全 文 ：　收稿日期　1998-03-13　修改稿收到日期　1998-09-18
＊世行贷款造林项目“桉树速生丰产培育技术与推广”(1996～ 2000)和广东省桉树发展工程项目“桉树杂交育种的研究”(1996 ～
2000)
　第一作者简介:甘四明 ,男 ,中国林业科学研究院热带林业研究所助理研究员 ,南京林业大学遗传育种专业博士研究生。
尾叶桉和细叶桉无性系的 RAPD指纹图谱构建＊
甘四明　施季森　　　　　
(南京林业大学林木遗传和基因工程实验室　210037　南京)　　　　　　　　
白嘉雨　徐建民　　　　　
(中国林业科学研究院热带林业研究所)　　　　　　　　
摘　要　利用 RAPD分子标记技术对来自 9个起源地点的尾叶桉(Eucalyptus urophl la S.T .
Blake)和细叶桉(E .teret icornis Smith)共22个无性系的研究表明 ,13个引物共扩增出 110个
位点 ,多态性位点 91个 ,在起源地点间差异显著的多态性位点 25个 ,各无性系有其特异的
RAPD扩增谱带 。利用多态性位点的数据矩阵 ,计算了各无性系间的遗传距离 ,并构建了无性
系间的遗传关系聚类图。
关键词　尾叶桉;细叶桉;RAPD;指纹图谱
中图分类号　S722.3
RAPD Fingerprints of Clones of Eucalyptus urophylla
S.T.Blake and E.tereticornis Smith
Gan Siming　Shi Jisen
(Laboratory of Forest Genetics and Gene Engineering Nanjing Forestry University　Nanjing　210037)
Bai Jiayu　Xu Jianmin
(Research Institute of T ropical Forestry CAF)
Abstract　Fingerprints of 13 clones of 5 origins of Eucalyptus urophy lla S.T .Blake and 9 clones of 4 ori-
gins of E.tereticornis Smith were const ructed w ith RAPD markers.The 13 primers screened could result
in 110 loci , of w hich 91 loci w ere polymorphic and 25 w ere different at 0.10 significance level among the o-
rigins.The genetic distances betw een clones were calculated , on the basis of w hich a dendrogram was es-
tablished.The construction of such fingerprints could be of very importance for identification of clone , clar-
ification of genetic relationship between clones and selection of parental combination in hybridizat ion of the
tw o species.
Key words　Eucalyptus urophy lla S.T .Blake;Eucalyptus tereticornis Smith;RAPD;Fingerprint
—11—
第 23 卷第 1 期
1999年 1月
南　京　林　业　大　学　学　报
Journal o f Nanjing Forestry University
Vol.23 No.1
Jan.1999
　　指纹图谱(Fingerprint)是鉴别品种 、品系和无性系(包括杂交亲本和自交系)的有力工具[ 1] 。90年
代以前 ,指纹图谱构建主要是同工酶方法 ,而目前则主要是 DNA水平的分子标记技术。随机扩增多态
性 DNA(Random amplified polymorphic DNA , RAPD)是 1990年发展起来的一种较好的构建指纹图谱
的分子标记技术[ 2 ,3] ,具有快速 、简便和高效等优点 ,已被有效用于杨树(Populus spp.L.)无性系[ 4] 、蓝
桉(Eucalyptus globulus Labill.)谱系[ 5] 、玉米(Zea mays L.)近交系[ 6]和油菜(Brassica spp .L.)杂种[ 7]
等的指纹图谱研究。
尾叶桉主要原产于印度尼西亚 ,细叶桉主要原产于澳大利亚 ,其均为重要的速生优良纸浆材树种 ,
在我国乃至全球热带和亚热带地区广为种植 。并且 ,两树种杂交能产生较强的杂种优势[ 8] 。对这两个
树种的无性系进行 RAPD指纹图谱构建 ,可以阐明各无性系在分子水平上的遗传变异 ,探讨无性系间
的遗传关系 ,这对无性系选育和杂交亲本选配具有重要意义 。
1　材料和方法
1.1　研究材料
来自 9个起源地点的尾叶桉和细叶桉共 22个无性系(9年生)(表 1)。各无性系为采自天然林的种
子(澳大利亚 CSIRO林木种子中心提供)育苗长成 ,种植于中国林科院热带林业研究所的桉树基因收集
圃内 。各无性系采新鲜嫩叶 1 g 左右用于 DNA提取 。
表 1　参试的尾叶桉和细叶桉无性系
Table 1　Twenty-two clones of E.urophylla and E.tereticornis employed in this study
树种 无性系序号 种子编号 起源地点
起源地点概况
纬度 经度 海拔/m
尾叶桉
01～ 03
04～ 06
07～ 09
10～ 12
13
14531
14532
12895
14534
12897
印尼 Egon 山Ⅰ
印尼 Lew otobi 山
印尼 Mandiri山
印尼 Egon 山Ⅱ
印尼 Wuko 山
8°38′
8°31′
8°15′
8°38′
8°33′
122°27′
122°45′
122°58′
122°27′
122°35′
515
398
415
500
830
细叶桉
14～ 17
18
19
20～ 22
13443
13418
13660
15825
澳大利亚 Kennedy 河
巴布亚新几内亚
澳大利亚 Helenvele
澳大利亚 Laura
15°46′
9°30′
15°45′
15°44′
145°24′
147°26′
145°14′
124°41′
120
580
120
140
1.2　随机引物 、DNA提取和 PCR方案
表 2　RAPD随机引物和扩增位点数
Table 2　Attributes of random oligonucleotide primers
used for generating RAPD loci from 22
eucalypt clones
引物名称 引物序列 N t N p N0.1
OPA-02 5 GAGGCCCTTC 3 8 6 1
OPG-03 5 GAGCCCTCCA 3 10 9 1
OPG-06 5 GTGCCTAACC 3 12 12 4
OPG-07 5 GAACCTGCGG 3 7 4 1
OPG-09 5 CTGACGTCAC 3 9 8 2
OPG-15 5 ACTGGGACTC 3 6 6 1
OPQ-05 5 CCGCGTCT TG 3 9 8 1
OPQ-07 5 CCCCGATGGT 3 13 11 6
OPY-01 5 GTGGCATCTC 3 7 3 1
OPY-09 5 AGCAGCGCAC 3 9 8 2
OPY-15 5 AGTCGCCCTT 3 8 6 3
OPY-17 5 GACGTGGTGA 3 5 3 1
OPY-18 5 GTGGAGTCAG 3 7 7 1
总计 13 110 91 25
　　　　　注:N t:扩增总位点数;N p:多态性位点数;N 0.1为
χ2 检验中起源地点间达 0.1显著差异的位点数
初筛 Operon公司生产的 OPA 、OPG 、OPQ和
OPY共 80个引物 , 筛选出正式扩增引物 13 个
(表 2)。
DNA提取参考 Doy le 和 Doy le (1990)的方
法[ 9] 。
PCR扩增仪为 Perkin -Elmer 2400 , 采用
15μL体系:10倍反应缓冲液 1.5μL(100 mmol/L
pH8.3 Tris-HCl , 500 mmol氯化钾 ,20 mmol/L
氯化镁 ,0.01%明胶 ,5 g/LBSA), Taq聚合酶 1单
位 ,dATP 、dTTP , dCTP 和 dGTP 各 250μmol/L ,
引物 5 pmol/ L ,DNA模板 20 ng 左右。扩增程序
为:94℃预变性 1 min;再 40个循环:94 ℃时 30 s ,
48 ℃时 30 s 和 72 ℃时 2 min;最后 72 ℃延伸
7min 。扩增产物用含有溴化乙锭的1.0%琼脂糖
凝胶在 0.5×TBE 缓冲液中电泳分离 ,最后在紫
外灯下用 Polaroid摄像系统照像记录结果。
—12—
　　　　　　　　　 　　南　京　林　业　大　学　学　报 　　　　　　　　　　　　　　　第 23 卷　第 1 期
1.3　统计分析
RAPD扩增谱带用1代表有 ,用0代表无 ,进行统计 。用 SAS软件对位点在起源地点间的差异显著
性进行 χ2 检验[ 10] 。利用统计的多态性位点和原始数据矩阵 ,参考 Nei(1978)的方法[ 11]计算无性系间
的遗传距离 ,再用 UPGMA算法[ 12]建立聚类图 。
2　结果与分析
2.1　RAPD扩增结果
13个引物共扩增出 110个位点 ,其中多态性位点 91个 ,25个位点在起源地点间的差异达 0.1显著
水平(表 2)。各无性系有其特异性的 RAPD扩增谱带 。图 1 显示了引物 OPQ -07 扩增出的无性系
RAPD谱带 。
图 1　引物 OPQ-07 扩增的无性系 RAPD谱带
F ig.1　RAPD fragments of 22 clones amplified with primer OPQ-07
(箭头所示为多态性谱带, M 为 DNA 长度标定的 Marker)
表 3　无性系间的遗传距离
Table 3　Genetic distances between the 22 clones tested
无性系 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 无性系
01 - 0.400 0 0.873 3 0.704 2 0.6822 0.503 5 0.749 7 0.682 2 0.660 7 0.521 9 0.822 0 12
02 0.485 5 - 0.873 3 0.704 2 0.6822 0.749 7 0.749 7 0.822 0 0.899 9 0.726 7 0.822 0 13
03 0.521 9 0.503 5 - 0.416 5 0.5406 0.450 4 0.559 6 0.540 6 0.639 7 0.503 5 0.400 0 14
04 0.485 5 0.467 8 0.467 8 - 0.5596 0.540 6 0.619 0 0.416 5 0.540 6 0.598 8 0.521 9 15
05 0.579 0 0.521 9 0.521 9 0.521 9 - 0.383 7 0.682 2 0.619 0 0.521 9 0.579 0 0.660 7 16
06 0.598 8 0.433 3 0.540 6 0.467 8 0.2624 - 0.540 6 0.416 5 0.503 5 0.485 5 0.598 8 17
07 0.822 0 0.433 3 0.467 8 0.433 3 0.4505 0.336 5 - 0.485 5 0.579 0 0.639 7 0.485 5 18
08 0.598 8 0.579 0 0.400 0 0.503 5 0.2914 0.306 2 0.336 5 - 0.450 4 0.847 3 0.619 0 19
09 0.559 6 0.503 5 0.503 5 0.433 3 0.4855 0.276 8 0.367 7 0.336 5 - 0.450 4 0.682 2 20
10 0.450 5 0.467 8 0.503 5 0.433 3 0.4504 0.503 5 0.579 0 0.503 5 0.433 3 - 0.433 3 21
11 0.540 6 0.559 6 0.485 5 0.450 4 0.6607 0.485 5 0.485 5 0.559 6 0.416 5 0.352 0 - 22
12 0.598 8 0.579 0 0.467 8 0.433 3 0.4165 0.336 5 0.400 0 0.467 8 0.306 2 0.540 6 0.352 0
13 0.639 7 0.704 2 0.540 6 0.433 3 0.6397 0.433 3 0.540 6 0.400 0 0.336 5 0.619 0 0.598 8
14 0.660 7 0.598 8 0.726 7 0.873 3 0.6607 0.822 0 0.726 7 0.773 2 0.927 3 0.639 7 0.704 2
15 0.726 7 0.749 7 0.797 3 0.847 3 0.5596 0.619 0 0.749 7 0.660 7 0.619 0 0.619 0 0.639 7
16 0.433 3 0.726 7 0.559 6 0.773 2 0.7497 0.773 2 0.726 7 0.598 8 0.598 8 0.450 4 0.467 8
17 0.598 8 0.704 2 0.660 7 0.955 5 0.6397 0.579 0 0.619 0 0.619 0 0.503 5 0.503 5 0.416 5
18 0.639 7 0.660 7 0.503 5 0.797 3 0.7267 0.699 9 0.647 3 0.704 2 0.704 2 0.540 6 0.682 2
19 0.660 7 0.773 2 0.822 0 0.927 3 0.7973 0.984 5 0.927 3 0.822 0 0.773 2 0.873 3 0.749 7
20 0.598 8 0.899 9 0.847 3 0.749 7 0.5988 0.660 7 0.749 7 0.704 2 0.503 5 0.579 0 0.726 7
21 0.579 0 0.639 7 0.726 7 0.598 8 0.5035 0.598 8 0.639 7 0.639 7 0.450 4 0.383 7 0.467 8
22 0.660 7 0.521 9 0.559 6 0.822 0 0.7042 0.773 2 0.726 7 0.773 2 0.639 7 0.521 9 0.619 0
无性系 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 无性系
　　　　　　注:短横线上 、下的行与列的无性系分别相对应
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　1999年　总第 79 期　　　　甘四明等:尾叶桉和细叶桉无性系的 RAPD指纹图谱构建
2.2　遗传距离和聚类分析
图 2　无性系间的遗传关系聚类图
Fig.2　UPGMA dendrogram based on the genetic
distances between the 22 eucalypt clones tested
无性系间的遗传距离见表 3。无性系间的遗传关
系聚类图见图 2。结果表明 ,在 0.58的遗传距离上 ,无
性系可分为 3组。第 1组全为尾叶桉无性系 ,第 2组包
括2个尾叶桉无性系和 3个细叶桉无性系 ,第 3组全为
细叶桉。虽然树种间的遗传距离聚类图与分类关系并
不严格一致 ,如第二组包括两个树种 ,但这组中无性系
不多 ,在杨树的研究中也有类似情况[ 4] ;并且 ,从无性系
起源来看 ,相同起源地点的无性系一般遗传距离较近 ,
如01与02 、05与06 、10与 11 、16与 17都是在第一水平
上聚为一类 。因此 ,利用 RAPD构建指纹图谱在一定程
度上可反映研究材料的分类和起源情况[ 4] 。
3　结论与讨论
(1)无性系 RAPD指纹图谱在一定程度上可反映
无性系的分类和起源 ,这对无性系鉴定和无性系遗传
关系探讨有重要的意义。
(2)本研究中的 03 、10 、13 、16 和 18 等无性系已
用作杂交亲本 ,且杂种优势明显[ 8] 。如果结合杂种大田表现来研究这些无性系间的遗传关系 ,可把构
建的 RAPD指纹图谱用于辅助选配杂交亲本 ,这也是进一步要做的工作 。
致　谢　中国林科院热带林业研究所吴坤明和吴菊英两位副研究员及李洪同志对样品采集 、南京林业大学育种教研组
易能君副教授对数据处理和研究生李梅对实验分析 , 给予了大力帮助 ,谨致谢意。
参　考　文　献
1　贾继增.分子标记资源和分子标记育种.中国农业科学 , 1996 , 29(4):1 ～ 10
2　Williams J G K , Kubelik A R, Livak K J , et al.DNA po lymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic
markers.Nucl.Acids Res., 1990 , 18:6531 ～ 6535
3　Caetano-Ano lles G , Bassam B J , Gresshoff P M.DNA amplification fingerprint using very short arbitrary oligonucleo tide
primers.Bio technology , 1991 , 9:553 ～ 557
4　Castig lione S , Wang G , Damiani G , et al.RAPD fingerprints for identification and taxonomic studies of elite poplar
(Populus spp .)clone.Theo r Appl Genet , 1997 , 97:54 ～ 59
5　Nesbitt K A , Potts B M , Vaillancourt R E , et al.Fingerprinting and pedigree analysis in Eucalyptus globulus using
RAPDs.Silv ae Genetica , 1997 , 46:6～ 11
6　Lanza L L B , Jr C L de Souza , Ottoboni L M M , et al.Genetic distance of inbred lines and prediction of maize single-
cross performance using RAPD markers.Theor Appl Genet , 1997 , 94:1023 ～ 1030.
7　Marshall P , Marchand M-C , Landry B S , et al.A single me thod to estimate the percentage o f hybridity in canola F1 hy-
brids.Theor Appl Genet , 1994 , 89:853 ～ 858
8　吴坤明 ,吴菊英 , 徐建民 ,等.桉树杂交种间杂种优势和优良杂种的评选.广东林业科技 , 1996 , 12(2):1 ～ 5
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12　Sokal R R and C D Michener.A statistical me thod for evalua ting sy stematic relationships.Univ.o f Kansas Sci Bulletin ,
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(责任编辑　郑琰炎炎)
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