全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 43(5): 500-508(2013)
收稿日期: 2012-04-21; 修回日期: 2013-05-10
基金项目: 中国科学院知识创新工程重要方向项目(KZCX2-YW-408-3)
通讯作者: 许艳丽,研究员,主要从事农田有害生物防治研究; TEL:0451-86602919, E-mail: xyll@neigaehrb. ac. cn
第一作者: 魏 巍,男,黑龙江人,博士,主要从事土壤病原微生物研究; E-mail: weiwei0274@hotmail. com。
大豆根腐病原镰孢菌种群多样性
DGGE分析及其致病性研究
魏 巍1,2, 许艳丽1*, 张思佳1,2, S. Li 3
( 1中国科学院东北地理与农业生态研究所黑土区农业生态院重点实验室, 哈尔滨 150081;
2中国科学院研究生院, 北京 100049; 3美国农业部农业研究局作物遗传研究中心, Stoneville 38776)
摘要:应用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术以及主成分分析方法,结合植物病原菌传统分离、鉴定及致病力测定,检测位于
黑龙江省海伦市大豆连作定位试验区根腐病原镰孢菌的种群构成及其致病力。 采用真菌传统分离和鉴定方法共确定镰孢
菌 6 个种,包括燕麦镰孢 Fusarium avenaceum、木贼镰孢 F. equiseti、禾谷镰孢 F. graminearum、腐皮镰孢 F. solani、尖镰孢
F. oxysporum和拟轮枝镰孢 F. verticillioides。 其中,尖镰孢菌的分离频率最高,为 56. 7% 。 结合 DGGE条带克隆测序及系
统发育分析鉴定出 8 种镰孢菌,较传统方法增加了黄色镰孢 F. culmorum和一个尖镰孢近似种。 同时,DGGE图谱中尖镰
孢所占百分比下降为 37. 4% 。 采用主成分分析方法将大豆生育指标相关的多种变量进行降维分析,得到第一主成分贡献
值为 91. 2% 。 按照贡献值的正负结果,将 30 株镰孢菌分为致病和非致病类群。 第二主成分贡献值为 5. 8% ,根据其正负值
可以矫正被错误估计的致病能力。 综合所有研究结果,该定位试验区大豆根腐病主要病原镰孢菌为尖镰孢、禾谷镰孢和燕
麦镰孢,且以尖镰孢菌为优势病原菌。
关键词:大豆根腐病; 病原镰孢菌; 变性梯度凝胶电泳; 序列系统发育分析; 主成分分析
Denaturing gradient gel electrophoresis assay of population diversity and pathoge-
nicity of dominant pathogenic Fusarium species of soybean root rot　 WEI Wei1,2, XU
Yan-li1, ZHANG Si-jia1,2, S. Li3 　 ( 1Key Laboratory of Mollisols Agroecology, National Observation Station of Hailun
Agroecology System, Northeast Institute of Geography and Agroecology, Chinese Academy of Sciences, Harbin 150081, China;
2Graduate School, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3Crop Genetics Research Unit, United States Depart-
ment of Agriculture-Agricultural Research Service, Stoneville 38776, USA)
Abstract: In this study, based on the results of conventional pathogen isolation, identification and pathoge-
nicity test, the methods of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and principal component analysis
(PCA) were applied to determine the population structure of pathogenic Fusarium species associated with soy-
bean root rot in a continuous cropping soybean field located at the Hailun Experimental Station of Agricultural
Ecology in Northeast China. After fungal isolation and morphological identification, six Fusarium species were
determined, including F. avenaceum, F. equiseti, F. graminearum, F. solani, F. oxysporum and F. verti-
cillioides. The maximum isolation ratio was 56. 7% of F. oxysporum. The DGGE fingerprint offered 13 bands
about tef-1 sequence of Fusarium, and eight bands had been cloned, sequenced and aligned successfully. Be-
sides the above six Fusarium species determined by conventional isolation and identification, additionally the
other two Fusarium species were identified, namely F. culmorum and F. oxysporum-like species. Meanwhile,
the percentage of F. oxysporum decreased to 37. 4% . According to principal component analysis, the first
principal component (PC1) accounted for 91. 2% of variation in all data, which separated the Fusarium popu-
　
　 5 期 　 　 魏 巍,等:大豆根腐病原镰孢菌种群多样性 DGGE分析及其致病性研究
lations into pathogenic group and nonpathogenic group. The second principal component ( PC2) weighed
5． 8% of all variation, which could adjust the error evaluation of pathogenicity. In conclusion, F. oxysporum,
F. graminearum and F. avenaceum were confirmed as the pathogenic fungi of soybean root rot in this experi-
mental station with F. oxysporum as the dominant pathogen.
Key words:soybean root rot, pathogenic Fusarium, DGGE, sequence phylogenetic analysis, PCA
中图分类号:S435. 29 　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2013)05-0500-09
　 　 大豆根腐病是一种分布广、危害重、难以防治
的土传病害。 引起大豆根腐病的病原菌种类常因
地域环境的差异而有所不同[1]。 即使在相同的地
域环境下,也可由多种病原真菌的复合侵染引起。
已报道的大豆根腐病菌有镰孢菌 ( Fusarium
spp. )、腐霉菌(Pythium spp. )和立枯丝核菌(Rhi-
zoctonia solani)等[1 ~ 3]。 黑龙江省是我国大豆主
产区,近些年来由大豆根腐病、大豆胞囊线虫及根
蛇潜蝇等引起的根部病害和虫害问题已成为该地
区大豆连作障碍的主要因素[4],尤其以镰孢菌侵
染引起的根腐病发生越来越严重[5,6]。 长期以来,
关于植物病原菌的病原学研究多采用传统方法,如
从患病组织中分离病菌和采用形态特征进行病原
鉴定等[7,8]。 然而,由于根部病原菌侵染的复杂性
以及镰孢菌形态变异的多样性,如果只采用传统研
究方法研究大豆镰孢菌根腐病的病原菌种类及其
致病性,容易造成镰孢菌多样性信息的遗漏或其致
病能力的夸大或忽略等问题。
变性梯度凝胶电泳(DGGE)是目前研究微生
物群落的常用技术,近年来已有国外学者将其应用
至环境样品中镰孢菌种群结构多样性的相关研究
中。 Yergeau 等[9]设计了可应用于 DGGE 技术的
镰孢菌特异性引物,并应用该引物对芦笋样品中定
殖的病原镰孢菌进行了多样性分析,确定了其种群
结构。 因此,采用不依靠培养的 DGGE 技术并辅
助病原镰孢菌的传统分离和鉴定,可能会得到更为
准确的病原镰孢菌组成信息。 同时,将受病原菌侵
染大豆的生长发育指标与病原菌致病级数相结合,
再经过科学的统计分析,从而寻求可以避免致病性
结果夸大或忽略的研究方法。 因此,本研究结合组
织分离鉴定、DGGE 指纹图谱和转录延伸因子
( transcription elongation factor 1-alpha, tef-1)序列
分析等研究方法,分析了位于黑龙江黑土区的大豆
连作定位试验区大豆根腐病原镰孢菌种群构成,同
时结合受侵染大豆生长发育和根腐病发病级数等
指标,通过主成分分析对不同镰孢菌菌株的致病能
力进行区分,从而探讨各镰孢菌种类在引起大豆根
腐病害过程中的作用,为镰孢菌病害研究以及大豆
根腐病防治提供理论依据。
1　 材料与方法
1. 1　 样地设置及样品采集
试验样地设在中国科学院海伦农业生态试验
站(47°26′N,126°38′E)长期定位试验区。 试验区
设置于 1991 年,地处黑土区中部,海拔高度240 m,
属于温带大陆性季风气候区,冬季寒冷干燥,夏季
高温多雨,雨热同季;年均降水量 570 mm,年平均
气温 1. 5℃,年均有效积温 2 400℃,供试土壤类型
属典型黑土。 试验区包含若干作物轮作试验小区,
每小区设置 3 个随机排列的重复小区,小区面积
77 m2,垄长 10 m,宽 0. 7 m。 样品采集自大豆短期
连作小区(玉米-大豆-大豆-大豆-玉米),大豆品种
为黑农 35,玉米品种为海玉 6 号。 施用磷酸二铵
150 kg·hm -2,田间管理与一般生产田相同。 2011
年大豆苗期(6 月 5 日),在 3 个重复小区内各随机
采集健康大豆苗 3 株及患病大豆植株 30 株并随机
分为 10 组。 剪下大豆根部,用蒸馏水冲洗干净后,
于 4℃冰箱保存备用。
1. 2　 大豆根部镰孢菌分离、形态学鉴定及致病性
测定
从上述每组大豆病根上切取边长 5 mm 的正
方形组织小块各 10 块,用 75 %的酒精消毒 3 min,
经无菌水清洗 3 ~ 5 次后,将其接在水琼脂培养基
上,在 28℃培养 3 ~ 5 d后得到镰孢菌[10]。 分离得
到的镰孢菌菌株经单孢纯化后,进行标准培养[11],
即将菌丝接种到 PDA 和 SNA 培养基上,于 25℃
恒温光照培养箱内 12 h 光照与黑暗交替培养 4 ~
6 d,根据 Booth[11]和 Leslie 等[12]的分类系统进行
形态学鉴定。
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植物病理学报 43 卷
致病性测定采用镰孢菌孢子悬液法进行接种。
首先将分离纯化的菌种接种在 SNA 液体培养基
上,于 28℃、120 r·min -1条件下振荡培养 7 d。 将
经过振荡培养好的菌液过滤去菌丝,把孢子浓度配
成 106 个·mL -1备用[12]。 盆栽试验在恒温 28℃
的温室内进行。 将盛满盆栽土的 0. 5 L 塑料盆于
121℃进行湿热灭菌 90 min,冷却至室温后每盆倒
入 100 mL上述镰孢菌孢子悬浮液,且每个镰孢菌
株浇灌 3 盆,即设置试验的 3 次重复,且所有盆栽
于温室内随机摆放。 每盆播种 5 粒感病大豆品种
合丰 25,以保证出苗后每盆生长 3 株大豆植株。
40 d时调查大豆株高、根长、地上鲜重、地下鲜重
及根腐病发病级数。 根腐病分级标准如下:0 =主
根和须根健全,无病斑,根瘤多;1 =主根上有零星
病斑,但不连片,须根上无病斑;2 =主根病斑连片,
但小于根部周长的 1 / 4,须根略有发病;3 =主根病
斑大于根部周长的 1 / 4,但小于 1 / 2,须根病斑较
多,但不成片;4 =主根病斑大于周长的 1 / 2,但小
于 3 / 4,须根病斑成片,部分须根脱落;5 =整个根
部均有病斑包围,根部腐烂,须根近无[8]。
1. 3　 镰孢菌培养物基因组 DNA 的提取、PCR 扩
增及克隆测序
将上述鉴定的镰孢菌接种于 10 mL的 PDB液
体培养基中,在 28℃、150 rpm·min -1的条件下进
行培养,4 d 后 12 000 rpm 离心收集菌丝体约
200 mg。 采用 Omega公司的真菌 DNA 中量提取
试剂盒进行 DNA提取。 再以提取得到的 DNA 作
为模板,采用 Yergeau 等[9]设计的 tef-1 基因引物
Alfie1-GC 和 Alfie-2 进行 PCR 扩增。 PCR 为 50
μL体系,包含 2 μL DNA (约 20 ng)样品,1. 5
mmol·L -1 MgCl2,0. 25 μmol·L -1正反向引物,
400 μmol·L -1 dNTP,l U Taq DNA聚合酶及 1 倍
的反应缓冲液,用无菌双蒸水补到 50 μL。 PCR反
应条件为 95℃预变性 5 min;94℃变性 1 min,58℃
退火 1 min,72℃延伸 1 min,共 35 个循环;最后
72℃延伸 10 min,经琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产
物长约 500 bp。 反应产物应用 TAKARA公司的胶
回收试剂盒进行纯化回收后,利用 pMD18-T Vec-
tor和 Escherichia coli DH5 感受态细胞进行克隆。
克隆产物提交测序公司(上海英骏生物技术有限
公司)测序,所得序列与 NCBI (http: / / www. ncbi.
nlm. nih. gov / )数据库上的 BLAST分析进行 DNA
基因库的同源性比较。
1. 4　 大豆根部镰孢菌基因组 DNA的提取和 PCR
扩增
上述 10 组大豆根样中各取 200 mg 病根在液
氮中研磨后,使用 Omega公司的真菌 DNA中量提
取试剂盒进行 DNA提取。 以提取得到的 DNA 作
为模板,应用巢式 PCR 扩增程序进行扩增。 第一
轮 PCR扩增所用引物为 EF-1 和 EF-2[13]。 PCR反
应体系为 50 μL,组成与前文叙述反应体系相同。
在 PCR扩增反应程序中,退火温度降为 50℃,其余
步骤与前文叙述反应相同,经琼脂糖凝胶电泳检测
PCR产物长约 700 bp。 第二轮 PCR扩增应用上述
引物 Alfie1-GC和 Alfie-2[9]。
1. 5 　 变性梯度凝胶电泳 (DGGE)及克隆测序
分析
DGGE在变性梯度凝胶电泳仪上进行(Bio-
Rad laboratories,Hercules,CA,USA)。 丙烯酰胺凝
胶强度为 8% ,变性剂梯度为 30%~ 70% ,凝胶板
制作好后,组装放入含有 1 × TAE 的电泳槽中,预
热到 60℃时,加样。 每孔加入 20 μL 的 PCR 产物
和 10 μL的 1 × Loadding dye,加样完成后,接通电
泳电源,在 90 V、60℃条件下电泳 16 h[9,14]。 电泳
结束后,将凝胶放在稀释 10 000 倍的 SYBR GreenⅠ
核酸染料中避光染色 20 min,然后在凝胶成像仪下
进行观察,拍照。 将 DGGE 凝胶 DNA 条带切下,
按照上述步骤进行胶体 DNA 回收、克隆及测序,
所得序列与 NCBI 数据库上的 BLAST 分析进行
DNA基因库的同源性比较。
1. 6　 数据分析
病原镰孢菌致病性指数(PDI)计算公式为:根
腐病发病级数 × 100 /最大病级数。 应用 Minitab
分析软件对株高、根长、地上鲜重、地下鲜重及根腐
病发病级数进行主成分分析( principal component
analysis, PCA)。 DGGE条带辉度分析采用 Quan-
tityOne Version 4. 5 进行,并以此计算大豆根部各
镰孢菌种所占比率。 计算公式:P = F1 / F。 F1 为某
一条条带灰度值;F 为所有条带灰度值的和 [14]。
应用 MEGA Version 4 软件,基于 Neighbor-joining
方法绘制系统发育树图。 所有数据的统计学相关
205
　
　 5 期 　 　 魏 巍,等:大豆根腐病原镰孢菌种群多样性 DGGE分析及其致病性研究
分析均采用 R 程序 2. 12. 2 ( http: / / www. r-pro-
ject. org)进行。
2　 结果与分析
2. 1　 镰孢菌分离、鉴定及致病性测定
采用组织分离法分离 10 组大豆病根以及 1 组
健康大豆根部,获得镰孢菌共计 30 株。 经形态学
鉴定,它们属于镰孢菌属的 6 个种,即燕麦镰孢
F． avenaceum、木贼镰孢 F. equiseti、禾谷镰孢 F.
graminearum、腐皮镰孢 F. solani、尖镰孢 F. oxys-
porum 和拟轮枝镰孢 F. verticillioides(表 1)。 通
过与已报道的镰孢菌转录延伸因子序列的比
对,证实了形态学鉴定结果的准确性 (图 1 ) 。
经统计分析,尖镰孢菌的分离频率为 56 . 7% ,为
优势菌。 而从健康大豆根部分离的镰孢菌均为
腐皮镰孢。
Table 1　 Characteristic of soybean inoculated by Fusarium isolates
Group Species Straincode PDI
Root
length
Plant
height
Ground fresh
weight
Underground
fresh weight
A F. equiseti FeA 24. 0 abcde 19. 5 abcd 25. 4 ab 2. 8 abc 0. 99 abcde
F. oxysporum FoA-1 33. 3 abcd 13. 3 cd 19. 2 bcd 1. 9 abc 0. 49 cdef
FoA-2 60. 0 abcd 13. 2 cd 19. 2 bcd 1. 9 bc 0. 50 cdef
FoA-3 64. 0 abcd 13. 6 bcd 19. 6 bcd 1. 8 bc 0. 51 cdef
B F. oxysporum FoB-1 66. 6 abc 12. 7 cd 18. 9 bcd 1. 7 bc 0. 49 cdef
FoB-2 36. 0 abcde 11. 9 cd 15. 6 cd 1. 7 bc 0. 47 def
C F. oxysporum FoC 72. 0 ab 11. 7 cd 15. 6 cd 1. 7 bc 0. 45 def
F. equiseti FeC 50. 0 abcde 19. 5 abcd 20. 7 abcd 2. 6 abc 1. 06 abcde
F. solani FsC 26. 7 abcde 19. 8 abcd 23. 8 ab 2. 6 abc 1. 08 abcde
D F. oxysporum FoD 40. 0 abcde 16. 0 abcd 22. 0 abc 2. 1 abc 0. 68 bcdef
F. graminearum FgD 66. 6 abc 12. 3 cd 19. 9 bcd 2. 0 abc 0. 49 def
E F. equiseti FeE 40. 0 abcde 17. 1 abcd 22. 3 abc 2. 2 abc 0. 71 bcdef
F. oxysporum FoE-1 53. 2 abcde 17. 5 abcd 22. 5 abc 2. 2 abc 0. 71 bcdef
FoE-2 56. 0 abcde 14. 1 bcd 20. 1 abcd 2. 0 abc 0. 56 cdef
FoE-3 28. 0 abcde 14. 1 bcd 20. 3 abcd 2. 0 abc 0. 53 cdef
F F. oxysporum FoF 63. 3 abcd 17. 5 abcd 21. 2 abcd 2. 1 abc 0. 69 bcdef
F. verticillioides FvF 40. 0 abcde 16. 1 abcd 21. 4 abcd 2. 1 abc 0. 72 bcdef
F. solani FsF 8. 0 de 21. 3 abc 25. 1 ab 2. 8 abc 1. 10 abcd
G F. oxysporum FoG 80. 0 a 11. 5 cd 15. 1 cd 1. 7 c 0. 36 ef
F. graminearum FgG 80. 0 a 11. 3 cd 14. 4 d 1. 6 c 0. 21 f
F. verticillioides FvG 40. 0 abcde 18. 4 abcd 26. 5 ab 2. 5 abc 0. 93 abcde
H F. oxysporum FoH-1 40. 0 abcde 14. 6 abcd 21. 7 abcd 2. 1 abc 0. 69 bcdef
FoH-2 50. 0 abcde 19. 1 abcd 24. 8 ab 2. 5 abc 0. 92 abcde
I F. avenaceum FaI 46. 6 abcde 16. 5 abcd 21. 9 abcd 2. 1 abc 0. 67 bcdef
F. equiseti FeI 50. 0 abcde 18. 8 abcd 24. 1 ab 2. 4 abc 1. 03 abcde
F. oxysporum FoI-1 40. 0 abcde 15. 6 abcd 22. 4 abc 2. 0 abc 0. 74 bcdef
FoI-2 76. 6 ab 10. 0 d 15. 9 cd 1. 6 c 0. 17 f
J F. oxysporum FoJ 46. 6 abcde 16. 7 abcd 21. 5 abcd 2. 1 abc 0. 65 bcdef
K F. solani FsK-1 20. 0 bcde 19. 8 abcd 25. 7 ab 2. 7 abc 1. 09 abcd
FsK-2 10. 0 cde 19. 9 abcd 24. 4 ab 2. 7 abc 1. 16 abcd
CK - - CK-1 0 e 24. 5 a 27. 7 a 3. 0 ab 1. 55 a
- - CK-2 0 e 21. 3 abc 25. 2 ab 2. 9 abc 1. 31 ab
- - CK-3 0 e 23. 6 ab 25. 0 ab 3. 2 a 1. 20 abc
Letters A-J: The group of diseased soybean; K: The group of health soybean; CK: The control of the pathogenicity test;
PDI: Percentage disease incidence; The same superscript letter(s) showing differential significance at P =0. 05.
305
　
植物病理学报 43 卷
Fig. 1　 Phylogenetic tree based on sequence analysis of Fusarium isolates and DGGE bands
Geejayessia desmazieri as the out-group. Value in brackets corresponding the contribution percentage of Fusarium band in DGGE
banding patterns, and the same superscript letter(s) after percent contribution showing differential significance at P =0. 05.
2. 2 　 大豆病根部位定殖镰孢菌种群的 DGGE
分析
通过对大豆根部镰孢菌种群的 DGGE 分析,
得到 DNA指纹图谱,并检测到位置不同的条带 13
条(图 2)。 对其分别克隆测序后得到 9 个条带测
序结果,再根据系统发育树将其中的 8 个鉴定到种
水平,包括按上述传统方法分离得到的 6 种镰孢
菌、黄色镰孢 F. culmorum以及一种与尖镰孢菌近
缘的未知镰孢菌(图 1)。 研究结果表明,DGGE 技
术较传统分离培养和鉴定技术可鉴定出更多的真
菌种类。 同时,按照条带辉度比率,尖镰孢 F. oxy-
sporum 仍为优势菌,但与传统分离结果相比其优
405
　
　 5 期 　 　 魏 巍,等:大豆根腐病原镰孢菌种群多样性 DGGE分析及其致病性研究
势程度有所下降,与木贼镰孢 F. equiseti、拟轮枝
镰孢 F. verticillioides和腐皮镰孢 F. solani间的差
异变得不显著 (P <0. 05)(图 1)。
Fig. 2 　 DGGE patterns of 10 groups of soy-
bean root rot symptomatic soybean
plants and a healthy control group
Lanes A-J: Represent groups with Fusarium root rot symp-
tom; K: Control group; Letters a-g: Represent excised and
sequenced bands.
2. 3　 镰孢菌致病性分析
将分离得到的 30 株镰孢菌对大豆进行致病性
测定,同时结合大豆生长发育调查(见表 1),结果
表明,3 株腐皮镰孢 F. solani 的致病能力较低,采
用腐皮镰孢接种的大豆生长发育情况与无接种对
照差异不显著(P >0. 05),证明其为非致病性镰孢
菌。 然而,其余的镰孢菌菌株即使侵染大豆根部并
发病明显,其致病性指数也只有在超过 60 时,才可
以在 F-检验中显示出与对照比较存在显著差异
(P <0. 05)。 另外,虽然菌株 FeC 和 FeI 的致病性
指数较高,但大豆被它们侵染后的诸项生育指标均
与对照差异不显著(P > 0. 05),表现为正常的生长
发育状态;菌株 FoE-3、FoA-1 和 FoB-2 的致病性
指数均低于 40,但大豆被其侵染后的诸项生育指
标均低于病性指数为 40 的 FvF 等菌株;菌株 FoE-
1 和 FoF的致病性指数较高,但大豆被其侵染后的
根长和地上鲜重则显著高于同等致病能力的其它
菌株,如 FoE-2(P <0. 05)。 综上所述,仅依靠致病
性指数评价大豆根腐病原菌的致病力不够全面,容
易造成对病原菌致病力的夸大或忽略。
　 　 结合大豆株高、根长、地上鲜重、地下鲜重及致
病性指数进行主成分分析。 并得到第一主成分的
贡献值为 91. 2% ,远大于第二主成分的 5. 8% (图
3)。 说明由上述 5 个变量降维而成的第一主成分
可以准确地代表并指示大豆根腐病的发病程度,同
时可以忽略其他主成分的影响。 研究中的 30 株镰
孢菌菌株被第一主成分代表的坐标横轴划分为致
病性和非致病性类群,即以零为界,在第一主成分
上得分值正值的为非致病性种类,负值为致病性种
类。 非致病性类群Ⅰ包括无镰孢菌接种对照的 3
个重复处理、健康及从罹病大豆根部分离获得的 4
株腐皮镰孢 F. solani。 致病性类群Ⅱ内部按致病
程度又可分为高、中、低 3 个子群。 而第二主成分
则划分出病情指数和大豆生育指标不一致的类群
Ⅲ、类群Ⅳ和类群Ⅴ。 其中,类群Ⅲ包含了病情指
数较高,但大豆生育指标正常的 4 株镰孢菌。 按照
其第一主成分中的得分值及实际大豆生长发育情
况,该类群应隶属于非致病类群。 而另两个类群
中,类群Ⅳ包含的是 3 株表现致病性低,但大豆生
育指标非正常(发育不良)的尖镰孢菌 F. oxyspo-
rum;类群Ⅴ的两株尖镰孢菌 F. oxysporum的致病
性虽然很高,但受侵大豆的部分生育指数,如株高、
地上鲜重等则显著高于同水平的其它致病性菌株。
同样,依照其第一主成分中的分值和综合的生长发
育情况,这两个类群应隶属于致病性类群。 综上所
述,确定燕麦镰孢 F. avenaceum、禾谷镰孢 F. gra-
minearum和尖镰孢菌 F. oxysporum为致病性镰孢
菌,而木贼镰孢 F. equiseti、腐皮镰孢 F. solani 和
拟轮枝镰孢 F. verticillioides为非致病性镰孢菌。
3　 讨论与结论
长期以来,环境样品中镰孢菌属的种群特征多
应用平板分离和形态学鉴定等方法进行分析。 可
用于镰孢菌属平板分离法的培养基种类繁多,例如
Peptone PCNB Agar 培养基(PPA ,别名为 Nash-
Snyder 培养基) [15]、Malachite Green Agar 培养基
(MGA ) [16]、 Selective Fusarium Agar 培 养 基
(SFA) [17]以及 Rose Bengal-Glycerine-Urea Medium
(RbGU) [18]。 每种培养基均可以对多种镰孢菌进行
505
　
植物病理学报 43 卷
Fig. 3　 Principal component analysis for pathogenicity of Fusarium isolates
CK: Represents healthy soybean plants without inoculation; Fa, Fe, Fg, Fo, Fs and Fv: Represent F. avenaceum,
F. equiseti, F. graminearum, F. oxysporum, F. solani and F. verticillioides, respectively.
Letters A-J: Correspond the Fusarium strains in Table 1.
选择性分离,因此,采用多种培养基进行分离可获
得更为全面的镰孢菌种群构成信息。 然而,这种分
离方法耗时长、工作量大,且需要操作人员具有丰
富的分离经验。 DGGE 方法不依靠菌株的分离和
培养,可以有效地避免培养基营养限制带来的镰孢
菌种群信息的遗漏。 从本研究所开展的传统组织
分离和 DGGE 分析结果可以发现,大豆根部优势
寄生菌尖镰孢对应的条带亮度百分比值要远低于
其分离频率值,这很可能是由于尖镰孢菌更易于分
离培养的特性从而导致其分离频率结果被高估。
同时,采用 DGGE 方法得到的大豆根部定殖镰孢
菌的种类多于传统的分离方法,弥补了组织分离法
中镰孢菌种群信息的遗漏。 与此同时,值得注意的
是 DGGE图谱中也出现了有待解释的现象,如条
带 a和 b经测序发现均为尖镰孢菌 F. oxysporum
(图 2),比对两条带测序结果发现,在对应引物
Alfie-2 的简并性碱基 R的位置上有 1 个碱基不同
(碱基 A和 G),而其余所有碱基均 100%匹配。 因
此,条带 a和 b可能是由于 1 个碱基的差异而被聚
丙烯酰胺凝胶分离。 此外,从现代镰孢菌分类角度
来看,尖孢镰孢 F. oxysporum已被视为复合种[19],
本文 DGGE分析中发现的条带 a 和 b 也可能佐证
了尖孢镰孢菌复合种的存在。 同时也说明条带 a
和 b所占百分比之和才能代表大豆根部尖镰孢菌
F. oxysporum所占的比率。 尽管该项结论仍需进
一步经过严格地试验验证,但其也展示了 DGGE
方法检测的灵敏度。 由此可见,有效地结合植物病
原菌的传统分离方法和 DGGE 方法可以更为准确
和全面地分析植物病原菌的种群构成特征。
在镰孢菌的系统发育研究中,人们已应用了多
种基因序列进行研究,例如 β 微管蛋白基因序列
(β-tubulin, tub-2) [20]、线粒体小亚基序列 (mito-
chondrial small subunit,mtSSU) [21]和细胞色素 C
序列( cellobiohydrolase-c,cbh-c) [22]。 其中应用较
为广泛,信息积累丰富的序列应为转录延伸因子序
列 tef-1[23]。 而根据该基因序列信息,Geiser 等[23]
建立了镰孢菌基因数据库———FUSARIUM ID v.
1. 0。 本研究采用了转录延伸因子序列 tef-1 基因
对镰孢菌分离菌株和 DGGE 条带的 DNA 序列进
行了系统发育分析,研究结果也为验证该序列的全
605
　
　 5 期 　 　 魏 巍,等:大豆根腐病原镰孢菌种群多样性 DGGE分析及其致病性研究
面有效性提供了参考依据。 所有分离菌株和
DGGE条带序列与 USARIUM ID v. 1. 0 数据库中
的相关镰孢菌序列高度匹配,证明本研究所采用的
tef-1 基因序列所得的镰孢菌属亲缘关系分析结果
是可靠的。
大豆根腐病是一种世界性土传病害,其病原菌
构成以镰孢菌属真菌为主。 美国学者认为大豆根
腐病是由镰孢菌属(Fusarium spp. )和腐霉菌属
(Pythium spp. )复合侵染引起的[2],也有人认为是
由由腐皮镰孢 B 型分类单元(F. solani form B,
FSB) [24]单独侵染所至。 加拿大学者认为大豆根
腐病主要由尖镰孢 F. oxysporum 和禾谷镰孢 F.
graminearum联合侵染[25]。 我国大豆根腐病的病
原菌同样以镰孢菌属为主。 由于大豆种植地域广
泛,致病性镰孢菌呈现出极为丰富的多样性分布。
山东省以腐皮镰孢 F. solani 为优势菌种,尖镰孢
F. oxysporum和木贼镰孢 F. equiseti次之[1];安徽
省淮北地区大豆根腐病原为三线镰孢 F. tricinc-
tum、壳生镰孢 F. episphaeria、腐皮镰孢 F. solani
和尖镰孢 F. oxysporum[26];陕西省汉中地区大豆
根腐病原为腐皮镰孢 F. solani和尖孢镰孢芬芳变
种 F. oxysporum var. redolens (现更名 F. redo-
lens) [27];黑龙江省已报道过有尖镰孢 F. oxyspo-
rum、腐皮镰孢 F. solani、禾谷镰孢 F. graminea-
rum、燕麦镰孢 F. avenaceum和半裸镰孢 F. semi-
tectum[5,6]。 在上述研究中,人们基本上通过对接
种病原菌的寄主植物的主根须根健全程度、根瘤多
少以及病斑面积进行观察和测量后,计算得出病原
镰孢菌的致病性指数[8]。 然而,在实际操作过程
中根部损坏和根瘤脱落等情况可以造成观测结果
的不准确性,从而产生试验误差。 由于很难为这种
情况制定统一的评价标准,因此,结合多种数据以
及建立科学的分析体系对保证致病性检测结果的
准确性具有重要的意义。
主成分分析(PCA)可以将原始的多数个变量
重新组合成互相无关的少数几个综合变量,同时根
据实际需要以这些少数几个综合变量来反映原来
变量的所有信息。 本研究综合了大豆多个易被根
腐病影响的生育指标,应用主成分分析方法对其进
行了分析。 分离获得的 30 株镰孢菌被分为 5 个各
类群(图 3)。 由第一主成分划分出的类群Ⅰ和Ⅱ
所包含的镰孢菌株的致病性指数与被其侵染大豆
的生育指标之间存在较好的一致性,因此,可视为
致病性分类的标准类群。 而第二主成分上分值较
高的菌株,如 FeC、FeI、FoE-1 和 FoF表现出致病能
力被高估;相反,如 FoE-3、FoA-1 和 FoB-2 则表现
出致病能力被低估。 由此可见,第二主成分可以进
行致病性检测错误结果的校正,从而辅助完成致病
性类群的区分。 由此可见,多重数据的主成分分析
结果可以更为明确地定义镰孢菌的致病力,避免镰
孢菌致病力诊断错误。 最后,结合传统分离鉴定、
致病力测定、DGGE技术以及主成分分析等研究结
果,明确该大豆连作定位试验区内根腐病病原镰孢
菌种群以尖镰孢 F. oxysporum 为主,同时存在禾
谷镰孢 F. graminearum和燕麦镰孢 F. avenaceum
复合侵染。
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