全 文 ：农业生物技术学报，2011年，第 19卷，第 3期，第 455~461页
Journal of Agricultural Biotechnology, 2011, Vol.19, No.3, 455~461
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2011.03.008
基金项目：本研究由国家质检总局科技计划项目(No. 2011IK249)、浙江省科技厅面上项目(No. 2009C32076)和浙江出入境检验
检疫局科研项目(No.ZK200958)共同资助
收稿日期：2010-05-14 接受日期：2010-08-16
研究报告
A Letter
农杆菌介导的 CFL(Cucumber-FLO-LFY)基因遗传转化大岩桐
张明哲 1, 3* 王利琳 2 叶丹 3 吴志毅 1 陈曦 1 张晓峰 1 边红武 3 韩凝 3 朱睦元 3
1浙江出入境检验检疫局，杭州 310016；2杭州师范大学，杭州 310036；3浙江大学生命科学学院，杭州 310058
*通讯作者，zhangmz@ziq.gov.cn
摘 要 建立和优化了农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的大岩桐(Sinningia speciosa)遗传转化方法，
同时将 CFL (Cucumber-FLO-LFY)基因转入大岩桐中，期望获得提早开花的转基因植株。采用双酶切法将
CFL 基因连接到质粒载体 pCAMBIA13011 上，得到具有 CaMV35S 组成型启动子的植物表达载体
pCA-CFL。以大岩桐无菌苗叶片为材料，进行潮霉素(hygromycin, Hyg)浓度梯度培养，确认 20mg/L hyg为筛
选压。采用超声波处理、农杆菌液浸泡等多种方法进行大岩桐转基因，GUS检测结果表明，超声波处理 10 s
的方法转化效率最高。转化后的叶片进行诱导培养并经过 2轮 Hyg筛选后，获得一批 Hyg抗性再生植株。进
一步用 PCR、斑点杂交检测发现，CFL基因已整合到大岩桐基因组中。将转基因大岩桐移栽到盆中并在长日
照的环境下生长直至开花。经分析表明，超过 71%的转基因大岩桐比野生型提早 26~32 d开花，且大部分的
转基因植株不形成侧枝而是直接在顶端成花。研究结果提示，CFL基因和 LEAFY(LFY)基因在功能上是同
源的。
关键词 CFL(Cucumber-FLO-LFY)基因，转基因大岩桐，农杆菌介导
Transformation of CFL (Cucumber-FLO-LFY) Gene in Gloxinia (Sinningia
speciosa) Mediated by Agrobacterium tumefaciens
Zhang Mingzhe1, 3* Wang Lilin2 Ye Dan3 Wu Zhiyi1 Chen Xi1 Zhang Xiaofeng1 Bian Hongwu3 Han Ning3
Zhu Muyuan3
1 Zhejiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Hangzhou 310016, China; 2 Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China; 3
College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China
* Corresponding author, zhangmz@ziq.gov.cn
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2011.03.008
Abstract Different Agrobacterium-mediated protocols were used to evaluate the transformation efficiency of
gloxinia (Sinningia speciosa), and CFL (Cucumber-FLO-LFY) gene was introduced into gloxinia to investigate its
potential to promote early flowering. The plant expression vector pCA-CFL was constructed by inserting CFL gene
into the plant high-efficient expression vector pCAMBIA13011. To restrain the growth of untransformed cells, we
confirm the hygromycin (Hyg) filtration pressure (20mg/L) through explants culture treated with different Hyg
concentrations. CFL gene was transformed into leaves of gloxinia mediated by Agrobacterium tumefaciens and
GUS (β-glucuronidase) test showed that the protocol of ultrasonic 10 s treatment was the most efficient. After two
selection cultures, dozens of Hyg-resistant regenerated green shoots were obtained. PCR and Southern dot blot
analysis revealed that CFL gene had been integrated into the gloxinia genome. Transgenic seedlings were grown
under long-day condition until maturity.The analysis showed that most of transgenic gloxinia plants (71% )
flowered 26~32 days earlier than wild-type plants, and had terminal flowers emerging directly from shoot apex
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
20世纪 90年代初，随着植物分子生物学的逐步
发展和模式植物的建立，在花发育调控基因方面的
研究已取得一定进展。Weigel等(1992)从野生型拟南
芥中克隆了一个与调控花分生组织启动相关的基因
LEAFY(LFY)基因，该基因的突变体表型为花序分生
组织转变为花分生组织受阻。LFY基因属于花分生
组织属性基因 (Benlloch et al., 2007; Blazquez et al.,
2006; Irish, 2010; Liu et al., 2009; Moyroud et al.,
2010; Moyroud et al., 2009; Wagner, 2009)，转正义
LFY基因研究表明，该基因具有促进植物提早开花
的作用，如将该基因导入杨树，使原本需要 8年才能
开花的杨树品种提前到 7个月就能开花(Coupland,
1995; Hoenicka et al., 2006)。近几年，有人利用 LFY
基因成功转化菊花、猕猴桃、兰花、葡萄等，有的还获
得了提早开花的转基因植株 (邵寒霜等, 1999;郭卫
东等 , 1999; 邵寒霜等 , 2000; 陈力耕等 , 2001;
Flachowsky et al., 2010; Rao et al., 2008)。 CFL
(Cucumber-FLO-LFY)基因是从黄瓜中克隆到的 LFY
同源基因(刘复权等, 1999)，研究表明，CFL基因的表
达对黄瓜子叶节花芽和营养芽分化中原基的分化、
形成是必需的，同时可能还参与细胞分裂调控和启
动、营养性分生组织向花分生组织转变等过程(王利
琳等, 2004)。
大岩桐(Sinningia speciosa)原产巴西，为苦苣苔
科多年生球根花卉，是一种极好的春夏季节室内盆
花，世界各地广泛栽培。选择大岩桐作为转化材料的
原因有三：一是大岩桐外植体极易分化，在附加 2.0
mg/L 6-BA 和 0.2 mg/L NAA 的诱导培养基上可不
经愈伤组织而在外植体边缘直接分化苗，生长也比
较快速。二是我们在实验中发现大岩桐组培苗经栽
培后存在花同源异型现象，同源异型花多达 6种以
上，发生频率达 38.1%，这将是一个研究花器官变异
的极好材料(庞基良等, 2003)。三是大岩桐是一种大
众喜爱的盆花，将 CFL基因异源转化重瓣紫蓝大岩
桐，期望获得提早开花的转基因植株，为今后将该基
因导入其它经济作物或名贵花卉，提早它们的开花
时间提供直接的实验依据。另外，大岩桐的转基因技
术起步较晚，相关报道较少，本研究尝试通过农杆菌
介导法得到大岩桐转基因植株，期望建立一套高效
的农杆菌介导的花卉转基因方法。
1 结果与分析
1.1 植物表达载体的构建
用双酶切法(SalⅠ和 SacⅠ)从质粒 pBS-CFL中
获得 CFL基因片段，回收得到小片段；同时对 SalⅠ
和 SacⅠ双酶切后的 pCAMBIA13011 载体进行回
收，得到大片段。将大小两片段混合，通过 T4 DNA连
接酶连接，得到植物双元表达载体 pCA-CFL(图 8)。
在新构建的 pCA-CFL植物表达载体中 CFL基因位
于 CaMV35S强启动子下游，含有启始与终止密码
子。PCR扩增及酶切确证所构建的 pCA-CFL表达载
体中存在 CFL基因片段(图 1)。
1.2 农杆菌介导的大岩桐转化
1.2.1筛选压的确定
将野生型大岩桐叶片分别置于 0、3、5、7、10、15、
20、30和 40 mg/L不同浓度潮霉素(hygromycin, Hyg)
的培养基中培养 30 d(图 2)，结果表明 20 mg/L Hyg
开始影响大岩桐叶片生长(图 2 B)，30 d后具有分化
能力的叶片数与 0 mg/L Hyg对照组(图 2 A)有较显
著差异，大部分叶片边缘明显变黄甚至褐化，叶片的
分化能力受到抑制。而在 30和 40 mg/L Hyg的筛选
培养条件下(图 2 C、D)，叶片分化受到严重抑制。所
以本实验以 20 mg/L的 Hyg作为外植体的筛选压。
1.2.2大岩桐遗传转化方法的优化
GUS染色统计结果显示，几种转化方法中，超声
图 1 PCR(A)和双酶切(B)鉴定 pCA-CFL表达载体
1：以质粒为模板进行 PCR扩增；2：以菌液为模板进行 PCR
扩增；3：阴性对照；4~6：pCA-CFL质粒用 SalⅠ和 SacⅠ进行
双酶切鉴定；M：DNA marker
Figure 1 Identification of pCA-CFL by PCR amplification (A)
and restriction enzyme analysis(B)
1: PCR amplification from plasmid; 2: PCR amplification from
bacterium; 3: Negative control; 4~6: Restriction enzyme analysis
of pCA-CFLwith SalⅠ and SacⅠ; M: DNAmarker
1 2 3 M M 4 5 6
3000
2000
1500
1200
500
100
bp
A B
with no inflorescence branches. Our results imply that CFL act as a functional homolog of LEAFY (LFY) in
gloxinia.
Keywords CFL(Cucumber-FLO-LFY) gene, Transgenic gloxinia, Agrobacterium-mediated
456
波处理 10 s转化效率达 30%以上为最高(图 3)。延长
超声波处理时间(30 s或者 2 min)易引起叶片褐化并
死亡，导致转化效率降低。而未用超声波处理或仅处
理 10 s的转基因大岩桐褐化不严重，说明超声波对
植物组织有一定损伤作用，转化材料时应严格控制
处理时间。B1、B2实验表明，大岩桐转染前，用含
100 μmol/L乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)培养基预
培养 1 d并未有效地提高转化效率(图 3)。而叶片与
农杆菌暗处浸泡 30 min的转化(B1)效果比向叶片上
直接滴加农杆菌菌液(B2)效果要好。所以，最后我们
采用了超声波处理 10 s的转化方法来转化大岩桐。
1.3 转化植株的再生及鉴定
1.3.1转化植株的再生
经感染的大岩桐叶片，置于诱导分化培养基中，
在温度为(24±1)℃，光照 16 h/8 h，湿度≥85％的培养
条件下，3周后开始有芽的形成，经两轮潮霉素(Hyg)
抗性筛选后，从褐化的叶片边缘直接分化出小苗(图
4 A)，待小苗长至 2~3 cm后，将其切下并转入培养
农杆菌介导的 CFL(Cucumber-FLO-LFY)基因遗传转化大岩桐
Transformation of CFL(Cucumber-FLO-LFY) Gene in Gloxinia(Sinningia speciosa) Mediated by Agrobacterium tumefaciens
图 3通过 GUS染色法比较转化效率
A：预培养 2 d；A1、A2 和 A3：加入 70 mL 农杆菌菌液
(OD600=0.3) 分别超声 10 s、30 s和 2 min；A4：农杆菌浸染 30
min；A5：超声 10 s +农杆菌浸染 20 min；B：100 μmol/L AS预
培养 1 d；B1：农杆菌浸染 30 min；B2：直接滴加 5 μL OD600约
为 1.0的农杆菌菌液
Figure 3 Comparison of transformation efficiency with GUS
staining
A: Pre-culture for 2 d; A1, A2 and A3: Ultrasonic 10 s, 30 s and
2 min with 70 mL Agrobacterium(OD600=0.3); A4: Agrobacterium
co-culture 30 min; A5: Ultrasonic 10 s+ Agrobacterium co-culture
20 min; B: 100 μmol/L AS pre-culture for 1 d; B1:
Agrobacterium co-culture 30 min; B2: Drip 5 μL Agrobacterium
(OD600=1.0)
图 2不同浓度 Hyg筛选压下培养的大岩桐叶片
Figure 2 Explants culture treated with different Hyg concentrations
A: 0 mg/LHyg; B: 20 mg/LHyg; C: 30 mg/LHyg; D: 40 mg/LHyg
A B C D
图 4 Hyg抗性再生植株
A：外植体在 20 mg/L筛选培养基上生长 3周；B：Hyg抗性再生小苗；C：Hyg抗性再生植株
Figure 4 Hyg-resistant plants
A: Explants culture treated with 20 mg/L Hyg for 3 weeks; B: Hyg-resistant seedlings; C: Hyg-resistant plants
A B C
Tr
an
sf
or
m
at
io
n
ef
fic
ie
nc
y/
%
35
30
25
20
15
10
5
0 A1 A2 A3 A4 A5 B1 B2
40
457
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
1 2 3 4 5 6 M7
10000
3000
6000
1000
bp
1500
500
kb
1.2
图 5转基因大岩桐的 PCR检测
1：野生型大岩桐；2~6：转基因大岩桐；7：pBS-CFL质粒；M：
DNA marker
Figure 5 PCR analysis of the transgenic plants
1: Wild-type gloxinia; 2~6: Transgenic gloxinia; 7: pBS-CFL
plasmid; M: DNA marker
图 6转基因大岩桐的斑点杂交
1：pBS-CFL质粒；2：野生型大岩桐；3~6：转基因大岩桐
Figure 6 Dot blot of transgenic gloxinia
1: pBS-CFL plasmid; 2: Wild-type gloxinia; 3~6: Transgenic gloxinia
1 2 3 4 5 6
瓶中(图 4 B)，最终获得了一大批潮霉素抗性再生植
株(图 4 C)。
1.3.2 PCR检测
对潮霉素抗性再生苗进行了 CFL 基因的 PCR
检测。检测所得结果如图 5所示。从图 5上可看出，
大部分植株 DNA扩增后均获得一条约 1.2 kb的条
带，这初步说明外源基因已整合到大岩桐基因组中，
未转化大岩桐总 DNA未能扩增出相应的条带。
1.3.3点杂交分析
将PCR检测为阳性的再生苗的总 DNA用 CFL
基因探针进行点杂交分析，结果如图 6所示，PCR阳
性植株均显示较强的阳性反应信号。说明这些植株
的基因组中确实已包含此外源基因。
1.4 转基因大岩桐的栽培与观察
将分子检测为阳性的转基因大岩桐移栽到盆中
并在长日照的环境下生长直至开花。统计分析表明，
超过 71%的转基因大岩桐比野生型提早 26~32 d开
花，且大部分的转基因植株不形成侧枝而是直接在
顶端成花(图 7)。
2 讨论
在本研究中我们还采用了不同的外植体 (叶片
和茎段)，不经愈伤组织直接分化途径。结果表明，叶
片和茎段均可用于大岩桐的组培快繁。但两种材料
也存在一些不同，比如，由叶片诱导产生的小苗色泽
墨绿且更易生根，而由茎段诱导产生的小苗呈嫩绿
色且生根较慢。故认为，大岩桐无菌苗的叶片可能是
更为理想的用于遗传转化的材料。
农杆菌转化单子叶植物的影响因子很多，包括
植物体的创伤反应、外植体的选择、农杆菌感染及共
培养条件、植株的基因型等。为了能建立一个有效的
农杆菌介导的大岩桐遗传转化方法，本研究通过改
变农杆菌介导法的一些参数，期望能提高转化效率。
同时也比较了不同方法(超声波法)的转化效率。
在单子叶植物的转化中，经常在农杆菌的培养
基中和共培养基中加入乙酰丁香酮等酚类化合物以
提高转化效率，Hiei等 (1994) 证明添加 100 μmol/L
的乙酰丁香酮是农杆菌介导水稻转基因成功的关
键。本研究尝试在预培养阶段也添加了乙酰丁香酮，
但效果并不明显。本研究的 B2处理表明直接往外植
体上滴加农杆菌菌液的效果并不好，可能是由于农
杆菌感染不够充分所引起，在今后的实验中还将继
续改进。
SAAT (sonication-assisted agrobacterium-mediated
transformation) 是一种借助超声波处理的农杆菌介导
法。外植体与农杆菌共感染时，利用超声波短暂处
理，可以使细胞表面产生微创伤，以有利于农杆菌有
效感染细胞。因此在农杆菌介导法方面，超声波可以
作为一个有效的工具(Trick and Finer, 1997; Trick and
Finer, 1998)。我们的实验结果也表明，超声波处理能
提高转化效率。在我们的实验中，超声波处理 10 s的
效果要好于 30 s和 2 min，但在超声波处理的时间和
农杆菌菌液的浓度方面也还需要进一步的探索。同
时，转基因大岩桐比野生型提早开花的结果表明 CFL
基因和 LEAFY(LFY)基因在功能上是同源的，我们对
转基因大岩桐的生理功能和机理研究将继续进行。
图 7大岩桐开花
A：野生型大岩桐；B：转基因大岩桐
Figure 7 The flower of gloxinia
A: Wild-type gloxinia; B: Transgenic gloxinia
458
3 材料与方法
3.1 材料
3.1.1植物材料
大岩桐(Sinningia speciosa)无菌苗由杭州师范大
学生命科学院王利琳博士提供。
3.1.2菌种和质粒
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105
菌株，大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α 菌株，质粒
pCAMBIA13011为浙江大学细胞与遗传重点实验室
保存。含有 CFL基因片段 (约 1.2 kb) 的克隆载体
pBS-CFL，由杭州师范大学王利琳博士提供。
3.1.3试剂
PCR引物和各种限制性内切酶由宝生物公司合
成及订购，T4DNA连接酶、DNA胶回收试剂盒等均
购自上海生物工程公司，DNA探针标记和检测试剂
盒Ⅰ购于武汉博士德生物工程有限公司，其他常规
试剂均为国产分析纯级。
3.2 植物表达载体的构建
采用双酶切法构建 CFL 基因植物表达载体
pCA-CFL并分别转化大肠杆菌 DH5α和根癌农杆菌
EHA105。表达载体的构建流程如图 8所示。
3.3 筛选压的确定
将未转化的大岩桐无菌苗的叶片转入含不同浓
度潮霉素 (hygromycin, Hyg)(0、20、30和 40 mg/L)的
诱导培养基 MS1 (MS +2.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L
NAA，大量元素为 1/2 MS macro)上培养，25℃，光照
16 h/d。
3.4 农杆菌介导的大岩桐遗传转化
3.4.1外植体(叶片)预处理
(1) 无菌叶片接到共培养基 (MS 培养基+2.0
mg/L 2,4-D+500 mg/L水解酪蛋白+10 mmol/L 葡萄
糖)上预培养 2 d，计为 A，共有 6×3=18皿。
(2)无菌叶片接到含 100 μmol/L AS的共培养基
上预培养 1 d，计为 B，共有 2×3=6皿。
3.4.2转化
(1)从 YM培养基(0.5 g/L KH2PO4 +0.3 g/L Yeast
extract +10 g/L Mannitol +2 g/L Glutamine +0.2 g/L
NaCL+0.2 g/L MgSO4+15 g/L Agarose)上用钥匙将农
杆菌收刮下来，悬浮于含有 100 μmol/L AS的 AAM
培养基(10 ml/L AA macro+5 ml/L B5 micro+10 ml/L
B5 有机 +10 ml/L MS Fe2++10 ml/L MS Ca2++ 500
mg/L Casein hydrolysate+20 g/L sucrose)中，使初始的
OD600约为 0.8，然后振摇 60 min，OD600为 1.0。
(2) 将大岩桐叶片分别收集到 5个无菌三角瓶
中，其中 3个三角瓶加入稀释 3倍左右的振摇的农
杆菌菌液(OD600约为 0.3) 70 mL，分别超声波处理 10
s、30 s和 2 min，计为 A1，A2和 A3。将一部分 A处
理的叶片收集到另 1个三角瓶中，倒入上述振摇的
农杆菌液 70 mL，淹没叶片，暗处静置 30 min，这样
的转化计为 A4；最后一组，在稀释 3倍左右的农杆
菌菌液中，先超声波处理 10 s，然后暗处静置 20
min，计为 A5。农杆菌处理后的叶片用无菌滤纸吸干
表面菌液后，放到共培养基中培养 3 d。
(3)将 B处理的叶片收集到无菌的三角瓶中，倒
入步骤(1)振摇后的农杆菌液 70 mL，淹没叶片，暗处
静置 30 min，然后无菌滤纸吸干表面菌液后，放到共
培养基中培养 3 d，计为 B1；B2处理叶片直接滴加
5 μL OD600约为 1.0的农杆菌菌液，然后共培养 3 d。
(4)共培养 3 d后，从共培养基上收集叶片到三
角瓶中，经过如下洗涤：先用无菌水漂洗愈伤组织，
然后用加有 500 mg/L头孢霉素 (cefotaxine, Cef)的
MS培养基洗，这样为一个循环，洗 2~3个循环，然后
无菌滤纸吸干。
(5)将吸干的叶片接到筛选培养基上进行继代
培养。
SalⅠ CFL
pBS
SalⅠ/SacⅠ
SalⅠ
SalⅠ SacⅠ
SacⅠ
SacⅠSalⅠ
SacⅠ
CFL
pCA-CFL
T4 DNA ligase
pCABM13011
pCABM13011
SalⅠ/SacⅠ
SalⅠ
SacⅠ
11058
11035Lac
图 8表达载体 pCA-CFL的构建流程
Figure 8 Flow of pCA-CFL vector construction
农杆菌介导的 CFL(Cucumber-FLO-LFY)基因遗传转化大岩桐
Transformation of CFL(Cucumber-FLO-LFY) Gene in Gloxinia(Sinningia speciosa) Mediated by Agrobacterium tumefaciens 459
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3.4.3 GUS染色检测
取小块叶片放到 Eppenddof管中，加入反应液
(20 mmol/L X-glucin dimethyformamide，0.2 mmol/L
NaH2PO4，100 mmol/L EDTA，10 mmol/L 高铁氰化
钾，1% Triton-X100)，37℃过夜，观察染色情况。
3.5 大岩桐再生苗的 PCR检测
登录 GenBank 查阅 CFL 全序列 (GenBank:
AF059320, AF059291)，利用 Primer5引物设计软件
分析基因内 SalⅠ和 SacⅠ酶切位点，设计上下游引
物为：
F：5-CCGAGCTCTTGACAAGAGAGACTGAAAT-3；
R：5-GACCCGGGATGGATCCAGAAACCCTCTCC-3。
PCR扩增片段长度约为 1.2 kb。大岩桐总 DNA
的提取参考 Murray和 Thompson (1980) 的方法，
PCR扩增体系为 25 μL，其中包括 10×PCR Buffer
2.5 μL，Mg2+(25 mmol/L)2 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2
μL，引物(2.5 μmol/L)各 1.5 μL，Taq DNA聚合酶(5
U/μL) 0.5 μL，模板 (20 ng/μL) 1.0 μL，ddH2O 14
μL。扩增基因组 DNA序列循环参数为：94℃变性
30 s，55℃退火 45 s，72℃延伸 60 s，35个循环。取 5
μL PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
3.6 转基因大岩桐的点杂交分析
按照 DNA探针标记和检测试剂盒Ⅰ的操作说
明对 PCR检测为阳性的植株进行斑点杂交分析。将
植物总 DNA稀释成不同浓度，于 95℃水浴 10 min，
迅速插入冰中，取 1 μL点样至尼龙膜上，用 DIG标
记 CFL基因片段为探针进行杂交，DAB显色。
3.7 转基因大岩桐植株的盆栽观察
将转基因大岩桐移栽到盆中，并对其开花情况
进行统计分析。
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农杆菌介导的 CFL(Cucumber-FLO-LFY)基因遗传转化大岩桐
Transformation of CFL(Cucumber-FLO-LFY) Gene in Gloxinia(Sinningia speciosa) Mediated by Agrobacterium tumefaciens 461