全 文 ：[收稿日期 ] 2008-09-19
[基金项目 ] 海南省自然科学基金项目 (80591)
[作者简介 ] 张艳秋(1962-),女 ,吉林人 ,研究员 ,执业药师。
HPLC法测定裸花紫珠中齐墩果酸与熊果酸的含量
张艳秋 1 ,洪金波 1 ,刘文林2
(1.海南省药物研究所 ,海南 海口　570314;2.海南制药厂有限公司 ,海南 五指山　572200)
　　[摘要 ] 目的:建立裸花紫珠中齐墩果酸与熊果酸的含量测定方法 ,考察海南五指山地区野生裸花紫珠
中齐墩果酸与熊果酸的含量。方法:采用高效液相色谱法测定裸花紫珠中齐墩果酸与熊果酸的含量 ,乙
腈 -甲醇 -3.5 %乙酸胺水溶液(69∶10∶21)为流动相;流速为 1mL/min,检测波长为 215nm。结果:齐
墩果酸与熊果酸的线性范围分别为 1.63 ～ 6.53μg(r=0.999 6)与 1.20 ～ 7.20μg(r=0.999 7),回收
率分别为 98.11%和 101.64% 。结论:本法操作简单 ,测定结果准确 ,适于裸花紫珠中齐墩果酸与熊果
酸的含量测定。
[关键词 ] 裸花紫珠;齐墩果酸;熊果酸;高效液相色谱法
[中图分类号 ] R286.0　[文献标识码 ] A　[文章编号 ] 1007-1237(2009)01-0005-03
HPLCdeterminationofoleanolicacidandursolicacidinfoliumcalicarpaenudiflorae
ZHANG　Yan-qiu1 , HONG　Jin-bo1 , LIU　Wen-lin2
(1.PharmaceuticalInstituteofHainanProvince　Haikou570314, China;2.HainanPharmaceuticalFactory
CO.LTD　Wuzhishan572200, China)
[ ABSTRACT] Objective:Toestablishamethodforqualitycontrolofoleanolicacidandursolicacidinfoli-
umcalicarpaenudiflorae, whichisoriginalygrewinthefive-fingermountainarea.Methods:Thecontentof
oleanolicacidandursolicacidinfoliumcalicarpaenudifloraeweredeterminedbyhighperformanceliquidchroma-
tography(HPLC).TheanalyticalcolumnwasC18(250 mm×4.6mm, 5 μm).Themobilephaseconsistedoface-
tonitrile-methanol-3.5%ammoniumacetate(69∶10∶21), theflowratewas1.0 mL/min.TheUVdetectionwave-
lenghthwas215nm.Results:Oleanolicacidandursolicacidshowedagoodlinearityinrangeof1.63 ～ 6.53 μg
(r=0.999 6)and1.2 ～ 7.2 μg(r=0.999 7).Theaveragerecoverywas98.11% , 101.64%, respectively.
Conclusion:Themethodisasimple, convenient, accurateandrelable, anditcanbeusedtoqualitycontroloffo-
liumcalicarpaenudiflorae.
[ KEYWORDS] Foliumcalicarpaenudiflorae;Oleanolicacid;Ursolicacid;Highperformanceliquidchro-
matography(HPLC)
　　裸花紫珠药材为马鞭草科植物裸花紫珠(Cali-
carpanudifloreaHook.EtArn.)的干燥叶 ,具有消
炎 、解毒 、收敛 、止血作用 ,用于治疗化脓性炎症 、急
性传染性肝炎 、外治烧伤 、烫伤 、外伤出血等 ,是海南
黎族民间常用的一味药材 。
在海南黎族民间验方基础上 ,经现代研究发展
而成的裸花紫珠片与复方木麻黄片 ,就是以裸花紫
珠为主药的成方制剂 ,前者用于治疗胃出血及病毒
性肝炎 ,后者用于治疗寒湿痢疾 。裸花紫珠药材主
产海南五指山地区 ,由于裸花紫珠药材化学研究较
少 ,化学成分不明确 ,其含量测定指标难以建立 ,给
药材质量控制带来困难 。最新研究文献报道 ,从裸
花紫珠中分离出了具有抗菌消炎作用的齐墩果酸 、
熊果酸以及黄酮类成分[ 1] ,我们经对其进行薄层色
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海南医学院学报　 2009, 15(1)JournalofHainanMedicalCollege　
DOI :10.13210/j.cnki.jhmu.2009.01.007
谱及高效液相色谱(HPLC)分离检测发现 ,裸花紫
珠中所含齐墩果酸与熊果酸含量很高 ,以两者作为
含量测定指标对裸花紫珠药材进行质量控制具有实
际意义 。本实验系用 HPLC法对裸花紫珠中齐墩果
酸与熊果酸含量进行了测定 ,为进一步进行新制剂
开发和质量控制提供科学依据 。
1　仪器 、试剂与样品
Waters高效液相色谱仪 (Delta600泵 , 2487检
测器);Milennium色谱工作站;齐墩果酸与熊果酸
化学对照品购自中国药品生物制品检定所 ;裸花紫
珠药材采自海南省五指山区 ,由本所鉴定;乙腈 、甲
醇为色谱纯 ,其它均为分析纯试剂 。水为自制纯化
水。
2　试验方法与结果
2.1　色谱条件与系统适用性
色谱柱:LichrospherC18 (250 mm×4.6 mm,
5μm),流动相:乙腈 -甲醇 -3.5%乙酸胺水溶液
(69∶10∶21),流速为 1 mL/min,检测波长为 215 nm,
柱温 30 ℃,进样量 20 μL。在此条件下 ,取裸花紫
珠供试品溶液 、齐墩果酸与熊果酸对照品溶液分别
进样 ,所得色谱图见图 1A、B,齐墩果酸与熊果酸能
有效分离 。
a.齐墩果酸(Oleanolicacid)b.熊果酸(Ursolicacid)
图 1　齐墩果酸与熊果酸对照品(A)、裸花紫珠(B)的 HPLC色谱图
2.2　供试品溶液的制备
取本品 60 ～ 65 ℃干燥 ,粉碎成粗粉 ,精密称取
约 0.3 ～ 0.5g,置烧瓶中加乙醇 30mL,加热回流提
取 2次 ,每次 1h,合并乙醇提取液 ,滤过 ,滤液置蒸
发皿中 ,再以 30 mL乙醇分次洗涤药渣及滤器 ,洗
液并入蒸发皿中 ,水浴蒸干乙醇 ,残渣以石油醚(60
～ 90℃)浸洗 2次 ,每次 25 mL, 2min,倾去石油醚 ,
残渣加甲醇适量多次洗涤 ,洗液定量转移至 10 mL
量瓶中 ,加甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,用 0.45 μm微孔
滤膜滤过 ,取续滤液作为供试品溶液 。
2.3　线性关系考察
2.3.1　齐墩果酸线性关系考察　精密称取齐墩果
酸 8.19 mg(纯度 99.6%),置于 25 mL量瓶中 ,加
甲醇至刻度 ,摇匀 ,得齐墩果酸对照品溶液的储备
液 。精密吸取该对照品溶液的储备液 2.5、4.0、5.
0、7.5、10 mL分别置于 10 mL量瓶中 ,加甲醇稀释
至刻度 ,摇匀 ,各精密进样 20 μL,按前述 HPLC条
件测定 ,以对照品溶液浓度(C)对峰高度(H)进行
回归 ,回归方程为:H=285C-6 712, r=0.999 6,结
果表明齐墩果酸在 81.6 ～ 326.3 μg/mL(1.63 ～
6.53μg)范围内呈良好的线性关系 。
2.3.2　熊果酸线性关系考察　精密称取熊果酸对
照品 12.75mg(纯度 98.0%)于 25 mL量瓶中 ,加
甲醇至刻度 ,摇匀 ,得熊果酸对照品溶液的储备液 。
精密吸取该对照品溶液的储备液 0.6、 1.2、1.6、
2.4、3.0、3.6 mL分别置于 5 mL量瓶中 ,加甲醇稀
释至刻度 ,摇匀 ,各精密进样 20 μL,按前述 HPLC
条件测定 ,以对照品溶液浓度 (C)对峰高度(H)进
行回归 , 回归方程为 H=178C-212, r=0.999 7,结
果表明熊果酸在 60 ～ 360 μg/mL(1.20 ～ 7.20 μg)
范围内呈良好的线性关系 。
2.4　精密度试验
吸取同一供试品溶液依法分别重复进行 5次
测定 ,记录峰高度值测得熊果酸 、齐墩果酸 5次连
续进样变异系数分别为 1.6%、1.6% ,表明连续进
样重复性良好。
2.5　重现性试验
按样品测定法对同一样品分取 5份 , 同法处
理 ,分别以峰高度值计算齐墩果酸 、熊果酸含量 , 结
果变异系数分别为 1.7%、2.2%,表明重现性良好 。
2.6　稳定性考察
取同一供试品溶液分别在 1、4、6、8h进行峰高
6 　海南医学院学报 Vol.15No.1 Feb.2009
值测定 ,测得 8 h内熊果酸峰高变异系数 RSD =
0.98%,齐墩果酸峰高变异系数 RSD =1.40%,可
见供试品溶液在 8 h内稳定。
2.7　加样回收率试验
采用加样 回收 法 , 取已知 含量 (熊 果酸
7.72mg/g、齐墩果酸 1.83 mg/g)的本品 ,精密称定
5份 ,每份约 0.23 g,分别精密加入熊果酸 1.697
mg,齐墩果酸 0.489 mg,依法测定 ,回收率分别为
98.11%、 101.64%, 变异系数分别为 1.04%、
1.42%,表明本方法回收率良好。
2.8　样品的测定
取 3个批次的裸花紫珠样品制成供试品溶液 ,
分别精密吸取对照品溶液 、供试品溶液各 20 μL于
液相色谱仪中 ,测得齐墩果酸 、熊果酸色谱峰高度
值 ,以外标法计算其含量。 3批裸花紫珠样品中齐
墩果酸与熊果酸含量测定结果见表 1。
表 1　样品测定结果(%, n=3)
编号 齐墩果酸 熊果酸
1 0.110 0.415
2 0.135 0.443
3 0.183 0.772
3　讨论
本试验结果表明裸花紫珠样品中齐墩果酸与
熊果酸含量比为 1∶3 ～ 4,含量分别约占药材的 0.
1% ～ 0.2%和 0.4% ～ 0.8%,含量的不同与采收季
节有关 ,其中 1、2号样品为夏季采收 , 3号样品为秋
季采收 ,提示本品秋季采收齐墩果酸与熊果酸含量
高 。
本试验所测齐墩果酸与熊果酸为抗菌 、消炎 、
护肝降酶的活性成分 ,测定两者的含量对控制本品
质量有实际意义 ,但 2种物质相同分子的异构体 ,
化学性质相似 ,达到基线分离难度很大。经系统适
用性研究 ,上述条件下两者基本达到分离 ,分离度
1.49,但尚未完全达到基线分离 ,由于 2种成分的色
谱峰为正常峰 ,适用以峰高计算含量。经试验以峰
高计算 2种成分含量重精密度较好 ,变异系数均小
于 1.8%,而以峰面积测定则精密度均较差 ,变异系
数大于 2.5%,故本试验测定齐墩果酸与熊果酸两
种成分的含量 ,以峰高计算更为准确可靠 。
从诸多文献及中国药典记载 ,对熊果酸的提取
多用乙醚 ,乙醚对熊果酸属于微溶 ,所以要进行多
次提取才能提取完全 ,而且 ,由于裸花紫珠的用药
部位为植物的叶 ,叶背密被厚厚的绒毛 ,质轻 ,直接
用乙醚提取 ,药材浮在液面上 ,不利提取 ,并且提取
液与药材不能自然分离 ,需要过滤 ,乙醚挥散快 ,也
需要反复洗 ,更加大了乙醚的用量 ,不经济;因此改
用乙醇先行回溜提取 ,就可以克服上述不足;乙醇
提取物挥干溶剂后 ,以石油醚洗涤 ,除去脂溶性色
素杂质 ,以减少对色谱柱的污染;经对石油醚提取
液进行薄层色谱检测 ,齐墩果酸与熊果酸的均呈阴
性反应 。
参考文献
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(责任编辑　李晶)
(上接第 4页)
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