全 文 ：　 　第 38 卷　第 1 期
1999 年　1月
中山大学学报 (自然科学版)
ACTA　SCIENTIARUM　NATURALIUM
UNIVERSITATIS　SUNYATSENI
　
Vol.38　No.1
Jan.　1999
　
文章编号:0529-6579 (1999)01-0093-97
含笑亚族及其近缘植物 matK基因序列分析
金　虹 , 施苏华＊＊ , 潘恒昶 , 黄椰林 , 张宏达
(中山大学生命科学学院 , 广州 510275)
摘　要:测定了木兰科等 14种植物的叶绿体 matK基因的一段长 1 039 碱基对的序列.最大
同源性分析构建的系统树图建议:①与一般的分类系统的结果一致 , 含笑属的 3个种间具有
极高的同源性;②合果木属 、 观光木属与含笑属之间的同源性也很高 , 建议它们有可能可以
归为同一亚族 , 甚至归为同一属;③与一般分类系统相反 , 长蕊木兰属与木兰属的关系较远
而与含笑属极接近 , 故有可能归入含笑亚族.
关键词:系统发育关系 , 木兰科 , matK 基因 , 含笑亚族
分类号:Q 949.747.1 , Q 751　　文献标识码:A
近年来 , 采用分子生物学手段来分析许多存在争议的系统学问题 , 已经获得了很大成
功[ 1] .其中基因序列分析是比较常用的手段之一.已经报道用来作序列分析的基因主要有
ITS[ 2]及 rbcL[ 3]等.虽然 rbcL基因研究取得一定成果 , 但由于 rbcL基因的进化速度较慢 ,
对于科以下的分类不能取得令人满意的结果[ 4] .matK 基因全长约为 1 500碱基对 , 位于
叶绿体赖氨酸 tRNA基因 (trnK)的内含子内 , 为单一拷贝编码基因[ 5] .matK基因所编码
的蛋白其羧基端的 102个氨基酸在结构上与成熟酶样多肽相似 , 有可能参与了 Ⅱ类内含子
的剪接.大量的实验结果表明在科及科以下分类单元的研究中 matK比 rbcL 更合适.
木兰科 (Magnoliaceae)是被子植物系统发育与进化研究中的关键科 , 在各大植物分类
系统中均处于原始的位置 , 研究木兰科植物的系统发育对于研究整个被子植物的系统发育
具有重大意义.含笑属 (Michelia Linn.)是狭义木兰科中常见的类群之一.它所包含的种
类多少及其在木兰科中的分类地位长期以来争论不休[ 6～ 8] .
本论文选取含笑属以及与之相关的有争议的若干个类群 , 利用 matK基因序列分析 ,
来探讨其系统学问题.
1　材料与方法
1.1　材　料
选用新鲜叶片作为材料 , 样品来源见表 1.
基金项目:国家自然科学基金 (39570052 , 39970057);广东省自然科学基金 (970190)
　＊＊ 通讯联系人
收稿日期:1998-10-15　　第一作者简介:金虹 , 女 , 22 岁 , 研究生
表 1　木兰科和外类群的材料来源 (按刘玉壶 , 1994系统)
Tab.1　Accessions of Magnoliaceae and the complex outgroup sampled
类　　群 标本凭证号 样品来源
Illicium henryi J.P.274 (华南植物所) 华南植物园 , 广州
Alcimandra cathcartii J.P.271 (华南植物所) 华南植物园 , 广州
Liriodendron tulipifera J.P.272 (华南植物所) 华南植物园 , 广州
Magnolia henryi T.C04 (华南植物所) 华南植物园 , 广州
Magnolia albosericea T.C01 (华南植物所) 华南植物园 , 广州
Magnolia denudata J.P.306 (中山大学) 中山大学标本馆 , 广州
Michelia alba T.C82 (中山大学) 中山大学标本馆 , 广州
Michelia figo T.C83 (华南植物所) 华南植物园 , 广州
Michelia foveolata S.Shi147 (中山大学) 黑石顶自然保护区 , 广东
Paramichelia baillonii J.P.269 (华南植物所) 华南植物园 , 广州
Tsoongiodendron ordorum J.P.259 (华南植物所) 华南植物园 , 广州
Manglietia moto S.Shi144 (中山大学) 黑石顶自然保护区 , 广东
Manglietia hainanensis S.Shi74 (华南植物所) 华南植物园 , 广州
Altingia gracilipes Hao155 (中山大学) 中山植物园 , 南京
1.2　方　法
1.2.1　植物 DNA的提取与纯化　采用CTAB法[ 9]提取植物总DNA , 并用玻璃粉进行纯化.
1.2.2　matK基因片段的扩增　用 2套引物扩MG15 、 trank-3914与 trank-2R增出 matK基
因片段MG1与 (表2).PCR程序为 94 ℃变性4 min , 然后94 ℃1min , 50 ℃1min , 72 ℃
3 min循环25次 , 最后 72 ℃延伸 10 min.扩增产物用Millipore 试剂盒纯化以消除没有结合
的引物及核苷酸.
1.2.3　双链测序　本实验不经分子克隆 , 而将纯化后的 PCR产物直接进行双链测序.采
用双脱氧链终止法 , 用 T7 DNA Sequenase Version 2.0 Kit(Amersham), 并用α-35S-dATP 作为
放射性探针.测序采用了 3个引物:MS3R , MS2F , matK-1470R (见表 2).测序反应产物
用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离 , 序列胶于 50 ℃烘箱干燥 3 h , 放射自显影.
表 2　PCR扩增引物及测序引物
Tab.2　Primers used for PCR and sequencing
引　物 序　　列 用途 设计者
Trank-3914F 5′TGGGTTGCTAACTCAATGG 3′ PCR扩增 Learn Jerry
Trank-2R 5′AACTAGTCGGATGGAGTAG 3′ PCR扩增 Kelly Steele
MG15 5′ATCTGGGTTGCTAACTCAATG 3′ PCR扩增 Liang and Hilu
MG1 5′CTACTGCAGAACTAGTCGGATGGAGTAGAT 3′ PCR扩增 Liang and Hilu
MS3R 5′TA (T/ C)TGAATGAATAGATCGTA 3′ 测序 施苏华
matK-1470R 5′AAGATGTTGAT (T/ C)GTAAATGA 3′ 测序 Johnson/Soltis
MS2F 5′CTATATAATTCTCATGTAT 3′ 测序 施苏华
1.2.4　数据处理　利用PAUP 3.1.1软件包[ 10]按照最大同源性原则将所测序列进行排列
比较 , 得出相互间的差异数值即序列间相同点的核苷酸差异数.按照Kimura[ 11]的公式对核
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苷酸差异数进行校正.根据核苷酸差异数及 Knuc值建立差异矩阵 , 构建分子系统进化树.
用穷举法对135 000棵树进行比较 , 最终得出 15棵可能的系统树 , 并由此运算得到计算机
自展树 (图1).
　I.hennryi 274　A.gracilipes 155
　L.chinense 275
　M.moto 144
　M.hainansis 74
　Mag.henryi C04
　Mag.albosericea C0
　Mag.dendudata 306　Mi.alba 82　Mi.figo 83　Mi.foveolata 147　Pm.baillonii 269　Ts.odorum 259　A.cathcartii 271
99
97
74 84
100
94
图 1　计算机自展树
Fig.1　Bootstrap tree of the most parsimonious trees
2　结果与讨论
共测得 1 039碱基对的 matK 基因序列.
整个序列显示所测得的 matK基因片段 5′端
较为保守 , 而3′端相对而言没那么保守.差
异矩阵的结果表明:①含笑属 3种(Micheli-
a alba , M.figo , M.foveolata)、 合 果 木
(Paramichelia baillonii)、观光木(Tsoongioden-
dron odorum)及长蕊木兰(Alcimandra cathcarti-
i)之间的核苷酸数差异极小 , 介于 0 ～ 7 之
间;②以上 6 个种与木兰亚属 (Subgeneus
Magnolia)2种的木兰(Magnolia albosericea ,
M.henryi)之间的核苷酸差异介于 12 ～ 18之间 , 约占所测序列的 1%, 与鹅掌揪 (Lirioden-
dron chinense)的差别最高也仅 21 , 约为 2%;③玉兰 (Magnolia denudata)与含笑属有较
近的亲缘关系 , 它们之间有 5 ～ 8个核苷酸的差异.而玉兰亚属 (Subgenus Yulania)的种
与木兰亚属的种 , 其差异是 13 ～ 16个核苷酸 , 与前者比较 , 玉兰亚属与木兰亚属的关系
较远.计算机自展值 (图 1)再现了以上的结果.从图中可以看出 12种木兰科植物与红
茴香 (Illicium henryi)、 齿叶阿丁枫 (Altingia gracilipes)之间的分子差异很大 , 形成 1个独
立的单元并得到了 100%的计算机自展值的支持.图中还显示木兰属 、 木莲属及含笑属等
与鹅掌揪属形成姐妹类群 , 并得到 74%的计算机自展值的支持.分子数据分析的结果基
本同意把木兰科分为 2个亚科木兰亚科 (Magnolioideae)及鹅掌揪亚科 (Liriodendroideae)
的观点.不支持鹅掌揪属作为 1个独立科的意见.图中显示木兰亚科分为 3支 , 第 1支为
木兰亚属 , 第 2支为玉兰亚属 、 含笑属 、 合果木属 、观光木属及长蕊木兰属 , 第 3支为木
莲属.它们的计算机自展值分别为 99%, 97%及 94%.在第 2 支中 , 玉兰亚属与木兰科
植物其余 4个类群形成姐妹类群 , 而其中支持含笑属等所在的分支的计算机自展值高达
84%.此结果表明含笑属 、合果木属 、 观光木属和长蕊木兰属在 matK基因分子水平上的
差异极小 , 反映它们之间亲缘关系非常密切.
与前人所得的结果相比 , matK基因序列分析所得的结果显示:含笑属等木兰科植物
系统发育关系在观光木 、 合果木 、 长蕊木兰的归属问题上有不同的地方.Dandy 认为观光
木应单独成为一属 , 与含笑属 、木兰属等并列归入木兰族.而 Nooteboom即将观光木作为
含笑族内含笑属的一个组.而本研究的结果显示观光木与含笑属3个种的绝对核苷酸差异
为2 ～ 4 , 系统发育关系较近.而观光木与木兰亚属的绝对核苷差异数达到了 16 ～ 20 , 与
前者比较而言 , 这两者的关系要远些.含笑属 3种之间的绝对核苷酸差异为 0 ～ 4 , 与木
兰亚属的绝对差异为 12 ～ 18.所以建议把观光木属与含笑属列入同一类群.Paglowski认为
在花粉形态上没有足够的证据把合果木列为独立的属.Dandy 和 Nooteboom则把合果木放
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在木兰属内.刘玉壶[ 8]认为合果木的花粉粒的大小 、 形状和雕纹与含笑属及木兰属中具小
粒花粉的种类相类似 , 而幼叶卷折式 , 花 、 聚合果形态等较进化特征及地理分布等与含笑
族其他属有明显区别 , 所以将其放在含笑亚族内位于含笑属之后.本研究的结果显示合果
木与含笑属 3个种的核苷酸绝对差异数为 2 ～ 4 , 而与木兰亚属的绝对差异数为 14 ～ 18 ,
显然合果木与含笑属的关系 , 比合果木与木兰亚属的关系近 , 因此支持把合果木放在含笑
的同一类群的论点.长蕊木兰最早为 Dandy定名 , 他把长蕊木兰属与木兰属并列归入木兰
族 , 且认为长蕊木兰属比较原始.Nooteboom 把它归在木兰亚属内作为 1个组.刘玉壶[ 8]
认为该属既保存着木兰族外部形态的原始特征 , 也显示着含笑族中含笑属外部形态与内部
结构的进化特征 , 因此将本属排列在木兰族内各属之后而与含笑族紧接.本研究的结果显
示 , 长蕊木兰与含笑族各属的绝对核苷酸差异为 3 ～ 5 , 与观光木的差异为 3 , 而与木兰属
的差异为 14.因此建议长蕊木兰有可能可以与含笑属归为同一类群.
前人关于木兰科含笑属等类群的研究结果主要基于形态学上的特征[ 6～ 8] .由于木兰科
植物除鹅掌揪属外 , 其余各属无论在内部结构与外部形态都有重叠现象 , 所以给形态学上
的分类带来诸多不确定因素.基因序列分析在木兰科植物分类上的应用从定量的角度来
说 , 从另一侧面部分解决了以上问题.进化速率不同的基因可以用来进行不同水平上的系
统发育分析.整个 matK基因可以用来进行多个水平的系统发育分析[ 5] .对于科间水平的
分析来说 , matK基因的 3′端能提供足够的信息 , 而科内水平则 5′端能提供足够的信息.
但木兰科植物的 matK基因序列相当保守 , 1 039碱基对的片段中木兰亚科间的绝对核苷
酸差异不到 20个 , 所提供的信息量不够充分.进一步的工作可以考虑用进化速率更快的
基因或结合多个基因的序列进行分析.
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Phylogenetic Relationships between Michelia (Magnoliaceae)and
Its Related Genera Based on the matK Gene Sequence
JIN Hong
, SHI Suhua , PAN Hengchang , HUANGYelin , ZHANG Hongda
Abstract:The sequences of a segment of the matK gene from 14 species of the Subtribe Micheliinae
and the related groups of Magnoliaceae were analyzed in this study.The phylogenetic trees based on
the maximum homological analysis suggested:①Consistent with the former systems , the three species
within the genera Michelia were extremely homologious.② Paramichelia and Tsoongiodendron were
also highly conservative to Michelia which suggested they would be treated as the same subtribe , or
even as the same genera.③Contrast to former classifications , Alcimandra was much closer to Miche-
lia than to Magnolia , and it could be classified in the subtribe Micheliinae.
Keywords:phylogenetic relationship , Manoliaceae , Michelia , matK gene , Micheliinae
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School of Life Sciences , Zhongshan University , Guangzhou 510275 , China