全 文 ：　2010 , 36(5):183-185 P lant Protection
有害生物动态
Information of Pests
收稿日期:　2009-07-23　　　修订日期:　2009-10-28基金项目:　南京市农业新品种引繁示范项目(200801055)＊通信作者 E-mail:hb s@njau.edu.cn
朗伍德王莲腐霉叶腐病及病原鉴定
窦　剑1 , 　田艳丽2 , 　陈玉林1 , 　汤诗杰1 , 　胡白石2＊
(1.江苏省中科院植物研究所 (南京中山植物园), 南京　210014;
2.南京农业大学植物保护学院植物病理学系 , 农业部作物病虫害监测与防控重点开放实验室 , 南京　210095)
摘要　2009年 ,南京中山植物园王莲育苗池中的朗伍德王莲(Victoria `Longwood Hybrid )发生了叶片腐烂病。按照
柯赫氏法则对其进行了病原物的分离 、纯化和致病性测定 ,并对菌株进行了形态学和分子生物学鉴定。从发病部位稳
定分离到形态一致的低等真菌;致病性测定结果表明, 回接后发病株产生与自然侵染相同的症状 ,并重新分离到相同
菌株。通过病原菌形态特征和核糖体 rDNA ITS 序列分析 ,病株分离物被鉴定为旋柄腐霉(Pythium helicoides)。这是
国内外首次报道在王莲上分离出旋柄腐霉并证明其为王莲的致病菌。该病害被定名为王莲腐霉叶腐病。
关键词　王莲;　叶腐病;　旋柄腐霉;　病原鉴定
中图分类号:　S 436.8　　文献标识码:　B　　DOI:　10.3969/ j.issn.0529-1542.2010.05.042
Pythium leaf rot of Victoria `Longwood Hybrid and
identification of the pathogen
Dou Jian1 , 　Tian Yanli2 , 　Chen Yulin1 , 　Tang Shijie1 , 　H u Baishi2
(1.Institute of Botany in Jiangsu Prov ince , Chinese Academy of Sciences , Nanjing　210014 , China;
2.Key Laboratory of Monitoring and Management of Crop Diseases and Pest Insects ,
Ministry of Agriculture , Depart ment of Plant Pathology , College of Plant Protection ,
Nanjing Agricultural University , Nanjing　210095 , China)
Abstract　A leaf rot disease of Victoria ` Longwood Hybr id in Nanjing of Jiangsu Province was found.The
pathogen was isolated and identified by the Koch s rule as Pythium helicoids , based on morphologic al obse rvation
and ITS sequence an alysis.After inoculat ion , the isola te could inf ect Victoria `Longwood Hybr id and cause the
dise ase.This is the f irst r epor t that P .helicoids could inf ect Victoria `Longwood Hybr id .
Key words　Victoria `Longwood Hybr id ;　le af rot;　Py thiu m helicoides ;　identification of the pa th ogen
　　王莲为睡莲科(Nymphaeaceae)王莲属(Vic-
toria)多年生或一年生大型水生植物 ,原产于南美
洲热带水域 。其原生种有亚马逊王莲(V.ama-
zonica)和克鲁兹王莲(V.cruziana)两种 , 19 世纪
早期先后发现于亚马逊流域和巴拉那流域 ,并以其
硕大奇特的叶片和芬芳高雅的花朵而备受瞩目 。
朗伍德王莲(Victoria `Longw ood Hybrid )为克鲁
兹王莲×亚马逊王莲的 F1 代 ,于 20世纪 60 年代
初于美国朗伍德植物园首次育成 ,尤以巨大叶片所
具有的鲜红亮丽 、垂直高耸的叶缘而具有较高的观
赏价值 ,现已作为特色性的水生花卉 ,引种栽植于
世界各地。
2009年初 ,南京中山植物园从美国引进朗伍
德王莲种子进行育苗。在育苗过程中发现 ,部分小
苗叶片出现水渍状病斑 ,病斑由叶片四周向中心发
展;部分老叶叶缘干枯 ,正反面明显可辨干枯斑
块 ,未干枯部位有明显水渍状病斑;部分老叶片表
面有白色粉末状物质。为了明确该病害的病原 ,防
止病害扩散 ,本研究对该病害进行了病原菌的分离
及其鉴定。
2010
1　材料与方法
1.1　病原菌的分离
从南京中山植物园王莲育苗池内采集发病的样
品 ,在 PDA 培养基上 ,用组织分离法对样品进行分
离[ 1] ,25 ℃培养箱内培养 1～ 2 d后观察病原菌的生长
情况。根据培养基上菌落形态 、菌丝颜色等差异 ,挑取
各异的菌株 ,纯化培养后保存以供接种测定致病性。
1.2　致病性测定
致病性测定采用菌丝块接种:分别将新鲜培养
的直径为 7 mm 各菌株菌丝块贴于被接种的朗伍德
王莲叶片表面 ,每个菌株重复 6次 ,以直径为 7 mm
的空白 PDA 培养基作为对照 。接种的王莲于室温
保湿并观察发病情况 。对能够产生与自然条件下发
病症状相似的接种菌株进行再分离 。
1.3　病原菌的鉴定
1.3.1　形态学鉴定
将经过致病性测定后能够产生与自然条件下发
病症状相似的菌株纯化于 PDA 培养基上 ,观察培养
性状 。
参考郑小波的方法[ 2] 诱导孢子囊 。将待测菌株
在利马豆培养基(LBA)上于 25 ℃培养 1 d。然后用
解剖刀切取菌落边缘部分 ,切成 0.2 cm 2 左右的菌
丝块置于 10%V 8 培养液中培养 1 d左右 ,待培养
液中出现若干堆菌丝丛 ,小心倾去培养液 ,加入 15
～ 20 mL 灭菌水 ,置于 25 ℃下诱导产孢。每隔 2 h
换一次水 ,直至孢子囊大量产生。
1.3.2　分子生物学鉴定
1.3.2.1　DNA 的提取
将分离培养的菌丝体参照 CTAB 法[ 3] 提取
总 DNA 。
1.3.2.2　PCR扩增
引物序列:通用 引 物 ITS1(5′-TCCGTAGG-
TGAACCTGCGG-3′)和 ITS4(5′-TCCTCCGCT-
T A T TGA TA TGC-3′)均由上海生工公司合成。
PCR反应体系:10 ×PCR Buffer (10 mmol/ L
Tris-HCl , pH 8.3;50 mmol/L KCl)5μL , 2.5 mmol/
L dNTP 4 μL ,5 μmol/L 的引物各 0.5μL , 2.5 U/μL
Taq DNA聚合酶 0.5μL , DNA模板1μL , 超纯水补足
至 50μL。
PCR扩增反应条件:94 ℃预变性 5 min;94 ℃
变性 30 s , 50 ℃退火 30 s ,72 ℃延伸 2 min ,30个循
环;循环结束后 72 ℃再延伸 5 min ,最后 4℃保存。
PCR扩增反应产物的测序工作送到上海生工生物
工程技术服务有限公司进行。将所测得的序列在
GenBank 中分析比较 。
2　结果与分析
2.1　病原分离和致病性测定
从南京中山植物园王莲育苗池发病的王莲样品
中 ,分离到 5 个菌株 ,经致病性测定 ,菌株 1 、4和 5
能够使健康的王莲叶片产生水渍状病斑 ,与自然发
病症状相同(图 1)。
图 1　分离物接种王莲的发病症状
2.2　病原菌鉴定
分离菌株在 PDA 培养基上菌落呈放射状 ,
气生菌丝棉絮状 , 菌丝发达 ,分枝繁茂 。菌丝体
无隔多核 , 菌丝宽 1.5 ～ 9.2 μm , 孢子囊较少 ,
近球形 , 多倒卵形 , 大小为(23 ～ 36 )μm ×(21
～ 27 )μm ,顶生偶有间生 , 具一乳突(图 2)。游
动孢子双鞭毛 , 肾形 。经诱导 ,未发现该菌的卵
孢子 。
·184·
36 卷第 5 期 窦剑等:朗伍德王莲腐霉叶腐病及病原鉴定
对发病王莲样品中分离出的病原菌 rDNA内转
录间 隔区 (ITS 区)测序 (GenBank 登录 号:
GQ918332),在 GenBank 中分析比较发现 ,供试的 3
个菌株(菌株 1 、4 和 5)与旋柄腐霉(Py thium heli-
coides)(AB259314.1)的相似性均为 100%。该菌
的无性世代特征与旋柄腐霉相符 ,结合 ITS 序列比
较结果 , 病原被鉴定为旋柄腐霉(Pythium heli-
coides)。
图 2　旋柄腐霉(Pythium helicoides)形态特征
3　结论与讨论
腐霉(Py thium)属于藻物界(Chromista)卵菌
纲(Oomyce tes)[ 4] ,遍布全世界[ 5] 。它既可腐生 、寄
生或兼性寄生 ,又可水生 、陆生或水陆两栖生 。许多
腐霉在各种土壤和水生环境中营腐生生活 ,有些是
重要的植物病原菌 ,引起种腐 、根腐 、果腐 、苗期猝倒
和蔬菜贮藏期的腐烂 ,给农业生产造成严重损失;有
些腐霉不仅对植物没有致病作用 ,还能诱导植物产
生系统抗性 , 如寡雄腐霉(Py thium ol igandrum
Drechsle r)等对其他土壤病原真菌(包括腐霉)具有
拮抗与生防作用[ 6] 。近几十年来 ,国内外关于腐霉
引起农作物病害的报道有很多 ,例如 Rosskop E N
等人研究发现旋柄腐霉能引起一种蓼属植物
Polygonum odoratum 的根腐病[ 7] ;Bernard Paul报
道在法国北部的里尔种植小麦区域发现腐霉的新种
Pythium bi f urcatum 并且发现它对 Botry tis cine-
rea 有拮抗作用[ 8] 。在我国 ,已有多种腐霉菌危害植
物的报道[ 9-11] 。旋柄腐霉在我国有记录 ,分离于云
南景洪的土壤中 ,文献记载其能够侵染大丽花 、西
瓜 、菜豆 、豌豆 、大豆 、菠菜 、胡椒 、苜蓿 、松 、冬青及木
槿等多种经济植物[ 4] ,目前国内外没有该菌侵染王
莲的报道 。
本研究首次报道了从王莲发病叶片分离出旋柄
腐霉并证明其为王莲的致病菌 。在病原鉴定时 ,对
分离菌株进行了形态鉴定 ,同时利用病原菌核糖体
DNA 内转录间隔区(ITS)序列的特性 ,对其进行扩
增和测序 ,在 GenBank中进行比对 ,最终参考 Mon-
ograph of the Genus Py thium[ 12] 中对腐霉形态的描
述 ,结合 GenBank 序列比对结果 ,确定分离菌株属
于旋柄腐霉 。本研究结果对今后进一步研究 、防止
该病害蔓延和病害的防治提供了依据。
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