全 文 ：研究报告
Research Report
青海五裂茶藨子叶绿体DNA trnL-F序列的遗传变异研究
张得钧 * 元王涛 马明呈 刘明成
青海大学,西宁, 810016
*通讯作者, djzhang@nwibp.ac.cn
摘 要 采集青海不同地理居群五裂茶藨子植物样品，采用改良 CTAB法提取五裂茶藨子总DNA。运用分子
生物学技术分析青海不同地理居群五裂茶藨子的遗传多样性。研究结果表明：青海不同地理居群五裂茶藨子
trnL-F序列可分为 7种单倍型，存在 37个变异位点，具有较高的遗传多样性(h=0.551 7)，单倍型多态性水平(h)
为 0.416 7~0.733 3，核苷酸多态性水平(p)为 0.000 930 0~0.014 20。居群遗传分化系数 Gst为 0.020 00，基因流值
Nm为 0.057 72。
关键词 五裂茶藨子,叶绿体 DNA trnL-trnF,遗传变异
Genetic Differentiation Study of Chloroplast DNA trnL-F in Ribes meyeri
Maxim. from Qinghai
Zhang Dejun * Yuan Wangtao Ma Mingcheng Liu Mingcheng
Qinghai University, Xining, 810016
* Corresponding author, djzhang@nwibp.ac.cn
DOI: 10.13417/j.gab.033.001319
Abstract Ribes meye ri Maxim. samples of different geographic population were collected from different areas.
The total DNAwas extracted from the leaf of R. meyeriMaxim. by modified CTABmethod. Genetic differentiation
of chloroplast DNA trnL-F were anlysised using molecular technology. The results showed that: The samples
researched can be divided into 7 genotypes, and 37 variable sites exist. High level genetic diversity exist in R. meyeri
Maxim. samples (h=0.551 7), and haplotype diversity level is from 0.416 7 to 0.733 3; nucleotide diversity level
ranges from 0.000 930 0 to 0.014 20; genetic differentiation (Gst) is 0.020 00; gene flow (Nm) is 0.057 72.
Keywords Ribes meyeri Maxim., cpDNA trnL-trnF, Genetic diversity
基金项目：本研究由国家林业公益性行业科研专项(201304812)资助
茶藨子属植物在《晶珠本草》中记载：甘、微寒、
滋补止泻，有敛毒、除黄水之效，并能收敛各种脉管
病。茶藨子与树莓、蓝莓、山葡萄、沙棘等尚未开发的
野生山果一起并称为第三代水果，因其高营养、保健
功效强、风味天然、无污染等优势越来越受到国内外
市场的重视(周志文, 2009)。茶藨属植物分布很广，在
全世界约有 160多个种(陆玲娣, 1995)。中国有 59种，
30个变种，青海省有 11种，1个变种(李耀阶, 1987,
青海人民出版社, pp.223-237)。
五裂茶藨子(Ribes meyeriMaxim.)隶属于虎耳草
科(Saxifragaceae)茶藨子属(Ribes)，落叶，稀常绿或半
常绿灌木(张晶晶等, 2013)。其在青海主要分布在乐
都、互助、大通等地平均海拔 3 500 m以下的山坡林
下、溪流两岸，总资源量有 3 376 hm2 (杨秀玲, 2011)。
茶藨属植物属浆果资源，被称为第三代新型果树(修
荆昌等, 2002)。
植物叶绿体 DNA在非编码区拥有比较高的核
苷酸置换率(Taberlet et al., 1991)，使其存在相对较高
的遗传变异(Allnot et al., 1999)，被广泛运用于植物遗
传多样性研究。本文采用叶绿体通用引物 trnL-trnF
对青海不同地理居群五裂茶藨子的叶绿体 DNA
trnL-trnF序列进行了研究，旨在评价五裂茶藨子居
群的遗传多样性和居群遗传结构，为青海该植物的
科学分类提供分子基础，为青海五裂茶藨子优良种
基因组学与应用生物学，2014年，第 33卷，第 6期，第 1319-1323页
Genomics and Applied Biology, 2014, Vol.33, No.6, 1319-1323
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
质资源筛选和规范化种植提供科学依据。
1结果与分析
1.1 DNA提取结果
CTAB法提取 DNA结果见图 1。由图 1可以看
出，所提取的 DNA完整，说明 CTAB法用于提取五
裂茶藨子总 DNA是合适的，提取的 DNA可用于后
续的 PCR扩增。
1.2 PCR扩增结果
用通用引物 trnL-trnF 对 CTAB 法提取的五裂
茶藨子总 DNA进行扩增，扩增结果见图 2。
1.3序列变异分析
对青海不同地理居群五裂茶藨子植物样品的
cpDNA trnL-trnF非编码区片段进行测序，比对后其
序列长度为 901~907 bp。所测序列中碱基频率存在
明显偏差，其中 A含量最高，G含量最低，(A+T)含量
为 63.5%，明显高于相应的(G+C)含量，共得到 7种
不同的单倍型，通过对所得到的 7种单倍型间进行序
列比对，共检测到变异位点 37个(表 1)，其中包括碱基
替换 15处和插入 /缺失 22处，15处替换中有 7处是
1个碱基替换，分别位于：143 bp (AG)、492 bp (AC)、
图 1五裂茶藨子总 DNA提取结果
Figure 1 DNA extraction results of Ribes meyeri Maxim.
图 2五裂茶藨子 DNA扩增结果
Figure 2 DNA amplification results of Ribes meyeriMaxim.
566 bp (AG)、676 bp (AC)、824 bp (AG)、847 bp (AG)、
890 bp (GT)；有 8处存在 1个碱基替换，分别位于：
270 bp (AG)、580 bp (CT)、652 bp (CT)、673 bp (AG)、
731 bp (CT)、787 bp (AC)、836 bp (AC)、871 bp (AG)；
22处插入 /缺失分别位于：6 bp、13 bp、124 bp、125 bp、
126 bp、127 bp、128 bp、129 bp、138 bp、139 bp、140 bp、
141 bp、142 bp、221 bp、222 bp、223 bp、224 bp、225 bp、
226 bp、227 bp、423 bp、846 bp。
1.4遗传分化分析
运用TCS1.2软件构建 cpDNA trnL-trnF的单倍
型网络图，并用 PAUP 4.0b10软件构建了单倍型的亲
缘关系图。利用MAGA6构建系统进化树，采用的算
法、可信度评估方法分别为MP算法、自举法(Boot
strap)，Bootstrap 重复取样次数为 1 000 (图 3)，CI=
0.86，RI=0.806。
从图 3可以看出，位于分支外部的古老单倍型 H7
仅分布在青海五裂茶藨子的 ZDJW2居群中，分布范
围最窄、出现频率较低；单倍型 H1在 ZDJW1、ZDJW2、
ZDJW3和 ZDJW4四个居群中均有分布，分布范围
最广，出现频率最高。
遗传多样性的分析结果(表 2)表明，总的种群遗
传多样性为 0.551 7，青海不同地理居群五裂茶藨子
的单倍型中 ZDJW1 的单倍型多态性最高，ZDJW3
的单倍型多态性最低，分别为 0.733 3和 0.416 7；而
ZDJW2的核苷酸多态性水平最高，ZDJW4的核苷酸
图 3基于叶绿体 DNA trnL-trnF序列得到的亲缘关系和单倍
型网络图
Figure 3 Relationship and haplotype network basis of the cpDNA
trnL-trnF intergenic fragments
1320
青海五裂茶藨子叶绿体 DNA trnL-F序列的遗传变异研究
Genetic Differentiation Study of Chloroplast DNA trnL-F in Ribes meyeri Maxim. from Qinghai 1321
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
多态性水平最低，分别为 0.014 20和 0.000 930 0。基
因流为 0.057 72，居群遗传分化系数为 0.020 00，说明
总的遗传变异主要存在于居群内，青海不同地理居群
五裂茶藨子间交流较少，居群间的遗传分化较大。
2讨论
通过对不同植物居群的遗传多样性进行分析，
得到植物 cpDNA平均遗传多样性为 0.67 (Petit et al.,
2005)。当居群间的基因流小于 1时，说明居群发生
遗传分化的主要原因是有限的基因流。本文对青海
省不同地理居群 30 个五裂茶藨子样本进行了
trnL-trnF序列分析，发现不同居群五裂茶藨的单倍
型多态性水平为 0.551 7，基因流为 0.057 72，基因交
流程度较低，居群之间的遗传变异较大。这可能由青
海不同地理居群五裂茶藨子的繁育系统决定的，青
海不同地理居群五裂茶藨子为落叶，稀常绿或半常
绿灌木，生长于平均海拔 3 500 m以下的山坡林下、
溪流两岸。
本文研究表明：青海不同居群五裂茶藨子的遗
传多样性较高，且其遗传变异主要发生在居群内；
cpDNA trnL-trnF序列分析结果可用于青海不同地理
居群五裂茶藨子的遗传多样性评价。青海不同地理
居群五裂茶藨子拥有比较高的遗传多样性，能够保
证茶藨子药材品质优良，应及时加以保护，但五裂茶
藨子的繁育特性不利于保持其优良品种，应加大茶
藨子营养繁殖的研究。
建议：从分布于青海的野生五裂茶藨子中选育
用于种植的优良居群和个体，通过规范化种植筛选
获得更多的优质茶藨子，在保护好野生茶藨子资源
的基础上，为大规模种植提供优质种源。
表 2遗传多样性指数与单倍型
Table 2 Indexes of genetic diversity and haplotype distribution
居群编号
No. of
populations
ZDJW1
ZDJW2
ZDJW3
ZDJW4
总和
Total
单倍型在不同居群中的分布
Distribution of haplotypes in different populations
n
6
6
9
9
H1
3
4
7
6
H2
0
0
0
1
H3
1
0
0
0
H4
0
0
1
0
H5
0
0
0
2
H6
2
0
1
0
H7
0
2
0
0
H
3
2
3
3
h
0.733 3
0.533 3
0.416 7
0.555 6
0.551 7
p
0.013 330 0
0.014 200 0
0.005 640 0
0.000 930 0
0.003 770 0
注: n:序列数; H:单倍型数; h:单倍型多态性; p:核苷酸多态性
Note: n: Number of sequence; H: Number of haplotypes; h: Hap-
lotype diversity; p: Nucleotide diversity
3材料与方法
3.1实验材料采集
采集青海大通、互助和乐都等地区的茶藨子植物
幼嫩叶片(表 3)，采集后立刻放入变色硅胶中快速干
燥，用于基因组 DNA的提取，由青海大学医学院马明
呈教授鉴定为五裂茶藨子(Ribes meyeri Maxim.)。
表 3五裂茶藨子采样信息
Table 3 The samples information of Ribes meyeri Maxim.
居群编号
No. of populations
ZDJW1
ZDJW2
ZDJW3
ZDJW4
采集个体数
No. of samples
6
6
9
9
采集地
Location
青海乐都上北山林场
Forest farm of Shangbeishan,
Ledu, Qinghai
青海互助黑龙沟
Heilonggou, Huzhu, Qinghai
青海互助浪士当
Langshidang, Huzhu, Qinghai
青海大通宝库
Baoku, Datong, Qinghai
3.2 DNA的提取和质量检测
DNA的提取是进行后续试验的基础，高质量的
基因组 DNA提取物是后续实验的保障。本试验采用
改进的 CTBA法提取总 DNA (张得钧等, 2008)。取
提取的基因组 DNA 4 滋L，加入 2 滋L的溴酚蓝指示
剂，配制浓度为 1%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)；在
DYY25型双稳电泳仪下，使用 110 V左右的恒定电
压电泳 30 min；其电泳缓冲液是 pH 为 8.0 的 1伊
TAE；电泳结束后于 Bio-RAD凝胶成像系统上观察
并照相，以检测成功率。
3.3 PCR优化反应体系的建立
根据相关文献(段义忠等, 2010)确定采用通用引
物“trnL”(5-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3)和
“trnF”(5-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3)扩增叶
绿体DNA序列，优化后的 PCR反应总体系为 25 滋L，
内含 2.5 滋L 10伊PCR Buffer，0.2 滋L 2.5 mmol/L Dntp
(含 Mg2+)，正反引物各 1 滋L，0.2 mL (5 U) Taq DNA
聚合酶，0.5 mL DNA模板和 19.6 滋L三蒸水。
3.4 PCR反应条件
PCR扩增的反应程序为：94℃ 4 min，94℃ 50 s，
58℃ 50 s，72℃ 50 s，35个 cycles，末次循环在 72℃
7 min，4℃保存。所有 PCR扩增反应均在美国生产的
1322
ALS1296型 PCR扩增仪上进行。扩增反应结束后，
将 PCR产物在含有溴化乙锭(EB)的 1%的琼脂凝胶
中电泳分离，以 110 V的恒定电压电泳 30 min。电泳
结束后，在紫外分析仪上观察扩增条带。之后将 PCR
扩增产物送北京三博远志生物技术有限责任公司测
序部进行双向测序。
3.5数据分析
所测得的 DNA序列(GenBank登陆号: KM5758-
34-KM575840)。对位排列应用 CLUSTAL X软件进
行，同时进行必要的人工校正。利用 MEGA5.0软件
计算(A+T)和(G+C)含量(Kumar et al., 2004)。采用
DnaSP5.0统计单倍型和变异位点(Rozas et al., 2003)，
计算单倍型多态性(h)、核苷酸多样性(p)、居群间的
平均基因流(Nm)和居群间遗传分化系数(Gst)。应用
TCS1.2构造其单倍型网络图(Clement et al., 2000)，
同时推测单倍型的亲缘关系，应用 PAUP*4.0b10构
建单倍型的最大简约树。
作者贡献
元王涛全程参与试验过程，完成数据整理和分
析并撰写全文；张得钧参与采样、实验设计，指导和
参与部分试验工作并修改论文；马明呈采样。
致谢
本研究由国家林业公益性行业科研专项《青藏高
原野生五裂茶藨子繁育及藏药成分研究》(201304812)
资助。
参考文献
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