方法进行［９］。 残余原油经氯仿萃取 ２ 次后，
使用硅胶氧化铝层析柱将残油分为饱和烃、芳香
烃、沥青质和非烃物质。 使用 Ａｇｉｌｅｎｔ７８９０ ５９７５ｃ
气相色谱质谱联用仪进行后续分析。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 枯草芽胞杆菌的鉴定
图 １是枯草芽胞杆菌系统发育进化树。 由图 １
可知，菌株 Ｍ１５ １０ １的 １６Ｓ ｒＲＮＡ与枯草芽胞杆
菌相似度达 ９９％。 经鉴定该菌含有 ｓｒｆＡ———产脂肽
基因，表明菌株 Ｍ１５ １０ １ 是 １ 株含有 ｓｒｆＡ 的枯
草芽胞杆菌。
图 １　 枯草芽胞杆菌Ｍ１５ １０ １系统发育分类图及 ｓｒｆＡ系统发育分类图
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｓｒｆＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１５⁃１０⁃１ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ
　 　 通过测定激活前后油水样的表面张力变化，确
定枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １ 可产生表面活性
剂———脂肽，结果如表 ２所示。 由表 ２可知：产出水
经过激活培养后，表面张力从 ６０􀆰 ３ ｍＮ ／ ｍ降至 ３２􀆰 ９
ｍＮ ／ ｍ，而单独发酵培养枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １，
所得发酵液表面张力经测得为 ２９􀆰 ５ ｍＮ ／ ｍ。 由此
可知 Ｍ１５ １０ １ 在生长过程中可产生表面活性
剂———脂肽。
２􀆰 ２　 枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １ 对模拟微生物群
落的影响
　 　 实时荧光定量 ＰＣＲ 结果如图 ２ 所示。 由图 ２
可知：在 ＬＢ 培养基中，对照组中枯草芽胞杆菌
Ｍ１５ １０ １的生长曲线与实验组 ４ 种菌混合培养
时的生长曲线基本一致，表明菌株 Ｍ１５ １０ １ 的
生长不受油藏 ３ 种功能菌［１０］（红球菌 Ｍ、迪茨氏菌
ＺＱ ４［１１］和肠杆菌 Ｔ １）的影响，且对其他 ３ 种菌
的生长无抑制效应。 在 ＢＳＭ培养基中，尽管枯草芽
胞杆菌Ｍ１５ １０ １不能利用原油生长，通过图 ２可
知，在 ４种菌混合培养时，其菌量有所增加，表明菌
株 Ｍ１５ １０ １可以利用其他 ３ 种菌所产代谢产物
生长。 ４ 种菌混合培养结果说明，枯草芽胞杆菌
Ｍ１５ １０ １的生长及代谢产物对其他 ３ 类油藏功
能菌的生长影响甚微，且可利用其他烃降解菌的代
谢产物在含油培养基中生长。
９４　 第 ３期 李燕淑等：枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １强化内源微生物驱油模拟实验
表 ２　 激活前后油水样表面张力变化
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｓｕｒｆａｃｅ ｔｅｎｓｉｏｎ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｗａｔｅｒ ｓａｍｐｌｅｓ
ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ ｏｒ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
ｗｉｔｈ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１５⁃１０⁃１
组名 表面张力 ／（ｍＮ·ｍ－１）
未培养前产出水 ６０􀆰 ３
培养后产出水（＋营养＋菌株 Ｍ１５ １０ １） ３２􀆰 ９
枯草 Ｍ１５ １０ １发酵液 ２９􀆰 ５
图 ２　 ４种典型的采油微生物混合培养生长曲线
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ１５⁃１０⁃１，
Ｄｉｅｔｚｉａ ｓｐ．ＺＱ⁃４，Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｍ，ａｎｄ
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ ＦＹ⁃０７
Ｇ—以葡萄糖为碳源实验组；Ｃ—以玉米浆为碳源组；ＡＧ和 ＡＣ—只加入营养剂；
ＢＧ和 ＢＣ—加入营养剂和原油；ＣＧ和 Ｃｃ—加入营养剂、原油和枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １
图 ３　 外源菌强化激活摇瓶实验
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｏｉｌ ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ ｏｒ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
２􀆰 ３　 外源菌与营养剂协同作用对石油乳化和降解
的影响
　 　 根据产出水中微生物浓度确定外源菌———枯草
芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １的加入量为 ５ ｇ ／ Ｌ（图 ３）。 由
图 ３可知：在 ＡＧ组和 ＢＧ组中原油乳化效果，以葡萄
糖为碳源，可以激活内源微生物的生长（ＡＧ），但对于
提高原油的乳化却无明显效果（ＢＧ），但当加入枯草
芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １后，能很好地改善原油乳化分
散效果（ＣＧ）。 以玉米浆为碳源的实验组，不仅可以
激活油藏内源微生物的生长（ＡＣ），还可明显促进石
油的乳化分散（ＢＣ），但是仍存在原油挂壁现象。 加
入菌株 Ｍ１５ １０ １后（Ｃｃ），乳化分散原油效果进一
步得到改善，油水样均匀，分层现象消失。 该组实验
结果表明外加枯草芽胞杆菌Ｍ１５ １０ １能够有效强
化内源微生物激活过程中原油的乳化分散。
图 ４是利用气相色谱质谱联用仪分析原油烃降
解组分。 由图 ４可知：以葡萄糖为碳源（ＢＧ）的体系
不能有效降解原油烃，枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １
（ＣＧ）的加入起到加速原油烃的降解作用，烃含量明
显减少，且图 ３的 ＣＧ组结果同样证实该作用。 而在
玉米浆为碳源的条件下，添加营养物质（Ｂｃ）可达到
原油烃降解的效果，但是枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １
的加入不仅使脂肪烃明显降解（Ｃｃ），对于姥鲛烷和
植烷烃的降解同样起到促进作用，两者含量下降。 实
验结果表明利用油田常用的廉价碳源玉米浆，结合外
源表面活性剂产生菌—枯草芽胞杆菌Ｍ１５ １０ １的
生长和代谢，两者协同作用可进一步定向激活油藏内
源菌的生长以及对原油的乳化和降解。
２􀆰 ４　 枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １ 对油藏微生物群
落的响应
　 　 以葡萄糖、甘油、糖蜜和玉米浆为碳源的激活
实验培养基中菌群实时荧光定量 ＰＣＲ 结果如图 ５
所示。 由图 ５可知：各实验组中 １６Ｓ ｒＲＮＡ拷贝数都
达到 １０８数量级以上，高于对照组中 １６Ｓ ｒＲＮＡ 拷贝
数，表明营养物质可以激活油藏内源微生物生
长［１２］。 虽然以葡萄糖和甘油为碳源可以激活内源
微生物生长，但由于该营养不能使内源菌产生大量
表面活性剂，因此需要外加菌株 Ｍ１５ １０ １，利用
其生长和代谢作用促进原油的乳化。 而油田常用
廉价碳源糖蜜和玉米浆，不仅可以激活内源微生物
０５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
　 　 　 　 　
Ｇ—葡萄糖； ｃ—玉米浆； Ｂ—加入营养剂和原油；
Ｃ—加入营养剂、原油和枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １
图 ４　 激活前后原油气相色谱图
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｔｏｔａｌ
ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｄｕｒｉｎｇ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ ｏｒ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
ｍ—糖蜜；ｃ—玉米浆；Ｇ—葡萄糖；ｇ—甘油；Ａ—只加营养剂；Ｂ—加入营养剂和原油；
Ｃ—加入营养剂、原油和枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １；Ｃｏｎｔｒｏｌ—无添加
图 ６　 Ｌｕ３０７３井采出液激活实验聚类分析图
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｇｒａｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｌｕ３０７３
ｗａｔｅｒ ｓａｍｐｌｅｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ ｏｒ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
生长，加入外源菌枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １ 后，还
可增加表面活性剂的产生，进一步协同作用定向加
速原油的乳化和降解。 并且，枯草芽胞杆菌 Ｍ１５
１０ １ 的加入对内源菌的生长也并未产生不利
影响。
ｍ—糖蜜； ｃ—玉米浆； Ｇ—葡萄糖； ｇ—甘油； Ａ—只加营养剂；
Ｂ—加入营养剂和原油； Ｃ—加入营养剂、原油和枯草芽胞杆菌
Ｍ１５ １０ １； ＣＫ—无添加
图 ５　 １６Ｓ ｒＲＮＡ和 ａｌｋＢ荧光定量 ＰＣＲ
基因拷贝数柱状图
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｓ ａｎｄ ａｖｅｒａｇｅ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ
１６Ｓ ｒＲＮＡ ａｎｄ ａｌｋＢ ｇｅｎｅｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ
ｗａｔｅｒ ｓａｍｐｌｅｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ ｏｒ
ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
高通量测序结果进行聚类分析，同样反映出在
不同碳源条件下枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １ 对油藏
微生物群落的响应。 图 ６为油藏微生物群落的系统
１５　 第 ３期 李燕淑等：枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １强化内源微生物驱油模拟实验
发育进化树。 由图 ６可知：不同碳源条件下，微生物
菌群多样性和丰度有差异。 与对照组相比，加入营
养物质（ＡＧ、Ａｇ、ＡＣ、ＡＭ）可激活内源微生物生长，
使微生物群落结构多样性出现变化。 在此基础上，
外加原油烃实验组（ＢＧ、Ｂｇ、ＢＣ、ＢＭ）和枯草芽胞杆
菌 Ｍ１５ １０ １ 实验组（ＣＧ、Ｃｇ、ＣＣ、ＣＭ）中微生物
群落的组成和丰度变化较小。 荧光定量 ＰＣＲ 反应
和高通量测序结果说明枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １
的生长及代谢所产表面活性剂脂肽对于油藏内源
微生物无抑制作用。 相反地，枯草芽胞杆菌 Ｍ１５
１０ １通过其生长和代谢促进原油烃的乳化，乳化后
的原油可作为碳源与营养物质协同定向激活油藏
内源微生物，增强对原油乳化和降解作用，有利于
提高原油采收率。
３　 结论
在实验室条件下，以分离自油藏环境的产脂肽
菌———枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １ 为研究对象，探
究了枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １ 强化油藏内源微生
物驱油过程中的原油乳化分散效果和菌群间相互
作用。 配伍性实验表明，枯草芽胞杆菌 Ｍ１５ １０ １
可与其他三类内源菌共同生长；荧光定量 ＰＣＲ和高
通量测序分析表明该菌对内源菌群无不利影响；摇
瓶激活实验和气象色谱分析结果说明枯草芽胞杆
菌 Ｍ１５ １０ １能够显著改善内源菌群激活初期油
相乳化分散效果，促进原油烃降解，促进油藏内源
烃降解菌的生长。 该方法为后续广泛应用于现场
试验提供基础。
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（责任编辑　 荀志金）
２５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷