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绿色荧光蛋白基因转化大岩桐的研究



全 文 :文章编号:1000-2375(2001)02-0171-03
绿色荧光蛋白基因转化大岩桐的研究
宋俊芳 ,张 秋 ,罗 明 ,罗忠训
(湖北大学 生命科学学院 , 湖北 武汉 430062)
摘 要:利用农杆菌介导法 , 用含有绿色荧光蛋白基因的二元双价表达载体 pBIN m-gfp5-ER转化大岩
桐 ,并得到卡那霉素(Kanamycin , Kan)抗性再生植株.对其进行初步 PCR检测 , 结果表明 , K200(含 Kan 200 mg/
L)培养基上的绿苗中有 3株 PCR结果呈阳性.对 PCR阳性的植株进行了点杂交分析 , 均表现出较强的杂交信
号 ,这说明外源基因已整合转入到大岩桐基因组中.在荧光显微镜下观察转基因大岩桐 , 发现部分花 、叶细胞
均发出一定强度的绿色荧光.
关键词:绿色荧光蛋白基因;转基因大岩桐;农杆菌介导
中图分类号:Q78  文献标识码:A
收稿日期:2000-12-20
作者简介:宋俊芳(1978- ),女 ,硕士生
大岩桐原产于巴西 ,苦苣苔科 ,属多年生肉质草本 ,具肥大块茎.地上茎极短 ,花顶生或腋生 ,大而美
丽.园艺杂种较多 ,为适宜的温室观赏花卉[ 1] .
利用基因工程的方法培育花卉品种 ,与传统的培育方法相比 ,具有周期短 、见效快 ,能定向改良花卉
性状等优点.在本研究中 ,我们将目前广泛应用的绿色荧光蛋白基因导入大岩桐中 ,获得再生苗 ,初步建
立起稳定的遗传转化体系 ,并对报告基因在大岩桐内的表达作了进一步的研究 ,以期为将来导入相关花
卉性状基因 ,定向培育大岩桐新品种打下基础.
1 材料与方法
1.1 植物材料 大岩桐无菌苗由湖北大学生命科学院陈永勤博士提供.
1.2 菌种与质粒 根癌农杆菌 LBA4404和大肠杆菌DH5αF′为本实验保存.植物双元载体 pBIN m-gfp5
-ER(含有绿色荧光基因)为英国剑桥大学Ms.Sarah Hodge和Dr.Jim Haseloff惠赠.载体的结构如图 1所
示.利用冻融法将载体转入农杆菌中 ,具体参照文献[ 2] .
图 1 二元表达载体 pBIN m-gfp5-ER的结构图
1.3 PCR引物 5′引物:5′ttcactggagttgtccc 3′;3′引物:5′gccatgtgtaatcccag 3′.PCR扩增片段长度为 675 bp.
1.4 农杆菌介导的大岩桐遗传转化 含目的基因的农杆菌菌液的制备参照文献[ 2]进行.将大岩桐无
菌苗叶片四面切伤后 ,切成小块放入农杆菌菌液中浸泡 3 ~ 10 min ,然后将叶片移至大岩桐再生培养基
上共培养 3 d.共培养后的叶片先用无菌水漂洗一次 ,再用含 250mg/L头孢毒素(Cefotaxine ,Ce)溶液漂洗
一次 ,然后置于含有 200mg/L Kan和250mg/L Ce 再生培养基上.待外植体分化出小绿芽并长至2 ~ 3 cm
时 ,将其切下转入生根培养基中 ,当根系发达时移至花盆中.
1.5 大岩桐再生苗的 PCR检测
第 23 卷第 2期
2001 年6 月
湖北大学学报(自然科学版)
Journal of Hubei University(Natural Science Edition)
 Vol.23 No.2 
Jun., 2000
1.5.1 植物总 DNA的提取 采用CTAB微量提取法.具体参照文献[ 3]进行.
1.5.2 大岩桐再生苗的 PCR分析 取上述制备的总 DNA 约 20 ng ,用检测 GFP 基因的引物 ,按标准反
应程序进行.反应总体积 20μL.具体条件为:(1)94℃3min ,(2)94℃1min;57℃1min;72℃3min;30个循
环 ,(3)72℃6min.
1.6 转基因大岩桐的点杂交分析 取3株PCR检测为阳性的植株进行点杂交分析 ,取总DNA约 900 ng
点在尼龙膜上 ,用以α-32P-dATP 标记 GFP 基因片段为探针进行杂交 ,放射自显影.
1.7 转基因大岩桐 GFP基因表达的检测 选取待检测植株的幼嫩叶片 ,参照文献[ 4]的方法 ,用果胶
酶将其降解成单细胞.同时选取待检测植株的花瓣 ,用刀切成细条状.在 495 nm 蓝光激发下 ,分别用荧
光显微镜观察.
2 结果与分析
2.1 农杆菌介导的大岩桐转化及 Kan抗性再生苗的获得 本研究中 ,我们发现在共培养基中加入乙
图 2 大岩桐再生苗 GFP基因的 PCR检测
1 DNA 分子量标记 2 阳性对照
3 正常苗 4~ 6.再生苗
酰丁香酮(Acetosyringone ,As)与不加 As ,抗性绿芽的分化率分
别为 22.5 %和 30 %.这说明对农杆菌转化单子叶植物有显著
促进作用的 As对大岩桐的转化效率无明显作用.Kan浓度为
100mg/L和 150mg/L 时 ,对照再生苗仍能生长 ,升至 200mg/
L ,才能起到有效筛选抗生组织的作用 ,最终在 40个外植体中
得到 9株存留下来的绿苗.
2.2 大岩桐再生苗的 PCR检测 对 3株抗 Kan 再生苗进行
了绿色荧光蛋白基因的 PCR检测.检测所得结果如图 2所示.
从图上可以看到 ,在约675 kb位置 3株再生苗均出现了明显的
PCR带 ,这初步说明外源基因已转入到大岩桐基因组中.
2.3 转基因植株的点杂交分析 将这 3株 PCR检测为阳性
的再生苗的总 DNA用 GFP 基因探针进行点杂交分析 ,结果见
图3.图上可看出 ,只有两株 PCR阳性植株显示较强的阳性反
图 3 转基因大岩桐 GFP基因的点杂交分析
1 ~ 2 阳性对照 3 正常苗 4~ 6 再生苗
图 4 绿色荧光蛋白在叶肉细胞中的表达
a.2 个细胞 b.多个细胞
应信号 ,这进一步说明这些植株的基因组中已包含此外源基
因.
2.4 转基因大岩桐的绿色荧光蛋白基因表达鉴定 在荧光显
微镜下观察到的转基因植株叶肉和花瓣单细胞中GFP 基因表
达见图 4 、5.GFP 基因由 CaMV35S 启动子控制 ,该启动子属组
成型启动子 ,因而GFP 基因的表达不具有组织特异性.从附图
可以看到 ,叶肉栅栏组织细胞和海绵组织细胞中发光部位集
中在细胞壁的一端 ,花瓣切片中有少数整个细胞发较弱绿色
荧光.
172 湖北大学学报(自然科学版) 第 23 卷
3 讨 论
在本研究中我们利用农杆菌介导法对大岩桐进行转化.再生过程中我们同时采用了经愈伤组织再
图5 绿色荧光蛋白在花瓣细胞中的表达
生和不经愈伤组织直接分化两种途径.结果表明前
者愈伤组织容易变褐死亡 ,再生率极低.而后者的再
生率相对较高.说明在大岩桐遗传转化中农杆菌感
染对愈伤组织生长的影响较对芽分化的影响要大.
大岩桐的转化后再生尚需进一步研究 ,以寻找最佳
培养基和最佳处理条件.
绿色荧光蛋白能够自身催化形成发色结构 ,并
在蓝光激发下发出绿色荧光.绿色荧光蛋白基因作
为遗传标记和报告基因应用于植物转基因的研究 ,
具有检测方便 ,荧光稳定 ,无毒害 ,无物种特异性等
特点.但同时也存在有假象干扰和表达效率较低等
问题[ 5] .绿色荧光蛋白基因是由 CaMV35S 启动子控
制的 ,CaMV35S 启动子属组成型启动子 ,因而GFP 基
因的表达不具有组织特异性 ,我们的研究中也证实了这一点 ,花和叶中都可观察到绿色荧光蛋白的表
达.但是只有部分叶肉和花瓣细胞可以观察到绿色荧光 ,这可能是由于 CaMV35S 启动子控制下的绿色
荧光蛋白基因在大岩桐中表达效率不高 ,以及由于某些未知原因在部分细胞中表达强度较弱而无法用
肉眼观察到.至于为何叶肉细胞中发光部位集中在细胞壁的一端(见图 4),原因尚不得而知.在花瓣中
观察到整个细胞发绿色荧光(见图 5),说明导入的外源基因可以在花瓣中表达 ,尽管表达水平不高 ,但
为以后进一步的研究如导入改变花色的基因打下了基础.
致 谢 本研究得到了湖北大学生命科学学院陈永勤博士的大力帮助 ,谨表谢意.
参考文献:
[ 1] 陈俊瑜 ,刘师民.园林花卉(增订本)[M] .上海:上海科学技术出版社 , 1994.447~ 450.
[ 2] Stanton B Geluin , Robert A Schilperoort.Plant molecular biology manual[ M] .Dordrecht:Kluwer Academic Publisher , 1988.
[ 3] 顾红雅 ,瞿礼嘉 , 明小天 ,等.植物基因与分子操作[ M] .北京:北京大学出版社 , 1995.19~ 21.
[ 4] 李浚明.植物组织培养教程[ M] .北京:北京农业大学出版社 , 1992.76~ 77.
[ 5] 张 峰 ,任 燕 , 陆长德.绿色荧光蛋白及其应用[ J] .生命科学 , 1999 , 11(2):61~ 65.
[ 6] 罗忠训 ,夏 胜 , 张 秋 ,等.绿色荧光蛋白基因在烟草植株中的表达[ J] .华中理工大学学报 , 1999 , 27(9):64~ 66.
Studies on transgenic Sinningia speciosa with green fluorescent protein gene
Song Junfang ,Zhang Qiu , Luo Ming , Luo Zhongxun
(School of Life Science , Hubei University , Wuhan 430062 , China)
Abstract:By Agrobacterium-mediated method , the Sinningsa speciosa was transformed with binary expression
vector pBIN m-gfp-ER , containing NPT gene and GFP gene.Obtained some Kanamycin(Kan)-resistant regen-
eratied green shoots , PCR test showed that three green shoots can amplified bands with GFP primers.Also got pos-
tive siginal in the dot blot hybridizition analysis with these green shoots.These results indicate that the foreign gene
had transformed into plants genome.Observing these transgenic plants with fluorescent microscope , it was found that
green fluorescent can be seen in part cells of leaves and bloom.
Key words:green flurescent protein gene;transgenic Sinningsa speciosa;Agrobacterium-mediated
(责任编辑 游 俊)
173第 2期 宋俊芳等:绿色荧光蛋白基因转化大岩桐的研究