全 文 ：长期连作对大豆根际土壤镰孢菌种群的影响*
魏摇 巍1,2 摇 许艳丽1**摇 朱摇 琳3 摇 张思佳1,2 摇 李淑娴4
( 1中国科学院东北地理与农业生态研究所黑土区农业生态院重点实验室, 哈尔滨 150081; 2中国科学院大学, 北京 100049;
3东京大学应用生命工学专攻, 东京 1138657; 4United States Department of Agriculture鄄Agricultural Research Service Crop Genetics
Research Unit, Stoneville 38776, MS, USA)
摘摇 要摇 利用中国科学院海伦农业生态试验站大豆连作长期定位试验区,进行了大豆根际土
壤镰孢菌分离鉴定及大豆根腐病致病力检测,结合核酸序列和限制性片段长度多态性
(RFLP)的系统发育分析,研究了长期连作(20 年)较短期连作(3 年)对大豆根际土壤镰孢菌
种群密度和结构、致病力及遗传多样性的影响.结果表明: 3 年连作大豆根际土壤镰孢菌种群
密度为 6. 0伊104 CFU·g-1,且以强致病力的尖镰孢菌、禾谷镰孢菌、轮枝镰孢菌及中等致病力
的腐皮镰孢菌为优势种;连作 20 年大豆根际土壤镰孢菌种群密度和优势菌的优势度均显著
低于 3 年连作,其中尖镰孢菌、禾谷镰孢菌和腐皮镰孢菌的种群密度仅为 3 年连作的 36% 、
32%和 22% ,没有分离到致病力最高的轮枝镰孢菌,而种群多样性和均匀度显著高于 3 年连
作;仅分离自 20 年连作土壤的三线镰孢菌、砖红镰孢菌及燕麦镰孢菌均为非致病菌种,且与
强致病力镰孢菌种在基于转录间隔区( ITS)和转录延长因子(EF鄄1琢)序列的聚类分析中显示
了系统进化亲缘关系的差异性. 因此,大豆 20 年连作会导致根际土壤镰孢菌种群生长受抑
制、使其种群结构和遗传多样性发生改变,同时降低大豆根腐病菌种群致病力.
关键词摇 长期连作摇 大豆根腐病摇 镰孢菌摇 致病力摇 遗传多样性
*中国科学院知识创新工程重要方向项目(kzcx2鄄yw鄄408鄄3)资助.
**通讯作者. E鄄mail: xyll@ neigaehrb. ac. cn
2013鄄05鄄17 收稿,2013鄄12鄄01 接受.
文章编号摇 1001-9332(2014)02-0497-08摇 中图分类号摇 Q938. 1摇 文献标识码摇 A
Impact of long鄄term continuous cropping on the Fusarium population in soybean rhizo鄄
sphere. WEI Wei1,2, XU Yan鄄li1, ZHU Lin3, ZHANG Si鄄jia1,2, LI S4 ( 1Key Laboratory of Molli鄄
sols Agroecology, Northeast Institute of Geography and Agroecology, Chinese Academy of Sciences,
Harbin 150081, China; 2Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, Chi鄄
na; 3Department of Biotechnology, University of Tokyo, Tokyo 1138657, Japan; 4Crop Genetics Re鄄
search Unit, United States Department of Agriculture鄄Agricultural Research Service, Stoneville 38776,
MS, USA) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. , 2014, 25(2): 497-504.
Abstract: The impact of long鄄term continuous cropping on the Fusarium population abundance and
diversity, pathogenicity and phylogeny in soybean field were analyzed by using isolation, morpho鄄
logical identification, pathogenicity test, sequencing analysis and molecular marker with restricted
fragment length polymorphisms (RFLP). The soybean field was located at the Hailun Experimental
Station of Agricultural Ecology of Chinese Academy of Sciences in Northeast China and had been
under a long鄄term rotation experiment designed to two treatments, i. e. , long鄄term continuous crop鄄
ping (LCC) of soybean for 20 years and short鄄term continuous cropping (SCC) for 3 years. In SCC
field, the population density of Fusarium spp. was 6. 0伊104 CFU·g-1, in which F. oxysporum,
F. graminearum and F. verticillioides possessing high pathogenicity and F. solani possessing mod鄄
erate pathogenicity were the dominant species. In LCC field, the population density of Fusarium
population and the dominance index of dominant species were significantly lower than that in SCC.
The population density of F. oxysporum, F. graminearum and F. solani were only 36% , 32% and
22% of that in SCC, and F. verticillioide with highest pathogenicity was absent. The diversity and
evenness index of Fusarium population were significantly higher than that in SCC. F. tricinctum,
F. lateritium and F. avenaceum, just isolated from LCC, possessing a distant genetic relationship
应 用 生 态 学 报摇 2014 年 2 月摇 第 25 卷摇 第 2 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Feb. 2014, 25(2): 497-504
with Fusarium isolates possessing high pathogenicity based on internal transcribed spacer (ITS) and
translation elongation factor 1鄄alpha (EF鄄1琢) gene, were non鄄pathogenicity for soybean. Thus, it
seemed that LCC of soybean could cause the inhibition of soil Fusarium population size, alteration
of Fusarium community composition and genetic diversity, and even the decline of pathogenicity for
soybean root rot disease of Fusarium population.
Key words: long鄄term continuous cropping; soybean root rot; Fusarium; pathogenicity; genetic di鄄
versity.
摇 摇 大豆连作可使田间病虫害加重,造成大豆产量
和品质下降,因此连作障碍是大豆高产和稳产的重
要限制因子[1-2] . 大豆连作障碍形成的重要因素包
括大豆根腐病、大豆胞囊线虫以及根蛇潜蝇[1,3] .其
中,大豆根腐病是一种分布广、危害重和难以防治的
土传性真菌病害[3-4],在我国黑龙江、山东、安徽及
陕西省等大豆产区均有报道,且多以镰孢菌属真菌
(Fusarium spp. )为主要病原[5-9] . 连作大豆田根腐
病发病严重程度一般随着连作年限增加而不断加
重[9],但近年陆续有研究指出一些大豆田块连作 3
年后根腐病病情有逐年减弱的趋势.刘金波[10]研究
表明,连作达 17 年时,土壤中根腐病原尖镰孢菌
(F. oxysporum)菌落形成单位(CFU)显著低于大豆
连作 2 年土壤,甚至略低于轮作 17 年(大豆鄄小麦鄄
玉米)土壤.魏巍[11]研究发现,大豆连作 18 年和 20
年田间根腐病发病情况分别显著低于同年份大豆连
作 1 年和 3 年土壤.由此可见,大豆连作年限对大豆
根腐病及病原菌种群的兴衰有一定的作用,而长期
连作可能有助于形成大豆根腐病抑制性土壤.因此,
明确长期连作大豆根际土壤镰孢菌种群密度和结
构、根腐病致病力及遗传多样性等特征可为该假设
提供证据.然而,关于大豆长期连作与根腐病原菌关
系的研究尚未见报道.
镰孢菌是一个庞大的真菌属,且属内各镰孢菌
种间和种内亲缘关系较复杂,在进行镰孢菌种群遗
传多样性研究时,如果仅依靠一种核酸序列信息进
行分析,很难得到准确的结果[12] .因此,结合多重序
列进行镰孢菌属遗传多样性分析是更为科学可行的
方法.目前,镰孢菌属系统发育进化关系的相应研究
已经应用了多种基因序列,如转录延长因子序列
(translation elongation factor 1鄄alpha, EF鄄1琢)、核糖
体 DNA转录间隔区序列(internal transcribed spacer,
ITS)、茁微管蛋白基因序列(茁鄄tubulin, tub鄄2)、线粒
体小亚基序列(mitochondrial small subunit, mtSSU),
以及细胞色素 C 序列 ( cellobiohydrolase鄄c, cbh鄄
c) [11-13] .其中,EF鄄1琢 是目前最为有效的镰孢菌属
真菌种及种下水平遗传多样性的研究工具[12-13] .基
于此序列建立的镰孢菌数据库包含超过 80 个种的
7000 余条序列信息,可为根腐病原镰孢菌的系统发
育分析提供大量参考[13] .而镰孢菌 ITS 序列则是被
广泛地与限制性片段长度多态性(restricted fragment
length polymorphisms,RFLP)分子标记技术结合,组
合成快速有效的镰孢菌属真菌系统发育分析和遗传
多样性的研究方法[14] . 如将二者有效地结合,会成
为镰孢菌遗传多样性和系统发育进化关系研究的有
力工具.
因此,本研究通过对大豆根际土壤镰孢菌种群
的分离计数、形态学鉴定及致病性测定,结合 ITS鄄
RFLP和 EF鄄1琢序列分析,研究了大豆长期定位试
验区内长期连作对大豆根际土壤镰孢菌种群密度和
结构、根腐病致病力及遗传多样性的影响,为黑土大
豆田病害的土壤微生态防治提供科学依据.
1摇 研究地区与研究方法
1郾 1摇 研究区概况
试验样地设在黑龙江省海伦市的中国科学院海
伦农业生态试验站(47毅26忆 N,126毅38忆 E)长期定位
试验区,海拔 240 m. 试验站地处黑土区中部,属于
温带大陆性季风气候区,夏季高温多雨,雨热同季,
冬季寒冷干燥. 年平均气温 1. 5 益,有效积温 2400
益,年均降水量 570 mm[15] . 试验小区设置于 1991
年,小区面积 77 m2,垄长 10 m,宽 0. 7 m.作物种植
方式包括大豆短期连作( SCC),顺序为玉米鄄大豆鄄
大豆鄄大豆鄄玉米;大豆长期连作(LCC),即自试验区
设置起连续种植大豆,2011 年采集时短期连作处理
的连作时间为 3 年,长期连作为 20 年.种植的玉米
品种为海玉 6 号,大豆品种为黑农 35,田间管理与
一般生产田相同,采用人工播种,三铲三趟,秋季旋
松起垄.大豆施肥量为磷酸二铵 150 kg·hm-2;玉米
施肥量为磷酸二铵 150 kg · hm-2, 尿素 225
kg·hm-2(一半基肥,一半追肥). 土壤肥力状况:速
效氮 192. 3 mg·kg-1, 速效磷 131. 5 mg·kg-1, 速
894 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
效钾 118. 0 mg·kg-1, pH 值 5. 5,全氮含量 1. 73
g·kg-1,有机碳含量 27. 1 g·kg-1 .
2011 年春季大豆苗期(V3,6 月 5 日)采集 2 种
连作方式下大豆根际土壤. 在 2 种连作方式下各重
复小区中,随机选择 5 个地点采集大豆植株 3 株,采
用抖落法收集根际土壤并混合均匀后用无菌封口袋
密封,置于冰盒中带回实验室,新鲜土样过 2 mm 土
壤筛,于 4 益保存备用[15] .
1郾 2摇 镰孢菌分离计数、形态学鉴定及致病力测定
取 10 g土壤样品,加入 100 mL 灭菌的质量分
数为 0. 2%的水琼脂溶液中,在 25 益120 r·min-1的
条件下, 震荡 20 min 后,使之充分混匀并制成 10-1
稀释液.取 1 mL该稀释液加入至 9 mL 0. 2%的水琼
脂溶液中,充分混合后依次制成 10-2 ~ 10-4稀释液.
分别取 10-2、10-3和 10-4稀释度溶液涂匀于镰孢菌
属选择性孔雀绿琼脂培养基(malachite green agar,
MGA)平板表面[16-17] . 28 益下黑暗培养 6 d后,选择
有代表性的一个稀释度进行总镰孢菌 CFU 数量的
统计.计数后将该稀释度所有镰孢菌菌株进行单孢
分离及标准培养[11],并根据其在马铃薯葡萄糖琼脂
培养基 ( potato dextrose agar, PDA) 和 Spezieller
n覿hrstoffarmer 琼脂培养基 ( spezieller n覿hrstoffarmer
agar, SNA)的菌落形态、颜色和生长速度,孢子的分
生方式,大、小型分生孢子的有无、形态和大小,厚垣
孢子、分生孢子梗及分生孢子座的有无和形态等形
态学特征对所有菌株进行鉴定[11] .
用高粱米对镰孢菌分离菌株进行扩繁.将 100 g
高粱米置于 500 mL 三角瓶中,用水浸泡过夜后弃
水,高压灭菌 1 h. 选取 PDA 培养基上活化 2 ~ 3 d
的供试镰孢菌菌丝尖端部分,用直径 8 mm 的打孔
器采集菌片,接种至上述高粱米表面, 28 益培养
7 ~ 10 d.待镰孢菌菌丝长满高粱米培养物后,将其粉
碎成粉末状备用.盆栽致病性测定试验在 28 益恒温
温室内进行,先将盆栽土于 121 益湿热灭菌 90 min,
再按照 2%质量比混合镰孢菌鄄高粱米粉末并置于已
灭菌的 0. 5 L 盆栽盆中,每盆播入 5 粒大豆(品种合
丰 25). 30 d时记录根腐病发病级别,计算病情指数,
同时调查大豆根长和根鲜质量等生长发育情况[18] .
对大豆根腐病患病植株进行根部病原菌的重新分离,
确定该接种镰孢菌为病原镰孢菌.植株病情指数臆30
为弱致病力或无致病力;30<病情指数臆50 为中等致
病力;病情指数>50为强致病力[8] .
1郾 3摇 镰孢菌基因组 DNA提取和 PCR扩增
根据形态学鉴定结果,按照连作 3 年和 20 年土
壤中的分离频率,每种镰孢菌中具有代表性的 22 株
镰孢菌菌株进行遗传多样性的分析. 取待测镰孢菌
菌丝各 200 mg,用 Omega 公司的真菌 DNA 中量提
取试剂盒进行 DNA 提取. 以提取得到的 DNA 作为
模板,使用真菌通用引物 ITS1 和 ITS4 进行镰孢菌
核糖体 DNA内转录间隔区 ITS序列的扩增. PCR为
50 滋L 体系,包含 2 滋LDNA(约 20 ng)样品,1. 5
mmol·L-1 MgCl2,0. 25 滋mol·L-1正反向引物,400
滋mol·L-1 dNTP,l U Taq DNA聚合酶及 1 倍的反应
缓冲液,用无菌双蒸水补到 50 滋L. PCR 反应条件为
95 益预变性 5 min;94 益变性 1 min,55 益退火 1
min,72 益延伸 1 min,共 35 个循环;最后 72 益延伸
10 min,PCR产物长约 500 ~ 700 bp.再使用 Yergeau
等[19]设计的引物 Alfie1 和 Alfie鄄2 进行镰孢菌属
EF鄄1琢序列的扩增. PCR为 50 滋L体系,反应体系与
上述 ITS扩增体系相同,仅将上述 PCR 反应条件中
的退火温度提高至 67 益,PCR产物长约 500 bp[20] .
1郾 4摇 PCR产物 RFLP和克隆测序分析
应用 TAKARA公司胶回收试剂盒对 ITS 和 EF鄄
1琢序列的 PCR反应产物进行纯化回收. ITS 序列的
纯化产物分别用限制性内切酶 Pst 玉、Msp 玉、Hinf
玉、Sma 玉和 Hae 芋 进行酶切(20 滋L 反应体系,
Hinf 玉、Pst 玉、Msp 玉和 Hae 芋的反应温度为 37
益,Sma 玉的反应温度为 30益,所有限制性内切酶
进行过夜反应),反应结束后用 1. 5%琼脂糖凝胶进
行电泳确认. EF鄄1琢 序列的 PCR 纯化产物利用美国
Promega生物技术公司的 pMD18鄄T Vector 和大肠杆
菌(Escherichia coli)DH5 感受态细胞进行克隆.克隆
产物提交测序公司(上海英骏生物技术有限公司)
测序,所得序列经 NCBI ( http: / / www. ncbi. nlm.
nih. gov / )数据库上的 BLAST 分析后进行基因的同
源性比较.
1郾 5摇 数据分析
RFLP酶切图谱应用 Quantity One v4. 6 软件进
行酶切产物条带位置和大小的分析,并结合相应镰
孢菌种在 Genbank中 ITS序列的酶切预测结果进行
条带大小的确认.确认后的结果分别以 1 和 0 表示
所有限制性条带在各菌株中的出现和不出现,形成
的数字矩阵应用 NTSYS鄄PC 2. 1 软件采用 UPGMA
聚类分析方法生成聚类图. EF鄄1琢 序列测序结果的
系统发育树图应用 MEGA Version 4 软件,基于
Neighbor鄄joining 方法绘制. 所有数据的统计学相关
分析均采用 R 程序 2. 12. 2 (http: / / www. r鄄project.
org)进行(琢=0郾 05).
9942 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 魏摇 巍等: 长期连作对大豆根际土壤镰孢菌种群的影响摇 摇 摇 摇 摇
2摇 结果与分析
2郾 1摇 连作 20 年对大豆根际镰孢菌种群密度和结构
影响
于大豆 3 年连作和 20 年连作的根际土壤中分
别获得镰孢菌菌株 48 和 60 株,经形态学鉴定大豆
3 年连作分离菌株分属于 6 个种,包括尖镰孢菌、禾
谷镰孢菌(F. graminearum)、腐皮镰孢菌(F. sola鄄
ni)、轮枝镰孢菌(F. verticillioides)、木贼镰孢菌(F.
equiseti)和黄色镰孢菌(F. culmorum);大豆 20 年连
作分离菌株分属于 8 个种,包括尖镰孢菌、禾谷镰孢
菌、木贼镰孢菌、芬芳镰孢菌(F. redolens)、腐皮镰
孢菌、燕麦镰孢菌(F. avenaceum)、砖红镰孢菌(F.
lateritium)和三线镰孢菌(F. tricinctum).
摇 摇 20 年连作大豆根际土壤镰孢菌密度为 2. 7伊104
CFU·g-1,显著低于 3 年连作 6. 0伊104 CFU·g-1 . 3
年连作大豆根际土壤以尖镰孢菌、禾谷镰孢菌、轮枝
镰孢菌和腐皮镰孢菌为优势镰孢菌,共占分离镰孢
菌总数的 92% .每克干土中 4 种镰孢菌密度分别为
2. 9伊104、1. 1伊104、0. 5伊104和 1. 0伊104 CFU·g-1(图
1);而在 20 年连作土壤中轮枝镰孢菌没有分离到,
其余 3 种镰孢菌共占分离镰孢菌总数的 59% .尽管
尖镰孢菌的优势仍较明显,但其密度仅为 3 年连作
措施的 36% .禾谷镰孢菌和腐皮镰孢菌分别为短期
连作的 32%和 22% . 20 年连作大豆根际土壤镰孢
菌种群多样性和均匀度均显著高于3年连作,而种
群中优势菌优势度显著低于 3 年连作(表 1).
图 1摇 不同连作年限大豆根际土壤镰孢菌密度
Fig. 1摇 Fusarium spp. density in soybean rhizosphere in differ鄄
ent continuous cropping years.
玉:连作 3 年 Continuous cropping for 3 years ; 域: 连作 20 年 Continu鄄
ous cropping for 20 years. A:轮枝镰孢菌 F. verticillioides; B:尖镰孢
菌 F. oxysporum; C:芬芳镰孢菌 F. redolens; D:禾谷镰孢菌 F. gra鄄
minearum; E:砖红镰孢菌 F. lateritium; F:木贼镰孢菌 F. equiseti;
G:腐皮镰孢菌 F. solani; H:黄色镰孢菌 F. culmorum; I:三线镰孢菌
F. tricinctum; J:燕麦镰孢菌 F. avenaceum.
表 1摇 不同年限连作大豆根际土壤镰孢菌种群多样性、均匀
度及优势度指数
Table 1摇 Diversity, evenness and dominance indexes of Fu鄄
sarium spp. in soybean rhizosphere under different continu鄄
ous cropping years
处理
Treatment
多样性指数
Diversity index
均匀度指数
Evenness index
优势度指数
Dominance index
玉 1. 36依0. 06 0. 12依0. 01 0. 32依0. 14
域 1. 86依0. 31* 0. 19依0. 05* 0. 28依0. 14
玉:连作 3 年 Continuous cropping for 3 years; 域:连作 20 年 Continu鄄
ous cropping for 20 years. *P<0. 05. 下同 The same below.
表 2摇 镰孢菌分离频率、致病力以及 RFLP类型
Table 2摇 Isolation frequency, pathogenicity and RFLP type of Fusarium isolates
镰孢菌种
Fusarium species
处理
Treatment
分离频率
Isolation
frequency
(% )
菌株编号
Isolates
No.
致病力 Pathogenicity (n=3)
病情指数
Disease
index
根鲜质量
Fresh mass of root
(g·plant-1)
根长
Root length
(cm)
尖镰孢菌 玉 49 SCC1125 51*** 1. 37*** 19. 3***
F. oxysporum SCC1155 62*** 1. 43*** 18. 3***
域 39 LCC1123 59*** 1. 43*** 17. 8***
LCC1148 54*** 1. 33*** 16. 2***
禾谷镰孢菌 玉 19 SCC1117 55*** 1. 43*** 18. 7***
F. graminearum SCC1118 58*** 1. 30*** 16. 7***
域 16 LCC1119 51*** 1. 43*** 19. 0***
LCC1122 44*** 1. 57* 19. 9***
腐皮镰孢菌 玉 15 SCC1138 33*** 1. 53** 25. 3*
F. solani 域 13 LCC1142 36*** 1. 47*** 21. 1***
LCC1149 34*** 1. 57* 26. 3
芳香镰孢菌 域 14 LCC1134 38*** 1. 50** 18. 8***
F. redolens LCC1130 39*** 1. 50** 19. 4***
木贼镰孢菌 玉 5 SCC1129 40*** 1. 50** 23. 4**
F. equiseti 域 18 LCC1140 32*** 1. 60 24. 5*
轮枝镰孢菌 玉 8 SCC1136 68*** 1. 40*** 16. 3***
F. verticillioides SCC1135 85*** 1. 27*** 17. 1***
砖红镰孢菌 域 5 LCC1144 21 1. 67 27. 9
F. lateritium LCC1128 19 1. 70 29. 7
燕麦镰孢菌 F. avenaceum 域 5 LCC1133 17 1. 60 27. 8
黄色镰孢菌 F. culmorum 玉 2 SCC1126 37*** 1. 50** 22. 6**
三线镰孢菌 F. tricinctum 域 5 LCC1115 19 1. 63 28. 5
对照 Control - - - 14 1. 70 31. 5
**P<0. 01;***P<0. 001.
005 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
表 3摇 9 种 RFLP类型对应的酶切产物大小
Table 3摇 Size of enzyme鄄digested product corresponding to nine RFLP types
条带类型编号
Band type No.
产物大小 Product size (bp)
Msp 玉 Sma 玉 Hae 芋 Pst 玉 Hinf 玉
A 450, 110 550 340, 120, 90 550 280, 200, 100
B 300, 150, 100 550 250, 100 (3) 420, 130 280, 270
C 550 550 340, 120, 90 300, 160, 90 280, 270
D 330, 120, 100 300, 200 250, 100 (3) 420, 130 280, 150, 120
E 550 550 340, 120, 90 300, 160, 90 280, 270
F 360, 220 350, 230 230, 130, 100 (2) 580 280, 270
G 300, 150, 100 460, 90 350, 100 (3) 550 280, 150, 120
H 320, 230 300, 200 340, 120, 90 450, 100 280, 270
I 310, 190, 50 300, 200 350, 100 (3) 420, 130 280, 270
2郾 2摇 镰孢菌对大豆致病力分析
对 22 株代表性镰孢菌菌株进行盆栽致病性测
定(表 2),分离到的尖镰孢菌和轮枝镰孢菌所有菌
株、禾谷镰孢菌 SCC1117、SCC1118 和 LCC1155 为强
致病力菌株,受其侵染大豆的根长和根质量均显著
低于对照健康大豆植株;分离的砖红镰孢菌、三线镰
孢菌和燕麦镰孢菌为非致病力菌株,受其侵染大豆
的根长、根质量及病情指数与健康大豆之间的差异
不显著;其余镰孢菌菌株为中等致病力菌株.
2郾 3摇 连作年限对大豆根际镰孢菌种群遗传多样性
的影响
22 株供试菌株经过 5 种限制性内切酶酶切后,
共得到 9 种 RFLP 条带类型(表 3). 聚类分析结果
表明,在相似性系数为 62%时所有菌株被划分为 2
个类群(图 2). 类群玉包括黄色镰孢菌、禾谷镰孢
菌、轮枝镰孢菌、尖镰孢菌、芬芳镰孢菌和腐皮镰孢
菌;轮枝镰孢菌和尖镰孢菌没有被区分开,禾谷镰孢
菌则被分为了 2 类,其中一类与腐皮镰孢菌形成一
簇.类群域包括燕麦镰孢菌、木贼镰孢菌、砖红镰孢
菌和三线镰孢菌.类群玉中的镰孢菌菌株为中等和
强致病力菌株,而所有弱致病力镰孢菌均聚类在类
群域中.
供试的 22 株镰孢菌基于 EF鄄1琢 序列聚类为 4
个类群(图 3).类群玉包括轮枝镰孢菌、尖镰孢菌和
芬芳镰孢菌. 该结果与 RFLP 聚类中的结果相近
(RFLP 聚类结果中该 3 种镰孢菌相似性系数为
93% ),且区分开了轮枝镰孢菌和尖镰孢菌. 类群域
包括归属同一 RFLP 类群中的燕麦镰孢菌、砖红镰
孢菌和三线镰孢菌.类群芋包括黄色镰孢菌、木贼镰
孢菌以及禾谷镰孢菌,且禾谷镰孢菌中的系统进化
有分歧.类群虽仅为腐皮镰孢,但 4 株供试菌株在类
群内分为了 2 簇.类群芋和郁的系统发育关系略有
别于 RFLP聚类结果,更为明确了黄色镰孢菌、木贼
镰孢菌、禾谷镰孢菌以及腐皮镰孢菌间的亲缘关系.
具有强致病力的 6 株镰孢菌聚类于类群玉中,而类
群域则专属于 4 株弱致病力镰孢菌.
图 2摇 基于 ITS序列的镰孢菌 RFLP聚类树
Fig. 2 摇 Phylogenetic tree of RFLP type of Fusarium isolates
based on ITS sequence.
括号中数值为该菌株的大豆根腐病病情指数 The numbers in the
bracket meant the disease index of soybean root rot caused by the relative
Fusarium isolate. 下同 The same below.
1052 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 魏摇 巍等: 长期连作对大豆根际土壤镰孢菌种群的影响摇 摇 摇 摇 摇
图 3摇 根际土壤分离镰孢菌菌株基于 EF鄄1琢 序列的系统发
育树
Fig. 3摇 Phylogenetic tree of Fusarium isolates based on partial
EF鄄1琢 gene.
基于邻接法构建系统发育树,bootstrap 重复数为 1000,仅显示>50%
的自展值,以与分离菌株亲缘较远的蠕孢镰孢菌 Fusarium larvarum
作为外群 Phylogenetic tree was generated by the neighbor鄄joining meth鄄
od, bootstrap values (1000 replicates) greater than 50% were indicated
above the branches, and Fusarium larvarum was used as the outgroup.
3摇 讨摇 摇 论
研究表明,3 年连作大豆根际土壤镰孢菌种群
以强致病力的尖镰孢菌、禾谷镰孢菌和轮枝镰孢菌,
中等致病力的腐皮镰孢菌、黄色镰孢菌和木贼镰孢
菌为优势菌群.连作 20 年豆田中所有上述优势病原
镰孢菌密度均显著低于 3 年土壤,而致病力最高的
轮枝镰孢菌甚至没有分离到. 同时,仅在连作 20 年
根际土壤中分离到的砖红镰孢菌、三线镰孢菌及燕
麦镰孢菌均为非致病性镰孢菌.根据已有研究报道,
土壤中腐生真菌类群在抑制寄生性病原菌生长过程
中起重要作用[21] .而植物根系非致病性镰孢菌种群
作为腐生真菌,可以抑制同一生存环境中寄生性病
原镰孢菌的生长繁殖[21-22] .其抑制性机理主要包括
通过化感作用诱导植物宿主产生镰孢菌病害的免疫
力[23]、与病原镰孢菌种群进行营养和代谢底物的腐
生性竞争以及在病原菌侵染部位进行生存领域的寄
生性竞争[21,24] .尤其是尖镰孢菌所引起的病害可以
广泛地利用非致病性镰孢菌进行防治[21,25] .本研究
中,尖镰孢菌作为最优势的病原菌,其种群密度在长
期连作后显著地下降很可能受非致病性镰孢菌种群
的影响.由此可见,非致病性镰孢菌种群可能是镰孢
菌病害抑制性土壤中的关键作用因素之一,而本研
究中大豆长期连作所造成的根际土壤中非致病性镰
孢菌种群的扩大为大豆根腐病害抑制性土壤的形成
提供了条件.由此推断,大豆 20 年的连作可能促进
了非致病性菌的生长,降低了大豆根际土壤中强致
病力镰孢菌种群的密度,从而降低病原镰孢菌的种
群致病能力.该结论为证明长期连作形成大豆根腐
病抑制性土壤这一假设提供了支持.
本研究中,基于 EF鄄1琢 序列构建了分离镰孢菌
菌株的系统发育树图,将所有分离镰孢菌菌株划分
为 4 个类群. 该结果与 Watanabe 等[26]根据 茁鄄tubu鄄
lin、EF鄄1琢序列、核糖体 DNA序列(18S rDNA、ITS1、
5郾 8S rDNA和 28S rDNA)和氨基乙二酸还原酶基因
(aminoadipate reductase gene, lys2)4 种基因序列联
合构建的镰孢菌属系统发育树相一致. 由此可见,
EF鄄1琢序列是进行镰孢菌属系统发育分析的有力工
具.分离得到的 10 种镰孢菌中的 4 种属于复合型镰
孢菌种,包括的强致病力的尖镰孢菌复合型(F. ox鄄
ysporum complex)、禾谷镰孢菌复合型(F. graminea鄄
rum complex)以及中等致病力的腐皮镰孢菌复合型
(F. solani complex)和木贼镰孢菌复合型(F. equi鄄
seti complex).其中,基于 EF鄄1琢 序列的系统发育分
析结果表明,长期连作使大豆根际土壤禾谷镰孢菌
复合型和腐皮镰孢菌复合型的镰孢菌菌株均出现了
种内的遗传分化,但该两种镰孢菌中出现分化的菌
株之间具有相似的根腐病致病力,因此该长期连作
205 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
造成遗传分化没有影响到禾谷镰孢菌和腐皮镰孢菌
的致病力. 20 年连作根际土壤中的非致病性燕麦镰
孢菌、砖红镰孢菌和三线镰孢菌在 ITS 和 EF鄄1琢 序
列上均展示了较近的亲缘关系,表明镰孢菌种群系
统进化亲缘关系与大豆根腐病致病性和非致病性镰
孢菌的划分有一定的联系.
近年来,关于植物病害抑制性土壤形成的研究
得到了人们广泛的关注[21-22,27] . Kinkel 等[22]提出共
同进化是病害病原菌抑制性土壤形成的主要动力.
在共同进化的长期作用下,富含病原菌的农田土壤
会富集一种或多种对病原菌具有抑制作用的微生
物.而长期连作是病原抑制性土壤形成的有效方
法[21,27],既为病原及病原抑制性微生物提供共同进
化的环境,又为病原抑制性微生物的积累提供充分
的时间.例如,世界范围发生的小麦全蚀病已经被证
实在经过若干年连作种植后,土壤中的拮抗木霉菌
(Trichoderma spp. )以及可产生病原菌抗菌素的荧
光假单胞菌(Pseudomonas fluorescent)的种群密度和
活性均显著地增加,从而形成该病害的抑制性土
壤[21,28-29] .由此可见,大豆长期连作土壤在依靠增
加非致病性镰孢菌种群密度来抑制根腐病病原镰孢
菌生长繁殖的同时,很可能也富集了大量病原镰孢
菌的拮抗性微生物,为大豆根腐病生防微生物的筛
选提供了平台.
参考文献
[1]摇 Xu Y鄄L (许艳丽), Wang G鄄H (王光华), Han X鄄Z
(韩晓增). Study on biological barrier in continuous
soybean. Chinese Journal of Oil Crop Sciences (中国油
料作物学报), 1997, 19(3): 46-49 (in Chinese)
[2]摇 Xu Y鄄L (许艳丽), Liu J鄄B (刘金波), Han X鄄Z (韩
晓增), et al. Effect of continuous cropping on yield and
growth鄄development of soybean. Scientia Agricultura
Sinica (中国农业科学), 1999, 32( suppl. ): 64-68
(in Chinese)
[3]摇 Xu Y鄄L (许艳丽), Li C鄄J (李春杰), Liu J鄄B (刘金
波), et al. Effect of alternate鄄year and continuous鄄crop鄄
ping on diseases and pests of soybean. Soybean Science
(大豆科学), 2008, 27(3): 471-474 (in Chinese)
[4] 摇 Liu J鄄B (刘金波), Xu Y鄄L (许艳丽). Current re鄄
search of soil microbial of successive soybean cropping
in China. Chinese Journal of Oil Crop Sciences (中国油
料作物学报), 2008, 30(1): 132-136 (in Chinese)
[5]摇 Gao T鄄C (高同春), Zhou S鄄Q (周书其), Wang Z鄄R
(王振荣). Separation, appraisal and pathogen determi鄄
nation of soybean root rot pathogens. Journal of Anhui
Agricultural Sciences (安徽农业科学), 1992, 20(1):
79-81 (in Chinese)
[6]摇 Liu Z鄄D (刘铸德). The study on root rots disease of
soybean. Chinese Journal of Oil Crop Sciences (中国油
料作物学报), 1992, 14(1): 42-44 (in Chinese)
[7]摇 Ma H鄄Q (马汇泉), Jin X鄄H (靳学慧), Xin H鄄P (辛
惠普). Ecological studies of soybean root rots disease.
Journal of Heilongjiang Bayi Agricultural University (黑
龙江八一农垦大学学报), 1992, 6(1): 39-43 ( in
Chinese)
[8]摇 Wang X鄄Y (王晓燕), Wen J鄄Z (文景芝). Species
and pathogenicity of Fusarium causing soybean root rot
in Northeast China. Chinese Oil Crop Sciences (中国油
料作物学报), 2011, 33(4): 391-395 (in Chinese)
[9]摇 Zhang S鄄X (张淑香), Gao Z鄄Q (高子勤), Liu H鄄L
(刘海玲). Continuous cropping obstacle and rhizos鄄
pheric microecology. 芋. Soil phenolic acids and their
biological effect. Chinese Journal of Applied Ecology (应
用生态学报), 2000, 11(5): 741-744 (in Chinese)
[10] 摇 Liu J鄄B (刘金波). Population Structure and Dynamic
of Fusarium spp. in Soybean Root and Rhizosphere.
Master Thesis. Beijing: Graduate University of Chinese
Academy Sciences, 2008 (in Chinese)
[11]摇 Wei W (魏 摇 巍). The Suppressiveness Caused by
Long鄄term Continuous Cropping of Soybean on the Root
Rot and Pathogens. PhD Thesis. Beijing: Graduate Uni鄄
versity of Chinese Academy Sciences, 2012 ( in Chi鄄
nese)
[12]摇 Leslie JF, Summerell BA. The Fusarium Laboratory
Manual. Ames, IA: Blackwell Publishing Professional,
2006
[13]摇 Geiser DM, Delmar JGM, Kang S, et al. FUSARIUM鄄
ID v. 1. 0: A DNA sequence database for identifying
Fusarium. European Journal of Plant Pathology, 2004,
110: 473-479
[14]摇 Lee YM, Choi YK, Min BR, et al. PCR鄄RFLP and se鄄
quence analysis of the rDNA ITS region in the Fusarium
spp. Journal of Microbiology, 2000, 38: 66-73
[15]摇 Wei W (魏 摇 巍), Xu Y鄄L (许艳丽), Zhu L (朱
琳), et al. Effect of long鄄term fertilization on soil mi鄄
crobial communities in farmland of black soil. Acta Ped鄄
ologica Sinica (土壤学报), 2013, 50(2): 159-167
(in Chinese)
[16] 摇 Castell觃 G, Bragulat MR, Rubiales MV, et al. Mala鄄
chite green agar, a new selective medium for Fusarium.
Mycopathologia, 1997, 137: 173-178
[17]摇 Steinkellner S, Langer I. Impact of tillage on the inci鄄
dence of Fusarium spp. in soil. Plant and Soil, 2004,
267: 13-22
[18]摇 Wei W (魏摇 巍), Xu Y鄄L (许艳丽), Zhang S鄄J (张
思佳), et al. Denaturing gradient gel electrophoresis
assay of population diversity and pathogenicity of domi鄄
nant pathogenic Fusarium species of soybean root rot.
Acta Phytopathologica Sinica (植物病理学报), 2013,
43(5): 500-508 (in Chinese)
[19]摇 Yergeau E, Filion M, Vujanovica V, et al. A PCR鄄de鄄
naturing gradient gel electrophoresis approach to assess
Fusarium diversity in asparagus. Journal of Microbiolog鄄
ical Methods, 2005, 60: 143-154
[20]摇 Wei W, Xu YL, Li S, et al. Analysis of Fusarium pop鄄
3052 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 魏摇 巍等: 长期连作对大豆根际土壤镰孢菌种群的影响摇 摇 摇 摇 摇
ulations in a soybean field under different fertilization
management by real鄄time quantitative PCR and denatu鄄
ring gradient gel electrophoresis. Journal of Plant Pa鄄
thology, 2012, 94: 119-126
[21]摇 Mazzola M. Mechanisms of natural soil suppressiveness
to soilborne diseases. Antonie van Leeuwenhoek, 2002,
81: 557-564
[22]摇 Kinkel LL, Bakker MG, Schlatter DC. A coevolutionary
framework for managing disease鄄suppressive soils. Annu鄄
al Review of Phytopathology, 2011, 49: 47-67
[23] 摇 Duijff BJ, Pouhair D, Olivain C, et al. Implication of
systemic induced resistance in the suppression of Fusari鄄
um wilt of tomato by Pseudomonas fluorescence WCS417r
and nonpathogenic Fusarium oxysporum Fo47. European
Journal of Plant Pathology, 1998, 104: 903-910
[24]摇 Couteaudier Y, Alabouvette C. Quantitative comparison
of Fusarium oxysporum competitiveness in relation to
carbon utilization. FEMS Microbiology Ecology, 1990,
74: 261-268
[25]摇 Weller DM, Raaijmakers JM, Gardener BBM, et al.
Microbial populations responsible for specific soil sup鄄
pressiveness to plant pathogens. Annual Review of Phy鄄
topathology, 2002, 40: 309-348
[26]摇 Watanabe M, Yonezawa T, Lee KI, et al. Molecular
phylogeny of the higher and lower taxonomy of the Fu鄄
sarium genus and differences in the evolutionary histories
of multiple genes. BMC Evolutionary Biology, 2011,
11: 322
[27]摇 Fuente LDL, Landa BB, Weller DM. Host crop affects
rhizosphere colonization and competitiveness of 2,4鄄
diacetylphloroglucinol鄄producing Pseudomonas fluores鄄
cents. Phytopathology, 2006, 96: 51-62
[28]摇 Berendsen RL, Pieterse CMJ, Bakker PAHM. The rhi鄄
zosphere microbiome and plant health. Trends in Plant
Science, 2012, 17: 478-486
[29]摇 Meng P鄄P (孟品品), Liu X (刘摇 星), Qiu H鄄Z (邱
慧珍), et al. Fungal population structure and its bio鄄
logical effect in rhizosphere soil of continuously cropped
potato. Chinese Journal of Applied Ecology (应用生态
学报), 2012, 23(11): 3079-3086 (in Chinese)
作者简介摇 魏摇 巍,男,1984 年生,博士研究生.主要从事土
壤微生物生态学研究. E鄄mail: weiwei0274@ hotmail. com
责任编辑摇 肖摇 红
405 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷