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用;有文献报道，京尼平 1 － β － D 龙胆二糖苷能改善戊巴比
妥钠引起的心力衰竭;绿原酸为栀子中主要有机酸酯类成分，
具有显著的抗癌作用及保肝利胆作用;西红花苷 －Ⅰ、西红花
苷 －Ⅱ是西红花、栀子中共有的色素类成分，具有去黄疸、利
胆及明显的降血脂作用［7］。本研究通过一测多评的分析方
法对栀子药材中 6 种成分进行测定，为栀子药材中活性成分
的多成分、多指标质量控制提供了新模式。
环烯醚萜类化合物是已知栀子药材中的有效成分，
238 nm 为京尼平苷酸、栀子苷、京尼平 1 － β － D 龙胆二糖苷
的最大吸收波长，330 nm 为酚酸类物质绿原酸常用检测波
长，440 nm 为西红花苷类化合物西红花苷 － Ⅰ和西红花
苷 －Ⅱ最佳检测波长，因此选用 238、330、440 nm为检测上述
6 种成分的波长。
通过比较一测多评法和传统回归方程法所得栀子 6 种成
分含量值，发现两者之间并没有显著差异，且不同实验室、仪
器、色谱柱下各有效成分间的校正因子重现性良好，说明在对
照品不足的情况下，将一测多评用于栀子中药材多指标质量
评价与质量控制是可行的，该方法具有一定的发展前景。
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凌 敏，杨秀莲，王良桂． 四唑染色法测定巨紫荆种子生活力［J］． 江苏农业科学，2015，43(1):295 － 297．
doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2015． 01． 098
四唑染色法测定巨紫荆种子生活力
凌 敏，杨秀莲，王良桂
(南京林业大学风景园林学院，江苏南京 210037)
摘要:为探讨巨紫荆(Cercis gigantea)种子生活力的适宜测定方法，采用四唑染色法，以染色浓度、染色温度、染色
时间设计正交试验，研究巨紫荆种子的生活力测定条件。结果表明，染色浓度、染色温度、染色时间 3 者之间存在一定
的关系，TTC浓度为 0． 1%、温度为 35 ℃、染色时间为 8 h是巨紫荆种子生活力测定的最佳条件。
关键词:巨紫荆种子;四唑染色;生活力
中图分类号:S339． 3 + 1 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2015)01 － 0295 － 03
收稿日期:2014 － 03 － 05
基金项目:江苏省林业三新工程项目(编号:lysx［2013］24)。
作者简介:凌 敏(1990—)，女，安徽滁州人，硕士研究生，研究方向
为园林植物与应用。E － mail:974574883@ qq． com。
通信作者:王良桂，教授，博士生导师。E － mail:wlg@ njfu． com． cn。
巨紫荆(Cercis gigantea)原产中国浙江、河南、湖北、广
东、贵州等地，是现存极少的乡土树种。巨紫荆是高大落叶乔
木，高可达 15 m，胸径可达 40 cm。树干通直，生长整齐，枝展
开张，树冠绿荫面积大，覆盖度高，园艺性状突出，适宜作行道
树、庭荫树，艺术效果良好。巨紫荆春季满树开淡红或淡紫红
花，先花后叶，灿若云锦，观赏效果极佳;夏季叶绿荚红，茵质
浓厚;秋季彩叶如霞;冬季落叶后荚果仍然悬挂枝头，尽展生
命之劲力。巨紫荆实乃春季观花、夏秋观叶、冬季观果的优良
园林树种，是园林绿化中具有广阔应用前景的乡土树种［1］。
在小苗培育方面，巨紫荆的出苗率一直不高，播种前用浓硫酸
酸蚀再用赤霉素浸泡，其发芽率最高仅有 25． 5%［2］。准确的
生活力测定方法能够真实反映种子的发芽能力，尤其对一些
休眠期长的种子更为适用。四唑(2，3，5 － triphenyl tetrazoli-
um chloride，TTC)测定技术是通过鉴定种子内部活组织的染
色情况测定种子活力，是国际上公认的测定种子生活力较好
的方法，能够快速、有效、准确地反映出种子的生活力，是《国
际种子检验规程》中用于测定发芽缓慢或有休眠种子的生活
力、快速判断种子潜在发芽能力的一种有效方法［3 － 5］。
本研究利用四唑染色法，设置不同的 TTC 浓度、染色温
度和时间，研究巨紫荆种子生活力测定的适宜条件，探究巨紫
荆种子生活力的快速测定方法，为客观评价巨紫荆的发芽能
力，科学预测种子用量以及出苗率等提供理论参考。
1 材料与方法
1． 1 材料
巨紫荆种子于 2013 年 11 月 12 日采自南京林业大学梁
希广场前，种子的净度为 96． 12%，千粒质量为 21． 50g，含水
量为 17． 15%。
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1． 2 TTC染色法
1． 2． 1 正交试验 采用正交试验设计方法，确定巨紫荆种子
生活力测定的适宜条件。选择 TTC 浓度、染色温度(烘箱温
度)和时间等直接关系种子活力测定结果的 3 个因素，并设
置 3 个不同的水平，进行正交试验(表 1)。
表 1 TTC染色法测定因素与测定水平
水平
因素
A:TTC浓度
(%)
B:染色温度
(℃)
C:染色时间
(h)
1 0． 10 25 8
2 0． 15 30 12
3 0． 20 35 16
1． 2． 2 TTC 溶液配制 用超纯水分别将 TTC 配成 0． 1%、
0. 15%、0． 2%浓度的溶液，pH 值范围为 6． 8 ～ 7． 2，保存于棕
色瓶中。
1． 2． 3 浸泡处理 随机抽取 27 份巨紫荆种子，每份 50 粒，
去子叶末端，放置于 27 个烧杯中，加入 25 mL 自来水中淹没
种子，置于 25 ℃恒温培养箱中 24 h，待其吸水膨大后取出，用
刀片及解剖针剥去种子的 3 层种皮，取出胚，供染色用。整个
操作过程中，所有的种子都置于湿润的脱脂棉上，以保证种子
的湿润。
1． 2． 4 染色 将准备好的每份 50 粒种胚分别放入 27 个小
烧杯中，共 9 个处理，每个处理重复 3 次，加入对应的 TTC 溶
液，分别放入 25、30、35 ℃的烘箱中避光染色。达到染色时间
后，取出种胚，用清水冲洗，将种胚摆在滤纸上，根据种子染色
的部位、染色面积的大小和染色程度，逐粒判断种子的生
活力［6］。
1． 3 TTC浓度试验
在 35 ℃ 条件下，进行了不同浓度的 TTC 液(0. 3%、
0. 4%、0. 5%)对种子染色数目、染色时间及染色程度的比较
试验。
1． 4 种子发芽与生活力测定
根据不同的处理方法将随机抽取的巨紫荆种子分为 2 大
组 10 小组。(1)98%浓硫酸处理组:处理时间分别为 10 min
(处理 1)、15 min(处理 2)、20 min(处理 3)、25 min(处理 4)、
30 min(处理 5)，处理对应时间后，再分别置于流水下冲洗
48 h。(2)热水浸泡 48 h 组:浸泡温度分别为 50 ℃(处理
6)、60 ℃(处理 7)、70 ℃(处理 8)、80 ℃(处理 9)、90 ℃(处
理 10)。每组 3 个重复，每个重复 100 粒，处理完毕后进行发
芽试验，将种子置于湿润的砂子中，25 ℃培养温度，每天光照
12 h，光照强度 为 1600 lx，期间保持发芽盒内砂子湿润［7］。
2 结果与分析
2． 1 TTC浓度、染色温度和染色时间对种子生活力的影响
采用四唑染色法测定巨紫荆种子生活力的正交试验
L9(3
3)试验结果见表 2。巨紫荆种子生活力最高(99． 33%)
的处理组合为 0． 15% TTC浓度、35 ℃染色温度、8 h染色时间
(处理组合 6)，以及 0． 20% TTC 浓度、35 ℃染色温度、12 h
染色时间(处理组合 9);生活力最低(0． 67%)的处理组合为
0． 10% TTC浓度、25 ℃染色温度、8 h 染色时间(处理组合
1)，低于最高生活力 98． 66%。
将所得数据进行方差分析，结果见表 3。染色温度以及
染色时间的 F值(53． 72、20． 78)均远大于 F0． 01(3． 92)，表现
差异极显著;TTC浓度的 F值(1． 63)小于 F0． 01，差异不显著。
3 个因素对巨紫荆种子生活力的影响大小排序为温度 ＞时
间 ＞ TTC 浓度。
各因素不同水平的种子生活力平均值比较结果见表 4。
随着 TTC浓度升高，种子的活力呈现先上升后下降的趋势，
但是其变化幅度不大，从节省原料的角度出发，可以考虑选择
低浓度的 TTC;染色温度越高，巨紫荆种子的活力越高，当温
度为 35 ℃时，巨紫荆种子的活力达到 98． 66%，而且随着温
度升高，差异显著，35 ℃条件下巨紫荆种子的活力比 30 ℃条
件下提高了 38． 88%;随着染色时间延长，种子活力也上升，
表现差异显著，但相对于温度来说，其影响程度还是很小。综
上所述，结合节约资源、减少污染的实际情况，TTC 法测定巨
紫荆种子生活力的最佳条件为 0． 10% TTC 浓度溶液，在
35 ℃ 烘箱中染色 8 h。
表 2 TTC染色法正交试验结果
处理组合
因素
A B C
种子活力
(%)
1 1 1 1 0． 67
2 1 2 2 61． 33
3 1 3 3 97． 33
4 2 1 2 2． 00
5 2 2 3 97． 33
6 2 3 1 99． 33
7 3 1 3 64． 67
8 3 2 1 20． 67
9 3 3 2 99． 33
表 3 TTC浓度、温度、浸种时间处理的巨紫荆种子
生活力测定方差分析
来源 df SS MS F值 F0． 01
因素 A 2 198． 74 99． 37 1． 63 3． 92
因素 B 2 6536． 97 3268． 48 53． 72
因素 C 2 2528． 07 1264． 04 20． 78
误差 27 1642． 54 60． 84
2． 2 TTC浓度与染色时间的关系
不同浓度 TTC 液(0． 3%、0． 4%、0． 5%)对种子染色数
目、染色时间及染色程度的比较试验结果见表 5。
表 4 不同水平的巨紫荆种子生活力平均值比较
水平
种子生活力平均值(%)
TTC浓度 染色温度 染色时间
1 53． 11c 22． 45c 40． 22c
2 66． 22a 59． 78b 54． 22b
3 61． 56b 98． 66a 86． 44a
注:同列中不同小写字母表示在 P ＜ 0． 05 水平上表现差异显著。
表 5 不同浓度 TTC液的染色情况
TTC浓度
(%)
试验种子数
(粒)
染色种子数
(粒)
着色稳定时间
(h)
0． 3 50 49 6
0． 4 50 50 4
0． 5 50 49 4
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结合 TTC浓度试验结果，可以看出只要染色温度适宜，
TTC浓度对巨紫荆种子活力的影响不大，不论浓度高或低，均
能染色;TTC浓度高时，可以缩短染色时间。出于节约试剂、
减小污染的目的，在试验时尽可能选择较低浓度染色。根据
上述结果，TTC 法测定巨紫荆种子生活力的最佳条件与正交
试验结果一致。
2． 3 种子发芽率与种子生活力的关系
试验进行 30 d 后种子均未见萌发，继续观察 1 个月后，
仅有个别种子开始出现霉烂现象，但是仍然没有萌发迹象。
此时每个处理随机抽取 50 粒种子，用四唑染色法测定其种
子的生活力。由表 6 可知，绝大多数成熟的巨紫荆种子具有
良好的生命活力;在进行发芽试验时，适当的处理方法对种子
之间生活力影响不大。
表 6 巨紫荆种子生活力测定结果
处理
有生活力种
子数(粒)
无生活力种
子数(粒)
发芽种子数
(粒)
发霉种子数
(粒)
1 48 2 0 0
2 49 1 0 0
3 45 5 0 0
4 46 2 0 2
5 43 1 2 4
6 47 3 0 0
7 50 0 0 0
8 47 3 0 0
9 45 4 0 1
10 42 4 0 4
3 结论与讨论
种子生活力反映了种子的发芽潜在能力和种胚所具有的
生命力，是判断种子质量的重要指标［8］。四唑染色法是国际
公认较好的测定种子活力的方法，已广泛应用于农作物和蔬
菜种子的活力测定。由于 TTC浓度、染色温度以及染色时间
等的不同都会影响种子的活力判断，因此针对不同植物种子
需要确定不同的活力测定条件。对巨紫荆种子生活力进行测
定前，对测定巨紫荆种子生活力的 TTC 浓度以及染色温度作
了简单的对比，结果表明当 TTC 浓度低于 0． 10%、染色温度
高于 50 ℃时，巨紫荆种子不染色或者染色情况较差，故试验
时将 TTC浓度设置高于 0． 10%，染色温度低于 50 ℃。
TTC浓度、染色温度、染色时间均为影响巨紫荆种子生活
力的重要因素，其中染色温度及时间对生活力的影响极显著，
在生活力测定中存在一定的线性关系，可以通过改变 TTC 浓
度、染色温度、染色时间其中的两者而达到改变第 3 条件的目
的［9］。染色温度为生活力测定的最主要限制因子，控制好染
色温度对巨紫荆种子生活力的测定具有重要意义。
从节约成本减少污染角度出发，可以通过降低 TTC 浓
度、提高染色温度达到良好的染色效果［10］。生产上可根据实
际情况，选择适宜的染色浓度(0． 1% ～ 0． 2%)，在 35 ℃下染
色 8 h或者在较高浓度(0． 3% ～ 0． 5%)下于 35 ℃染色 4 ～
6 h。根据本试验研究结果，种子生活力的最佳测定条件为
0． 1% TTC浓度溶液、35 ℃染色温度、8 h染色时间。
前人试验表明，TTC 染色法测定结果与标准发芽率一般
很接近，是最有希望代替发芽试验的方法［11 － 13］。但本研究结
果表明，巨紫荆种子生活力和其发芽试验结果相差很大，TTC
染色法还不能取代巨紫荆种子的发芽试验。这主要在于巨紫
荆种子萌发还没有建立起标准的发芽方法，在后续的试验中
将对巨紫荆种子萌发的相关生理特性进行深入研究，以提高
其生活力测定结果判定的准确性，从而为估测巨紫荆种子发
芽率提供一种准确、快速、简便和适用的新方法。
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