全 文 ：NO3
- / NO2
-对渤海湾油藏中硫酸盐还原菌
SO4
2-还原活性的抑制效应*
刘洪玉1,2摇 史荣久1**摇 张摇 颖1摇 史振国1,3摇 张潆月1,4摇 于摇 亮5摇 张小波5摇 谈摇 涛5
( 1中国科学院沈阳应用生态研究所 /中国科学院污染生态与环境工程重点实验室, 沈阳 110016; 2中国科学院大学, 北京
100049; 3黑龙江八一农垦大学, 黑龙江大庆 163319; 4沈阳师范大学化学与生命科学学院, 沈阳 110034; 5天津亿利科能源科
技发展股份有限公司, 天津 300384)
摘摇 要摇 长期注水开发促进了渤海湾海域油藏中硫酸盐还原菌(SRP)的生长繁殖,产生了大
量 H2S,引起油藏酸化(souring)等问题. 本文首先以改进的 API RP 38 培养基富集了渤海湾
海域某油藏采出井井口采出液中的 SRP,再通过批次试验研究了不同浓度 NO3 -和 NO2 -对
SRP富集培养物 SO4 2-还原活性的抑制效应. 结果表明: 渤海湾海域油藏中的 SRP 富集培养
物 SO4 2-还原活性较强,SO4 2-还原速率为 10. 4 mmol SO4 2-·d-1·g-1 dry cell;加入浓度为 0. 4、
0. 8、1. 8、4. 2 mmol·L- 1NO3 -时,SRP 富集培养物的 SO4 2-还原活性均可被抑制,维持时间分
别为 5、9、20 和大于 35 d;加入浓度为 0. 6、0. 9、1. 4、2. 6 或 4. 6 mmol·L-1的 NO2 -时,SO4 2-还
原活性也被抑制,维持时间分别为 3、12、22 和大于 39 d. SRP富集培养物具有异化 NO3 -还原
成 NH4 +的代谢途径.当环境中同时存在 SO4 2-、NO3 -、NO2 -时,SRP富集培养物优先利用 NO3 -
和 NO2 - . SRP富集培养物对电子受体的优先利用及 NO2 -的毒性效应是 NO3 - / NO2 -抑制渤海
湾海域油藏中 SO4 2-还原活性的主要原因.
关键词摇 渤海湾摇 硫酸盐还原菌摇 富集培养物摇 硫酸盐还原活性摇 硝酸盐
*国家自然科学基金项目(31270167)资助.
**通讯作者. E鄄mail: shirongjiu@ iae. ac. cn
2013鄄12鄄03 收稿,2014鄄05鄄16 接受.
文章编号摇 1001-9332(2014)08-2369-08摇 中图分类号摇 Q935, Q939. 99摇 文献标识码摇 A
NO3 - / NO2 - inhibits sulfate鄄reducing activity of the enrichment culture of sulfate鄄reducing
prokaryotes from an off鄄shore oil reservoir at Bohai Bay, China. LIU Hong鄄yu1,2, SHI Rong鄄
jiu1, ZHANG Ying1, SHI Zhen鄄guo1,3, ZHANG Ying鄄yue1,4, YU Liang5, ZHANG Xiao鄄bo5, TAN
Tao5 ( 1 Key Laboratory of Pollution Ecology and Environmental Engineering, Institute of Applied
Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, China; 2University of Chinese Academy of
Sciences, Beijing 100049, China; 3Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, Hei鄄
longjiang, China; 4College of Chemistry and Life Sciences, Shenyang Normal University, Shenyang
110034, China; 5E鄄Tech Energy Technology Development Co. , Ltd. , Tianjin 300384, China) .
鄄Chin. J. Appl. Ecol. , 2014, 25(8): 2369-2376.
Abstract: Long鄄term injection of sulfate鄄rich water into oil reservoirs stimulates the proliferation of
sulfate鄄reducing prokaryotes ( SRP) therein and results in production of a great amount of H2 S,
leading to souring in oil reservoirs and related environmental problems. In this study, we first,
using modified API RP 38 medium, enriched SRP present in production water from a producing well
at Bohai Bay, China, and then examined the inhibitory effects of nitrate or nitrite on sulfate reduc鄄
tion activity of the SRP. Results showed that the enriched SRP culture exhibited a high sulfate re鄄
duction activity as indicated by a sulfate鄄reducing rate of 10. 4 mmol SO4 2-·d-1·g-1 dry cell. In
presence of 0. 4, 0. 8, 1. 8, and 4. 2 mmol·L-1 nitrate, sulfate reduction was inhibited for 5, 9,
20, and over 35 days, respectively. With the addition of 0. 6, 0. 9, 1. 4, 2. 6 and 4. 6 mmol·L-1
of nitrite, the inhibitory period lasted 3, 12, 22, and over 39 days, respectively. The SRP enrich鄄
ment culture could dissimilatorily reduce nitrate to ammonium. When sulfate, nitrate and nitrite co鄄
应 用 生 态 学 报摇 2014 年 8 月摇 第 25 卷摇 第 8 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Aug. 2014, 25(8): 2369-2376
existed, nitrate or nitrite was preferentially used over sulfate as electron acceptor by the enriched
SRP. This competitive use of electron acceptor and the strong inhibitory effect of nitrite possibly ac鄄
counted for the suppression of nitrate and nitrite on the sulfate鄄reducing activity of the enriched SRP
cultures from offshore oil reservoir at Bohai Bay.
Key words: Bohai Bay; sulfate鄄reducing prokaryotes; enrichment culture; sulfate鄄reducing activi鄄
ty; nitrate.
摇 摇 硫酸盐还原菌 ( sulfate鄄reducing prokaryotes,
SRP)是一大类以有机碳源或是 H2作为电子供体还
原 SO4 2-生成硫化物(H2 S、HS-)以获取能量进行生
长代谢的厌氧微生物的统称[1-2] . SRP 普遍存在于
油藏(oil reservoir)及石油开采各工艺环节的罐体、
管道等厌氧环境中[3-4] .在石油开采过程中,向油藏
中注水以提高原油采收率是油藏开发最重要的方法
之一. 然而,注入水中富含的 SO4 2-促进了油藏中
SRP的生长和代谢,产生 H2S,进而引发一系列的生
产及环境问题,例如,SRP的生长繁殖及持续代谢活
性会加速油田采、输油管线等金属设施的腐蚀[5-6];
SRP产生的 H2S还会降低原油和天然气的质量,并
严重危害工人的身体健康.油藏及采出水中 SRP 危
害的有效控制是石油工业中亟待解决的重大生产及
环境问题之一[7-8] .
目前,各油田普遍使用化学杀菌剂(如戊二醛、
四羟甲基硫酸磷等)控制 SRP 的活性和数量[9] . 但
是,长期使用化学杀菌剂,SRP会逐渐对某一特定杀
菌剂产生耐受性,进而导致所需杀菌剂的浓度逐渐
增加;更重要的是,化学杀菌剂毒性强,具有很大的
环境风险.因此,寻求环境友好、经济有效的新型技
术势在必行.近些年来,通过调控油藏内硝酸盐还原
菌等微生物类群的活性以抑制 SRP 的代谢活性,进
而控制油藏酸化的研究和实践受到广泛重视[10-11] .
已有研究显示,向油藏中加入 NO3 -激活油藏中的异
养硝酸盐还原菌(heterotrophic nitrate鄄reducing bacte鄄
ria,hNRB)使其与 SRP竞争电子供体(有机碳源)可
实现对 SRP代谢活性的竞争性抑制[12-13] . 此外,有
些 hNRB 和自养硝酸盐还原鄄硫化物氧化菌(nitrate鄄
reducing sulfide鄄oxidizing bacteria,NR鄄SOB)能够将
SRP产生的 H2 S 氧化去除[12,14] . 另一些研究则显
示,NO3 -还原过程中产生的 NO2 -对 SRP 细胞内亚
硫酸盐还原酶活性具有强烈的抑制作用[15-16];NO3 -
还原过程导致环境氧化还原电位升高,SO4 2-还原作
用无法进行.与化学杀菌剂等方法相比,“生物抑制
法冶环境友好、经济可行[7-8] .尽管如此,油藏环境的
巨大异质性和 SRB 种群组成的多样性[17-18]决定了
NO3 -抑制油藏酸化作用机制的复杂和不确定性,该
过程所需 NO3 -的剂量和抑制作用效果常受油藏中
SRB的种群组成、注水水质、有机物浓度等因素的影
响[12] .因而,特定油藏的酸化控制需要具体问题具
体分析.
渤海湾海域油藏是我国第二大产油区,占我国
海上石油产量的 50%以上. 据不完全统计,目前建
有海上油田 17 个,包含海上平台 184 座和 1094 口
采油井[19] .随着开采时间的延长,大多油井已呈不
同程度的酸化,且日趋严重(部分采出井伴生气中
的 H2S浓度高达 600 mg·L-1). 然而,有关渤海湾
海域油藏酸化及控制的微生物学机理研究十分缺
乏[20] .本文首先富集了渤海湾海域某特定高温油藏
中的 SRP,并研究了 NO3 -和 NO2 -对抑制 SRP 代谢
活性的影响,为揭示渤海湾海域高温油藏酸化机理
并控制 SRP危害提供理论基础,并进一步丰富油藏
环境微生物生理生态学认识.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 油藏采出水及采出水中 SRP的富集
油井采出水取自渤海湾海域我国某油田采油平
台.该油井井深 1450 m,油藏温度约为 60 益,已经
注海水或地层水开发 17 年以上,油井采出液含水
58% ,pH为 7. 8. 在采油井取样口采集到采出液后
迅速转移至无菌塑料取样桶中,并尽快运抵实验室
(约 10 d).采出水中 H2S浓度约为 100 mg·L-1,硫
酸盐还原菌数量(MPN计数法)在 102 cells·mL-1数
量级水平. 采出水中 SO4 2-含量为 20 mg·L-1,Cl-1
含量为 4800 mg·L-1 .
在美国石油协会(American Petroleum Institute)
推荐的 API RP 38 培养基[21-22]基础上进行微调并采
用此培养基(以下简称 API鄄M 培养基)对采出水中
的 SRP 进行富集培养,培养基组分是 ( g·L-1 ):
NaCl 3. 0,酵母膏 1. 0,MgSO4·7H2O 0. 2,KH2 PO4
0. 5,维生素 C 0. 1,乳酸钠 4. 0,pH=7. 2.
将 API鄄M 培养基煮沸,然后冷却至室温,再分
装 250 mL液体培养基至总体积为 300 mL的血清瓶
0732 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
中,迅速用丁基胶塞密封,并用铝盖进一步压紧密
封. 培养基煮沸后冷却、分装等过程在高纯 N2
(99郾 99% ) 保护条件下完成. 采用高温蒸汽法
(121 益,20 min)对分装好的血清瓶进行灭菌.
取 25 mL采出水,用无菌注射器注入事先灭菌
的装有 API培养基的血清瓶中,然后置于 60 益恒温
培养箱中避光静止培养.
1郾 2摇 NO3 - / NO2 -抑制 SRP富集培养物 SO4 2-还原活
性的批次试验
用无菌注射器取适量体积第 8 天的 SRP 富集
培养菌液,8000伊g 离心 5 min 后弃上清,收集菌体
细胞,然后用与所弃上清等体积的新鲜配制的 API鄄
M培养基重悬菌体沉淀,并按 5%比例用无菌注射
器将 SRP富集菌液接种至各血清瓶中.使用无菌注
射器向血清瓶内补加等体积的经 0. 22 滋m 滤膜过
滤除菌的不同浓度的 KNO3 或 NaNO2 高浓度储备
液,使 NO3 -终浓度为 0. 4、0. 8、1. 8、4. 2 mmol·L-1;
NO2 -终浓度为 0郾 60. 9、1. 4、2. 6、4. 6 mmol·L-1 .另
设既不加 NO3 -也不加 NO2 -的空白对照,加入等体
积无菌蒸馏水.每处理 3 个重复.最后将所有血清瓶
置于 60 益恒温培养箱中避光、静止培养.定期取水
样测定 H2S、SO4 2-、NO3 -、NO2 -以及 NH4 +浓度变化.
1郾 3摇 分析方法
H2S 的测定采用分光光度法[23];SO4 2-、NO3 -、
NO2 -浓度采用离子色谱仪(ICS鄄900,戴安中国有限
公司)进行测定,色谱柱为 AS22 分析柱,所用淋洗
液为 4. 5 mmol · L-1 Na2 CO3 和 1. 4 mmol · L-1
NaHCO3,其流速为 1. 2 mL·min-1,色谱柱柱温为
30 益,所用抑制器为 ASRS;NH4 +含量采用流动化学
分析仪(FUTURA,Alliance Instruments)进行测定.采
出水及富集培养物中 SRP 的数量测定采用 MPN 法
完成.
1郾 4摇 数据处理
采用 SPSS 17. 0 软件中的单因素方差分析
(one鄄way ANOVA)法对 NO3 -或 NO2 -抑制 SRP富集
培养物 SO4 2-还原活性的效应进行统计分析. 采用
Microsoft Excel 2010 软件绘图.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 API鄄M 培养基对渤海湾海域目的油藏中 SRP
的富集效果
API鄄M培养基适用于本研究中油井采出液中
SRP的富集.从接种后的第 4 天开始,培养瓶中 H2S
浓度 逐 渐 增 加, 第 10 天 达 到 最 大, 为 1郾 36
mmol·L-1,初始加入的 1. 39 mmol·L-1 SO4 2-几乎
被完全还原(转化率为 97. 8% ).从第 6 天开始培养
瓶中菌液明显浑浊.截至第 10 天,血清瓶中 SRP 的
数量为 108 CFU·L-1,生物量为 0. 05 mg·mL-1 .此
阶段 SO4 2-还原速率为 10. 4 mmol SO4 2-·d-1·g-1
dry cell.
2郾 2摇 不同浓度的 NO3 -对 SRP 富集培养物 SO4 2-还
原活性的抑制
NO3 -对 SRP富集培养物 SO4 2-还原活性具有明
显的抑制作用,且其抑制时间长短与初始加入的
NO3 -浓度高低有关.不加 NO3 -的对照瓶中(图 1A),
从第 2天开始 H2 S 浓度逐渐增加,而加入不同浓度
NO3 -的培养瓶中监测到 H2 S 产生的时间明显较晚.
按 NO3 -浓度由低到高的顺序,培养瓶中 SO4 2-还原活
性被抑制的时间分别为 5、9、20和>35 d(图 1).
摇 摇 加入培养瓶中的 NO3 -在 24 h 内被迅速转化为
几乎等量的 NO2 -, 表明 SRP 富集培养物能够利用
NO3 -为电子受体进行代谢. 值得注意的是,尽管
NO3 -很快被耗尽,但产生的 NO2 -一直保持了对 SRP
富集物 SO4 2-还原活性的抑制,甚至当 NO2 -也被消
耗之后的一段时间内,SRP的 SO4 2-还原过程依然没
有启动(图 1C、D). 初始加入 NO3 -的量越高,产生
NO2 -的浓度越大,SRP 富集物 SO4 2-还原活性被抑
制的时间则越长(图 1D).这些结果说明,NO3 -所表
现的对 SRP富集培养物 SO4 2-还原活性的抑制作用
可能主要源自于 NO2 -的毒性作用. 当初始 NO3 -浓
度低于 1. 8 mmol·L-1时,尽管 SRP 富集培养物的
SO4 2-还原活性被暂时抑制,但是 SRP细胞并未被杀
死,并最终恢复了对 SO4 2-的还原活性.而当 NO3 -初
始浓度为 4. 2 mmol·L-1时,SRP 的 SO4 2-还原活性
在试验观测期内一直没有恢复, 培养瓶内 H2S 浓度
与对照组差异显著(P<0. 01).
摇 摇 为了明确 NO3 -的转化路径,我们在特定时间点
取样测定了培养瓶中 NH4 +的浓度,结果见表 1. 第
15 天时,所有添加 NO3 -的处理组的 NH4 +浓度均明
显高于对照组. NO3 - 初始浓度为 0郾 4 和 0郾 8
mmol·L-1的处理组中,第 15 天时培养瓶中 NH4 +浓
度的净增加量与初始加入的 NO3 -量吻合. 此时,添
加 1. 8 和 4. 2 mmol·L-1的处理组中 NH4 +浓度的净
增加量相对较小,其原因可能是 SRP 富集培养物在
高 NO2 -浓度条件下其转化 NO2 -成 NH4 +的活性受
到了抑制.
17328 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 刘洪玉等: NO3 - / NO2 -对渤海湾油藏中硫酸盐还原菌 SO4 2-还原活性的抑制效应摇 摇 摇 摇
2郾 3摇 不同浓度的 NO2 -对 SRP 富集培养物 SO4 2-还
原活性的抑制效应
NO2 -对 SRP富集培养物 SO4 2-还原活性的抑制
效果如图 2 所示.前 4 d, 添加 0. 6 mmol·L-1 NO2 -
的处理组瓶内 SO4 2-浓度与 NO2 -浓度同时出现了降
低,但培养瓶中未监测到 H2S 的生成(图 2A).该结
果与补加低浓度 NO3 -的处理组(图 1B)有些差异.
添加0郾 9、1郾 4 mmol·L-1的NO2 -对SRP的SO4 2-还
图 1摇 不同浓度 NO3 -对渤海湾海域油藏中 SRP富集培养物 SO4 2-还原活性的抑制效应
Fig. 1摇 Inhibition effect of nitrate on the enrichment cultures of sulfate鄄reducing prokaryotes from off鄄shore oil reservoir in Bohai Bay.
A:对照 Control (NO3 - =0 mmol·L-1); B: NO3 - =0. 4 mmol·L-1; C: NO3 - =0. 8 mmol·L-1; D: NO3 - =1. 8 mmol·L-1; E: NO3 - =4. 2 mmol·L-1 .
图 2摇 不同浓度 NO2 -对渤海湾海域油藏中 SRP富集培养物 SO4 2-还原活性的抑制效应
Fig. 2摇 Inhibition effect of nitrite on the enrichment cultures of sulfate鄄reducing prokaryotes from off鄄shore oil reservoir in Bohai Bay.
A: NO2 - =0. 6 mmol·L-1; B: NO2 - =0. 9 mmol·L-1; C: NO2 - =1. 4 mmol·L-1; D: NO2 - =2. 6 mmol·L-1; E: NO2 - =4. 6 mmol·L-1 .
2732 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
表 1摇 各培养瓶中 NH4 +的浓度变化
Table 1摇 Changes in the concentration of NH4 + in different
serum bottles
取样时间
Sampling
time
(d)
NH4+浓度 NH4+ concentration (mmol·L-1)
对照
Control
0. 4
mmol·L-1
NO3-
0. 8
mmol·L-1
NO3-
1. 8
mmol·L-1
NO3-
4. 2
mmol·L-1
NO3-
0 0. 85 0. 88 0. 86 0. 87 0. 83
10 1. 11 1. 06 1. 12 0. 89 1. 28
15 1. 05 1. 59 1. 93 1. 62 1. 26
NH4+浓度净增加
量 Increment of
NH4+ concentration
0. 20 0. 71 1. 07 0. 75 0. 43
原活性的抑制时间分别为 12 和 22 d(图 2B、C);而
2. 6、4. 6 mmol·L-1的 NO2 -的抑制时间则>39 d(图
2D、E).相似地,在 NO2 -初始浓度臆1. 4 mmol·L-1
的处理组中,SRP 的 SO4 2-还原活性最终得以恢复,
此浓度下处理组与对照组在培养末期瓶内 H2 S 浓
度无显著差异.我们在培养末期仍监测到了 NH4 +浓
度的净增加,提示 SRP富集培养物细胞内存在能将
NO2 -转化为 NH4 +的活性物质.
3摇 讨摇 摇 论
3郾 1摇 SRP富集培养物或纯菌株作为控制油藏酸化
的优势及局限性
油藏是典型的厌氧环境,栖息着多种微生物功
能类群[18,24] . 但由于纯培养技术方法的限制,目前
能够在实验室条件下得到纯培养的微生物种类仅占
总体的极小部分[25] . 尽管如此,获得纯培养的菌株
仍是我们深入了解微生物代谢过程和机理的必不可
少的一环[26] .通过富集培养基对采出水中特定功能
微生物进行富集培养或进一步从中筛选出纯菌株是
油藏环境微生物生理生态学研究的重要方法之
一[16,27] .需要指出的是,目前已报道的各种 SRP 富
集培养基也仅是选择性地从采出水中获得了某一类
目的微生物种群(极有可能其他非目的种群也会生
长),可能仍然具有极大的偏倚性. 在本研究中,除
了 API鄄M 富集培养基之外,我们还尝试了其他两种
SRP的富集培养基,但同 API鄄M 相比,另两种培养
基所富集到的 SRP 生长速度及最终 SRP 菌体数量
均明显低于 API鄄M培养基(数据未给出).为了研究
方便,我们在后续研究中选择了 API鄄M 培养基,尽
管如此,必须指出的是,通过其他富集培养基所获得
的 SRP富集培养物的代谢特征及对 NO3 -和 NO2 -的
响应过程仍可能具有重要意义. 而富集培养基的选
择、培养基成分的优化以及不同富集培养基得到的
渤海湾海域油藏中 SRP 种群组成、代谢特点及对
NO3 -和 NO2 -的响应机制等科学问题仍需要在未来
的工作中加以补充.类似地,我们会在下一步工作中
尝试从富集培养物中进一步分离 SRP 的纯菌株并
加以研究.
在一定程度上,采用 SRP 富集培养物替代纯菌
株开展 NO3 - / NO2 -抑制油藏酸化的机理研究具有一
定优越性.因为富集培养物中可能包含了不同代谢
特征的多种 SRP.其不足之处是仍无法完全模拟油
藏真实微生物代谢特点. 在实验室搭建模拟油藏装
置(使用油田注入水)或者在采油平台建立模拟油
藏酸化的试验体系甚至是开展小规模的现场试验将
可能是潜在的有效途径,这些工作尚待开展.
3郾 2摇 NO3 -对渤海湾海域油藏中 SRP富集培养物硫
酸盐还原活性的抑制效应与机制推测
向油藏中补加 NO3 -以抑制 SRP 产生 H2S 是近
些年来研究的热点之一[28] .由于油藏中栖息的微生
物种类繁多,NO3 -抑制 SRP代谢活性进而抑制油藏
酸化涉及多种微生物生理类群共同参与的碳、氮和
硫元素的微生物转化过程,其交互作用机制极为复
杂[7-8] .目前,主要有如下几种认识:1)NO3 -的加入
促进了油藏中异养硝酸盐还原菌(hNRB)的生长和
代谢.同 SRP相比,hNRB具有更强的利用油藏环境
中电子供体(如小分子脂肪酸等有机物)的能力,进
而竞争性抑制 SRP 的代谢活性[12];2)自养硝酸盐
还原鄄硫化物氧化菌(NR鄄SOB)可将 SRP产生的 H2S
氧化去除(比如,将 S2-重新氧化成 SO4 2-或单质硫
等);3) NO3 -还原过程中产生中间代谢产物 (如
NO2 -等)对 SRP硫酸盐还原活性的抑制作用.例如,
NO2 -可强烈抑制多种 SRP 细胞内的亚硫酸盐还原
酶(Dsr)活性;4)上述 hNRB或 NR鄄SOB代谢过程中
引起环境中氧化还原电位的升高( >-150 mV),从
而改变 SRP 适宜生长的微环境,其 SO4 2-还原活性
相应地受到了抑制[29] . 我们选取了几种 hNRB 和
NR鄄SOB的富集培养基试图获得这两类特定功能微
生物生理类群,但并未成功(数据未给出). 尽管无
法完全排除,我们据此推测本研究中所获得的 SRP
富集培养物中很可能不包含 hNRB 和 NR鄄SOB 类
群.因而,由 hNRB与 NR鄄SOB代谢引起的有机碳源
竞争抑制不是影响本研究中 SRP 代谢活性的主要
原因.加入的 NO3 -和 NO2 -对 SRP 富集培养物硫酸
盐还原活性的抑制效应分别是 SRP 对不同电子受
体的优先选择作用和 NO2 -对 SRP 细胞内亚硫酸盐
37328 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 刘洪玉等: NO3 - / NO2 -对渤海湾油藏中硫酸盐还原菌 SO4 2-还原活性的抑制效应摇 摇 摇 摇
还原酶活性的抑制作用.如图 1 所示,当培养瓶中分
别加入 0. 4、0. 8、1. 8 mmol·L-1的 NO3 -时,SRP 富
集培养物均优先选择了 NO3 -作为电子受体进行代
谢,即还原 NO3 - 生成 NH4 + (其中间代谢物为
NO2 -). 需要注意的是,SRP 富集培养物利用 NO3 -
生成 NO2 -这一过程的速度非常快,加入的 NO3 -在
1 ~ 3 d内即被转化为 NO2 -(图 1B、C、D、E).相比较
而言,NO2 -进一步转化生成 NH4 +的过程则慢许多.
从这个角度来看,培养瓶中 NO2 -是保持对 SRP 的
SO4 2-还原活性长时间抑制的主要原因.后续的单独
使用 NO2 -的批次试验结果也证明了这一点.
在 hNRB和 NR鄄SOB种群丰度低的高温油藏环
境中,适当浓度的 NO3 -和 NO2 -仍能够很好地抑制
SRP的 SO4 2-还原活性,但是在具体的用量上还要根
据油藏注水的实际情况进行具体分析(如考虑注入
水在油藏内的停留时间等). 较低浓度的 NO3 -和
NO2 -尽管可以短期抑制 SRP 代谢活性,但 SO4 2-还
原活性最终在 NO2 -耗尽之后的不长时间内得以恢
复.这些结果需要在油藏酸化控制实践中加以考虑.
3郾 3摇 SRP富集培养物异化 NO3 -还原成 NH4 +的代
谢活性及对应用 NO3 -抑制油藏酸化的影响
已有研究显示,部分 SRP 除了能够以 SO4 2-为
唯一电子受体进行硫酸盐还原代谢以外,还能够以
NO3 -为电子受体进行异化 NO3 -还原成 NH4 +的代
谢[30-33] .能够进行异化 NO3 -还原成 NH4 +代谢的
SRP为数不多,主要有丙酸脱硫叶菌(Desulfobulbus
propionicus) [30]、儿茶酚脱硫杆菌 (Desulfobacterium
catecholicum) [31-32]以及脱硫弧菌(Desulfovibrio)属的
一些种[33-36] .
这些微生物类群已在油藏中被多次检测到[8],
暗示着由 SRP驱动的异化 NO3 -还原成 NH4 +的代谢
途径可能广泛存在于油藏环境中. 当 NO3 -和 SO4 2-
同时存在时,上述大多数 SRP 可以同时利用两种电
子受体.但据 Seitz 和 Cypionka[33]报道,脱硫脱硫弧
菌(Desulfovibrio desulfuricans)菌株 Essex 6 则优先利
用 NO3 -而非 SO4 2-;然而,另一些科学家对 Desulfo鄄
vibrio desulfuricans 菌株 C4S 的相关研究显示,如果
培养基中加入高浓度的 SO4 2-(1. 5 mmol·L-1或 5. 0
mmol·L-1),菌株异化 NO3 -还原成 NH4 +的活性则
受到强烈抑制.即使 SO4 2-被消耗殆尽,NO3 -还原成
铵的活性在随后的 10 h内仍没有恢复(NO3 -浓度始
终维持在 5 mmol·L-1) [37] .在本研究中,当 NO3 -和
SO4 2-同时存在时, SRP 富集培养物优先利用了
NO3 -而非 SO4 2-(图 1),这与 Seitz 和 Cypionka[33]的
研究结果相似.以往研究中涉及的 SRP 菌株皆来源
于中温环境(10 ~ 43 益),这与本研究中的样本环境
温度及培养温度显著不同. 本文试验结果明确证实
了渤海湾海域高温油藏环境中的 SRP 富集培养物
存在异化 NO3 -还原成 NH4 +的代谢途径.遗憾的是,
我们目前尚未分离得到具有该类功能的 SRP 的纯
菌株,因而也暂时无法对参与这一代谢过程的 SRP
的种属特征等进行更明确的描述和分析.显然,这一
工作在未来的研究中需要进一步补充和完善. 尽管
如此,本文首次报道了渤海湾海域高温油藏中的
SRP富集培养物具有异化 NO3 -还原成 NH4 +的代谢
途径,这是对以往研究结果的重要补充. 然而,需要
说明的是,一些兼性厌氧或严格厌氧微生物类群也
具有异化 NO3 -还原成 NH4 +的代谢途径[38-39] . 因
此,虽然我们使用了 SRP 的富集培养基,但无法排
除富集物中可能会同时存在类似功能的兼性厌氧或
严格厌氧微生物,这些微生物可能也对异化 NO3 -还
原成 NH4 +的过程有贡献.尽管如此,我们认为这类
微生物的贡献不是主要的,甚至是微不足道的.主要
理由是:1)假如兼性厌氧微生物或严格厌氧微生物
主导了异化 NO3 -还原成 NH4 +的过程,则加入的
NO3 -应该会被完全转化成 NH4 +,实际情况是培养
瓶中加入 4郾 20 mmol·L-1的 NO3 -并没有被完全转
化,瓶中 NH4 +的浓度仅从初始的 0. 83 mmol·L-1增
加到末期的 1郾 26 mmol·L-1 (图 1D);2)我们尝试
使用各种自养或异养的硝酸盐还原培养基从 A14
的井口采出液中富集硝酸盐还原菌,但均未成功.因
此,尽管没有直接证据证明本研究中使用的 SRP 富
集培养物中不包含具有异化 NO3 -还原成 NH4 +的非
SRP微生物种群,但以上间接证据在一定程度上可
能表明兼性厌氧或严格厌氧的非 SRP 种群对异化
NO3 -还原成 NH4 +的过程贡献不大.
油藏环境中如果存在微生物异化 NO3 -还原成
NH4 +的代谢途径对应用硝酸盐抑制油藏酸化是不
利的.一方面,如果 SRP本身具有该代谢途径,加入
NO3 -以后,SRP 的代谢由原来的 SO4 2-还原转变成
异化 NO3 -还原过程,但一旦 NO3 -被耗尽,SO4 2-还原
作用会很快恢复(图 2C、D). 从某种意义上说,SRP
细胞内异化 NO3 -还原成 NH4 +的代谢途径可能是
SRP解除“NO3 -抑制冶的一种方式[40] .另一方面,如
果驱动异化 NO3 -还原成 NH4 +代谢过程的不是
SRP,而是其他的兼性厌氧微生物种群,那么原本用
4732 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
于抑制 SRP代谢活性的 NO3 -会有一部分消耗在上
述代谢途径中,因而可能会增加 NO3 -的使用量. 这
些结果同时说明,不同油藏环境中 SRP 的种群多样
性、代谢活性可能决定了在应用硝酸盐控制油藏酸
化时需要根据油藏实际情况进行系统优化,或谓之
“具体问题具体分析冶 [8] .然而,无论从任何角度看,
加强油藏环境的微生物生理生态学研究[41]将是揭
示油藏酸化机制并最终解决问题的必经之路.
4摇 结摇 摇 论
NO3 -和 NO2 -对渤海湾海域油藏中 SRP 富集培
养物硫酸盐还原活性抑制效应随使用浓度的增加而
增加,添加 4. 20 mmol·L-1 NO3 -或 2. 6 mmol·L-1
NO2 -可实现对 SRP 富集培养物的长期抑制(大于
40 d);渤海湾海域高温油藏中 SRP 的富集培养物
具有异化 NO3 -还原成 NH4 +的代谢活性;NO3 -对
SRP富集培养物 SO4 2-还原活性的抑制机制主要是
由于 SRP对电子受体 NO3 -的优先利用和氨化过程
中产生的 NO2 -对 SO4 2-还原活性的抑制作用,而后
者可能起主要作用.
参考文献
[1]摇 Muyzer G, Stams AJM. The ecology and biotechnology
of sulphate鄄reducing bacteria. Nature Reviews Microbio鄄
logy, 2008, 6: 441-454
[2]摇 Rabus R, Hansen TA, Widdel F. Dissimilatory sulfate鄄
and sulfur鄄reducing prokaryotes / / Rosenberg E, DeLong
EF, Lory S, eds. The Prokaryotes. Berlin: Springer
Verlag, 2013: 310-379
[3]摇 Cord鄄Ruwisch R, Kleinitz W, Widdel F. Sulfate鄄redu鄄
cing bacteria and their activities in oil production. Jour鄄
nal of Petroleum Technology, 1987, 39: 97-106
[4]摇 Duncan KE, Gieg LM, Parisi VA, et al. Biocorrosive
thermophilic microbial communities in Alaskan north
slope oil facilities. Environmental Science & Technology,
2009, 43: 7977-7984
[5]摇 Schwermer CU, Lavik G, Abed RMM, et al. Impact of
nitrate on the structure and function of bacterial biofilm
communities in pipelines used for injection of seawater
into oil fields. Applied and Environmental Microbiology,
2008, 74: 2841-2851
[6]摇 Enning D, Venzlaff H, Garrelfs J, et al. Marine sulfate鄄
reducing bacteria cause serious corrosion of iron under
electroconductive biogenic mineral crust. Environmental
Microbiology, 2012, 14: 1772-1787
[7]摇 Youssef N, Elshahed MS, McInerney MJ. Microbial
processes in oil fields: Culprits, problems, and opportu鄄
nities. Advances in Applied Microbiology, 2009, 66:
141-151
[8]摇 Gieg LM, Jack TR, Foght JM. Biological souring and
mitigation in oil reservoirs. Applied Microbiology and
Biotechnology, 2011, 92: 263-282
[9]摇 Vance I, Thrasher DR. Reservoir souring: Mechanisms
and prevention / / Ollivier B, Magot M, eds. Petroleum
Microbiology. Washington DC: ASM Press, 2005:
123-142
[10]摇 Hubert C, Nemati M, Jenneman G, et al. Containment
of biogenic sulfide production in continuous up鄄flow
packed鄄bed bioreactors with nitrate or nitrite. Biotech鄄
nology Progress, 2003, 19: 338-345
[11]摇 Sunde E, Torsvik T. Microbial control of hydrogen sul鄄
fide production in oil reservoirs / / Ollivier B, Magot M,
eds. Petroleum Microbiology. Washington DC: ASM
Press, 2005: 201-213
[12]摇 Hubert C, Voordouw G. Oil field souring control by ni鄄
trate鄄reducing Sulfurospirillum spp. that outcompete sul鄄
fate鄄reducing bacteria for organic electron donors. Ap鄄
plied and Environmental Microbiology, 2007, 73:
2644-2652
[13]摇 Grigoryan AA, Cornish SL, Buziak B, et al. Competi鄄
tive oxidation of volatile fatty acids by sulfate鄄 and ni鄄
trate鄄reducing bacteria from an oil field in Argentina.
Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74:
4324-4335
[14]摇 Eckford RE, Fedorak PM. Chemical and microbiological
changes in laboratory incubations of nitrate amendment
“sour冶 produced waters from three western Canadian oil
fields. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnolo鄄
gy, 2002, 29: 243-254
[15]摇 Haveman SA, Greene EA, Stilwell CP, et al. Physio鄄
logical and gene expression analysis of inhibition of Des鄄
ulfovibrio vulgaris Hildenborough by nitrite. Journal of
Bacteriology, 2004, 186: 7944-7950
[16]摇 Kaster KM, Grigoriyan A, Jenneman G, et al. Effect of
nitrate and nitrite on sulfide production by two thermophi鄄
lic, sulfate鄄reducing enrichments from an oil field in the
North Sea. Applied Microbiology and Biotechnology,
2007, 75: 195-203
[17]摇 Stetter KO, Huber R, Blochl E, et al. Hyperthermo鄄
philic archaea are thriving in deep North Sea and Alas鄄
kan oil reservoirs. Nature, 1993, 365: 743-745
[18]摇 Nazina TN, Shestakova NM, Pavlova NK, et al. Func鄄
tional and phylogenetic microbial diversity in formation
waters of a low鄄temperature carbonate petroleum reser鄄
voir. International Biodeterioration & Biodegradation,
2013, 81: 71-81
[19]摇 Lu F (卢摇 芳), Gao Z鄄H (高振会), Jia Y鄄G (贾永
刚), et al. Present environmental status and assessment
of Jinzhou 9鄄3 Oil Field. Acta Oceanologica Sinica (海
洋学报), 2010, 32(1): 161-169 (in Chinese)
[20]摇 Zhuang W (庄摇 文), Duan J鄄Z (段继周), Shao H鄄B
(邵宏波), et al. Isolation of a nitrate鄄reducing bacteria
strain from oil field brine and the inhibition of it with
sulfate鄄reducing bacteria. Science Technology and Engi鄄
neering, 2010, 10: 4125-4130 (in Chinese)
[21]摇 American Petroleum Institute. API Recommended Prac鄄
tice for the Biological Analysis of Subsurface Injection
57328 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 刘洪玉等: NO3 - / NO2 -对渤海湾油藏中硫酸盐还原菌 SO4 2-还原活性的抑制效应摇 摇 摇 摇
Waters. API RP 38. 2nd Ed. New York: American Pe鄄
troleum Institute, 1965
[22] 摇 Tanner RS. Monitoring sulfate鄄reducing bacteria: Com鄄
parison of enumeration media. Journal of Microbiological
Methods, 1989, 10: 83-90
[23]摇 Cord鄄Ruwisch RA. A quick method for determination of
dissolved and precipitated sulfides in cultures of sulfate
reducing bacteria. Journal of Microbiological Methods,
1985, 4: 33-36
[24]摇 Bastin ES, Greer FE, Merritt CA, et al. The presence
of sulphate reducing bacteria in oil field waters. Science,
1926, 63: 21-24
[25]摇 Rapp佴 MS, Giovannoni SJ. The uncultured microbial
majority. Annual Reviews of Microbiology, 2003, 57:
369-394
[26]摇 Rosnes JT, Torsvik T, Lien T. Spore鄄forming thermophi鄄
lic sulfate鄄reducing bacteria isolated from North Sea oil
field waters. Applied and Environmental Microbiology,
1991, 57: 2302-2307
[27]摇 Leu JY, McGovern鄄Traa CP, Porter AJ, et al. The
same species of sulphate鄄reducing Desulfomicrobium
occur in different oil field environments in the North
Sea. Letters in Applied Microbiology, 1999, 29: 246 -
252
[28]摇 B覬dtker G, Thorstenson T, Lilleb覬 BL, et al. The effect
of long鄄term nitrate treatment on SRB activity, corrosion
rate and bacterial community composition in offshore wa鄄
ter injection systems. Journal of Industrial Microbiology
& Biotechnology, 2008, 35: 1625-1636
[29]摇 Jenneman GE, Mcinerney MJ, Knapp RM. Effect of ni鄄
trate on biogenic sulfide production. Applied and Envi鄄
ronmental Microbiology, 1986, 51: 1205-1211
[30]摇 Widdel F, Pfennig N. Studies on dissimilatory sulfate鄄
reducing bacteria that decompose fatty acids. II. Incom鄄
plete oxidation of propionate by Desulfobulbus propionicus
gen. nov. , sp. nov. Archives of Microbiology, 1982,
131: 360-365
[31]摇 Szewzyk R, Pfennig N. Complete oxidation of catechol
by the strictly anaerobic sulfate鄄reducing Desulfobacteri鄄
um catecholicum sp. nov. Archives of Microbiology,
1987, 147: 163-168
[32]摇 Moura I, Bursakov S, Costa C, et al. Nitrate and nitrite
utilization in sulphate鄄reducing bacteria. Anaerobe,
1997, 3: 279-290
[33]摇 Seitz HJ, Cypionka H. Chemolithotrophic growth of Des鄄
ulfovibrio desulfuricans with hydrogen coupled to ammo鄄
nification of nitrate or nitrite. Archives of Microbiology,
1986, 146: 63-67
[34]摇 Keith SM, Herbert RA. Dissimilatory nitrate reduction by
a stain of Desulfovibrio desulfuricans. FEMS Microbiology
Letters, 1983, 18: 55-59
[35]摇 McCready RGL, Gould WD, Cook FD. Respiratory ni鄄
trate reduction by Desulfovibrio sp. Archives of Microbio鄄
logy, 1983, 135: 182-185
[36]摇 Mitchell GJ, Jones JG, Cole JA. Distribution and regu鄄
lation of nitrate and nitrite reduction by Desulfovibrio and
Desulfotomaculum species. Archives of Microbiology,
1986, 144: 35-40
[37]摇 Dalsgaard T, Bak F. Nitrate reduction in a sulfate鄄re鄄
ducing bacterium, Desulfovibrio desulfuricans, isolated
from rice paddy soil: Sulfide inhibition, kinetics, and
regulation. Applied and Environmental Microbiology,
1994, 60: 291-297
[38]摇 S覬rensen J. Capacity for denitrification and reduction of
nitrate to ammonia in a coastal marine sediment. Applied
and Environmental Microbiology, 1978, 35: 301-305
[39]摇 King D, Nedwell DB. The influence of nitrate concen鄄
tration upon the end鄄products of nitrate dissimilation by
bacteria in anaerobic salt marsh sediment. FEMS Micro鄄
biology Letters, 1985, 31: 23-28
[40]摇 Greene EA, Hubert C, Nemati M, et al. Nitrite reduc鄄
tase activity of sulphate鄄reducing bacteria prevents their
inhibition by nitrate鄄reducing, sulphide鄄oxidizing bacte鄄
ria. Environmental Microbiology, 2003, 5: 607-617
[41]摇 Ai M鄄Q (艾明强), Li H (李 摇 慧), Liu X鄄B (刘晓
波), et al. Bacterial community structure in production
water from oil reservoirs in Daqing Oilfield. Chinese
Journal of Applied Ecology (应用生态学报), 2010, 21
(4): 1014-1020 (in Chinese)
作者简介摇 刘洪玉,女,1989 年生,硕士研究生. 主要从事油
藏环境微生物学研究. E鄄mail: haohongyu. 523@ 163. com
责任编辑摇 肖摇 红
6732 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷