全 文 ：①本文为国家科技重大专项重大课题(2008ZX08011-005)及重点课题
(2009ZX08011-004B)、国家自然科学基金项目(30771240)和广州市
教育系统科研创新学术团队(B94118)课题
②华南师范大学生命科学学院 ,广州 510631
③共同第一作者 ,华南师范大学生命科学学院 ,广州 510631
作者简介:林德球(1953年-),男 ,博士, 副教授 ,主要从事细胞生理
生化方面的研究 , E-mai l:bcdrben@yahoo.com.cn;
程江丽(1986年-),女 , 在读硕士 , 主要从事分子免疫学
方面的研究 , E-mai l:sxcjl860912@126.com;
通讯作者及指导教师:陶爱林(1968年-),男,博士 ,教授 ,主要从事分
子免疫学方面的研究 , E-mai l:AerobiologiaTao @
163.com。
doi:10.3969/ j.issn.1000-484X.2011.08.011
·免疫学技术与方法·
欧蓍草花粉主要过敏原 Par j 1的重组表达及鉴定①
林德球②　程江丽③　邹泽红　何　颖　陶爱林　(广州医学院第二附属医院 呼吸疾病国家重点实验室 变
态反庆研究室 过敏反应与临床免疫重点研究室 ,广州 510260)
　　中国图书分类号　R392.11　　文献标识码　A　　文章编号　1000-484X(2011)08-0726-05
[ 摘　要] 　目的:克隆 、表达和纯化欧蓍草花粉主要过敏原 Par j 1。方法:根据 Par j 1.0102 在GenBank中的序列号获得其
核苷酸和氨基酸序列 ,确定开放阅读框 , 采用 DNAstar软件优化密码子 , 合成全基因 , 并克隆到表达载体 pET-44a中 , 转化表达
宿主大肠杆菌 Rosetta , 优化蛋白表达条件并进行亲和层析纯化和Western blot鉴定。 结果:PCR扩增及重组质粒测序结果表明
成功地构建了 pET-44a+/ Par j 1.0102 原核表达质粒。对表达菌表达条件进行优化 ,最终确定在 30℃, IPTG 浓度为 1.0 mmol/
L , 诱导 4小时时蛋白表达量最高 ,重组蛋白经亲和层析纯化 , SDS-PAGE分析纯化产物在 23 kD处有明显的条带。Western blot
表明重组蛋白具有与 StrepII 标签抗体结合活性。结论:国内首次获得融合 StrepII标签的 Par j 1.0102重组蛋白 , 为欧蓍草花粉
过敏诊断及特异性免疫治疗奠定基础。
[ 关键词] 　欧蓍草;花粉过敏原;Par j 1.0102;密码子优化;克隆;表达;纯化
Cloning and expression of the Parietaria judaica pollen allergen Par j 1
LIN De-Qiu , CHENG Jiang-Li , ZOU Ze-Hong , HE Ying , TAO Ai-Lin.Academic Key Laboratory of Allergy &Clinical
Immunity , Allergological Research Branch of State Key Laboratory of Respiratory Disease , the Second Affiliated Hospital of
Guangzhou Medical University , Guangzhou 510260 , China
[ Abstract] 　Objective:To express and purify the Parietaria judaica pollen major allergen Par j 1.Methods:We obtained the nucleotide
and amino acid sequence according to the published allergen number(O04404)in the GenBank.Codons optimized by DNAstar software.The opti-
mized gene was synthesized and cloned into the expression vector pET-44a and transformed into E.coli Rosetta strain.Protein expression parame-
ters were optimized on inducer concentration of IPTG , expression temperature and induction time.Recombinant protein was purified by affinity
chromatography and identified by Western blot.Results:The recombinant plasmid pET-44a+/Par j 1.0102 was successfully constructed which
proved by PCR amplification and sequencing.Par j1.0102 protein was recombinantly expressed with StrepII tag under the best situation.Western
blot showed recombinant protein could specifically bind to the StrepII tag antibody.Conclusion:The Par j 1.0102 protein is correctly expressed
and the expressed protein could be used for diagnosis and immunotherapy of Parietaria judaica allergic patients with its allergenicity attenuated.
[ Key words] 　Parietaria judaica;Pollen allergen;Par j 1.0102;Codon optimization;Clone;Expression;Purification
　　花粉是一种通过空气传播的常见吸入性过敏
原。近几年 ,随着工业化城市的发展 ,花粉引起的过
敏反应已严重影响了人们的生活质量 ,并且随着全
球国际化的发展以及人们生活质量的提高 ,由花粉
引起的过敏反应已经严重困扰人们的正常生活 。欧
蓍草(Parietaria judaica)属被子植物门 ,木兰纲 ,荨麻
目 ,荨麻科 ,荨麻属植物 ,其花粉是原产于欧洲地中
海地区的主要变应原 ,可引起 95%的特应性人群产
生Ⅰ型超敏反应[ 1-3] 。欧蓍草花粉虽然是原产于欧
洲地中海地区的主要过敏原 ,但随着全球国际化的
发展 ,其花粉的全球性散播已经很普遍[ 4] ,而且该植
物在我国西北部已有广泛分布 ,由该花粉引起的过
敏反应已越来越受到研究者的重视。同时Par j 1和
Par j 2二者的 IgE 表位相似[ 5] ;该过敏原作为优先
·726· 中国免疫学杂志 2011年第 27卷
聚类的主要代表性过敏原已经进入我们的研究视
野[ 6] 。1981年Geraci D等报道欧蓍草花粉粗提液中
至少有9种不同的过敏原蛋白 ,其中 Par j 1和 Par j
2是最常见的两个过敏原[ 7] 。研究报道 Par j 1.0102
编码的过敏原蛋白属转脂蛋白(LTP),可引起病人
产生 Ⅰ型超敏反应 ,出现哮喘 、过敏性鼻炎等 I型超
敏反应症状[ 8] 。其二级结构由 4个螺旋组成 ,螺旋
间通过二硫键连接 ,形成非常稳定的疏水桶状结构 ,
可结合和容纳脂肪酸 ,磷脂等脂类物质[ 9] 。另外 ,水
果 、坚果 、种子及蔬菜等植物性食物中均有LTP蛋白
的存在 ,一般认为 ,LTP蛋白家族的共同结构是引起
临床交叉反应的基础 。我们通过将基因克隆到表达
载体 pET-44a中 ,转化大肠杆菌 Rosetta ,同时克服外
源基因在大肠杆菌中表达的困难 ,成功表达 Par j
1.0102蛋白 ,不仅为临床欧蓍草花粉过敏诊断及特
异性免疫治疗奠定基础 ,而且为研究 LTP 家族的交
叉反应奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　实验试剂　Par j 1.0102基因及引物由上海博
尚生物技术有限公司合成;pET-44a表达载体 、宿主
大肠杆菌 JM109 、Rosetta 由本实验室保存;大肠杆菌
TOP10和质粒 pUC57由上海博尚生物技术有限公司
提供;DNA合成和测序由上海博尚生物技术有限公
司完成;T4 DNA连接酶 、Taq聚合酶 、10×PCR buffer、
dNTP Mixture 、IPTG 及DL 2 000 DNA marker等购自广
州佰路生物科技有限公司;琼脂糖凝胶产物回收纯
化试剂盒购自 QIAGEN 公司;StrepTrapHP 预装柱购
自GE公司;StrepII标签抗体购于 Merck公司;PVDF
膜购于Millipore 公司;脱脂奶粉 、预染蛋白质分子量
标准购自 Bio-Rad公司。
1.2　方法
1.2.1　密码子优化　Par j 1.0102作为 Par j 1中的
一个重要亚型 ,在 GenBank中序列号为O04404。根
据大肠杆菌同义密码子的偏好性 ,采用在线软件
Codon Usage Database (http://www.kazusa1.or.jp/
codon/)对Par j 1.0102密码子进行优化[ 10] ,再根据
需要考虑其他因素进行手工调整 ,同时预测 mRNA
的结构。优化后的基因由上海博尚生物技术有限公
司合成 ,基因合成宿主为大肠杆菌 TOP10 ,装载于质
粒 pUC57中 。
1.2.2　引物设计　见表 1。
1.2.3　基因表达载体的构建　目的基因合成后装载
于载体 pUC57 ,并转化大肠杆菌 TOP10 ,得到阳性菌。
接种阳性克隆到含有 100 mg/L Amp的 LB液体培养
基(10 g/L 胰蛋白胨 、5 g/L 酵母提取物 、10 g/L NaCl)
中过夜培养 ,提取质粒 ,用 NdeⅠ和 XhoⅠ双酶切获得目
标片段和 pET-44a 线性质粒 ,在 4℃下进行连接反应
16小时。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞
JM109 ,通过 Amp 抗性 LB 平板筛选[ 11] ,菌落 PCR鉴
别阳性克隆 ,取样送上海博尚生物有限公司测序。经
序列比对后 ,选取测序正确的质粒 ,转化高效宿主表
达菌 Rosetta 形成表达菌。菌落 PCR 扩增程序为:
95℃预变性 5分钟;95℃变性 30秒 ,70℃复性 30秒 ,
72℃延伸 ,30秒 ,扩增30个循环;72℃延伸 5分钟。
1.3　重组蛋白 Par j 1.0102的表达 、纯化 、Western
blot及氨基酸测序鉴定
1.3.1　重组蛋白 Par j 1.0102的表达与纯化　表达
菌的阳性克隆接种于 LB液体培养基中 ,37℃振荡培
养过夜后 ,接种到新鲜的LB液体培养基中培养 3小
时 ,然后加入不同浓度的 IPTG(终浓度分别为 0.2 、
0.5 、0.8和 1.0 mmol/L),在 20℃、25℃、30℃和 37℃
等不同温度下诱导表达目的蛋白 ,同时在诱导后 2 、
3 、4 、5小时等时间点收取表达菌液 ,以获得最佳的
诱导表达参数 。取 1.5 ml菌液 9 700 r/min 离心 2
分钟收集菌体 ,加入 100 μl的上样缓冲液充分混合 ,
煮沸破菌并离心后进行 SDS-PAGE 电泳检测表达结
果 。对表达菌进行扩大培养 ,超声破碎菌液并收集
破碎上清和沉淀 ,沉淀用含 6 mol/L 尿素的缓冲液
裂解 ,利用 AKTA-FPLC 系统 ,通过亲和层析纯化出
带有StrepII标签的蛋白 ,具体步骤按照 StrepTrapHP
预装柱的使用说明书进行。
1.3.2　重组蛋白 Par j 1.0102的Western blot分析　
纯化蛋白经 12%的 SDS-PAGE电泳后 ,将凝胶上的
蛋白电转移至 PVDF 膜上 ,用含 50 g/L 脱脂奶粉的
PBST缓冲液(8 g/L NaCl , 0.28 g/L KCl , 0.28 g/L
KH2PO4 ,2.98 g/L Na2HPO4·12H2O , pH7.4 , 1 ml/L
Tween 20)室温封闭 2小时后 , 加入已偶联 HRP 的
StrepII标签抗体(1∶4 000 稀释), 4℃孵育过夜;用
PBST室温下脱色摇床上洗 3次 ,每次 5 分钟;再用
PBS洗 2次 ,每次 5分钟;用二氨基联苯胺(DAB)底
物液显色 ,检测目的蛋白。
1.3.3　重组蛋白 Par j 1.0102的氨基酸序列测定　
纯化蛋白Par j 1.0102 SDS-PAGE电泳后 ,经CAPS转
表 1　引物设计
Fig.1　Primer design
Primer name Primer sequence(5′-3′) Size(bp)
Forward CATATGCGTACCGTTAGCGCGC 22
Reverse CTCGAGTTATTACTTTTCGAACTGCGGGT 29
Note:The underlines are restriction enzyme site:CATATG NdeⅠ, CTCGAG XhoⅠ.
·727·林德球等　欧蓍草花粉主要过敏原 Par j 1的重组表达及鉴定　第 8期
移缓冲液将凝胶上的蛋白质电转移至 PVDF 膜上 ,
用去离子水漂洗 PVDF 膜数次 ,考马斯亮蓝染色 40
秒 ,用甲醇乙酸溶液及去离子水充分洗涤 ,待膜干燥
后剪下目的条带 ,送上海中科新生命生物科技有限
公司测序 。
2　结果
2.1　密码子优化　优化后的密码子 ,在基因的 C端
加上由 8个氨基酸组成的 StrepII 标签 ,并且在起始
和StrepII标签后分别加上NdeⅠ和Xho Ⅰ酶切位点 ,
合成的基因总共编码 186个氨基酸 ,558 bp。
2.2　重组表达载体构建　基因合成菌经 Amp抗性
平板筛选及菌落PCR鉴定后 ,接种阳性克隆培养提
图 1　Pj 1.0102 基因表达载体的构建
Fig.1　Construction of Pj 1.0102 gene expression vector
Note:A.Double rest riction with Nde Ⅰ and Xho Ⅰ for systhesized gene in
pUC57 vector;Lane 1.pUC57-Pj 1.0102;Lane 2.pUC57-Pj 1.0102/
Nde Ⅰ +Xho Ⅰ ;M.DNA marker;B.Double restriction with Nde Ⅰ
and Xho Ⅰ for pET-44a vector;Lane 1.pET-44a vector/Nde Ⅰ +Xho
Ⅰ ;Lane 2.pET-44a vector;M.DNA marker.
质粒。对质粒 pUC57-Pj 1.0102进行 Nde Ⅰ和 Xho Ⅰ
双酶切后 ,如图 1A所示 ,在 500 bp以上有一明显条
带 ,与 558 bp的目的片段大小相符。由图 1B可见 ,
对实验室保存的载体 pET-44a进行 Nde Ⅰ和 Xho Ⅰ
双酶切后得到大小在 2 000 bp以上的线性载体 。回
收目的片段与线性载体进行酶连 。
2.3 　重组质粒及目的基因的鉴定 　将带有 Pj
1.0102基因的重组质粒pET-44a-Pj 1.0102转化至高
效表达宿主菌 Rosetta 后 ,对其进行菌落 PCR鉴定 ,
从图2可看出在约558 bp处有与目的基因大小一致
的 PCR产物 ,鉴定为阳性克隆。
2.4　重组蛋白 Pj 1.0102的表达 、纯化 、Western blot
及氨基酸测序鉴定
2.4.1　重组Pj 1.0102蛋白的表达　将测序正确的
重组质粒转入大肠杆菌 Rosetta ,表达产物经 12%的
SDS-PAGE分析大小约为 23 kD ,对其表达温度 ,时间
及诱导浓度进行优化 ,最终确定在30℃下加入终浓
图 2　Rosetta-pET44a-Pj 1.0102 菌落 PCR
Fig.2　PCR amplification of the Pj 1.0102 gene
Note:M.Marker;Lane 1.Negative control;Lanes 2-5.Positive clones.
图 3　对重组蛋白 Pj 1.0102温度 , 时间和诱导浓度的优化
Fig.3　Protein expression were optimized on expression temperature , IPTG concentration and induction duration
Note:A.Optimization on expression temperature.Lane M.Protein marker;Lane 1.37℃;Lane 2.30℃;Lane 3.25℃;Lane 4.20℃;Lane 5.Negative control;B.
Optimizat ion on IPTG and induction time.Lane 1.IPTG concentration with 1.0 mmol/L;Lane 2.0.8 mmol/L;Lane 3.0.5 mmol/L;Lane 4.0.2 mmol/L;
Lane 5.Protein marker;Lane 6.Negat ive control;Lanes 7-10.Induced duration for 2 h ,3 h ,4 h ,5 h.
·728· 中国免疫学杂志 2011年第 27卷
度为 1.0 mmol/L 的 IPTG ,诱导 4小时 ,蛋白表达量
最高(图 3A , B)。
2.4.2　重组 Pj 1.0102蛋白的纯化　因目的蛋白在
C端加有 StrepII 标签的特性 ,用亲和层析的方法采
用AKTA-FPLC系统纯化重组蛋白 Pj 1.0102。超声
破碎后的上清和沉淀经 12%SDS-PAGE 电泳检测 ,
重组蛋白在上清和包涵体中均有表达 ,说明重组蛋
白既有可溶性表达也有包涵体形式表达 ,分别进行
亲和层析纯化 ,经SDS-PAGE鉴定结果显示在23 kD
图 4　重组 Pj1.0102蛋白的纯化
Fig.4　Purification of recombinant protein Pj 1.0102
Note:Lane 1.Negative control;Lane 2.Expression of recombinant Pj 1.0102
protein;Lane 3.Supernatant of recombinant Pj 1.0102 protein by soni-
cation;Lane 4.Precipitation of recombinant Pj 1.0102 protein by soni-
cation;Lane 5.Purified Pj 1.0102 recombinant protein of supernatant;
Lane 6.Purified Pj 1.0102 recombinant of precipitation.
处均得到较纯的目的蛋白(图 4)。
2.4.3　重组蛋白Pj 1.0102的Western blot分析　根
据重组蛋白带有 StrepII 标签这一特点 ,利用 StrepII
标签的单克隆抗体对表达蛋白进行Western blot鉴
定 ,结果显示 ,在 23 kD处有一明显的条带(图 5),表
明表达出来的蛋白为目的蛋白。
2.4.4　重组蛋白 Pj 1.0102的氨基酸序列测定　蛋
白质氨基酸 N 端测序 ,其前 15 个氨基酸序列为
MRTVSAPSAVALVVI(图 6列出了 N端 1 ～ 6个氨基
酸的测序图),与融合蛋白 Pj 1.0102的氨基酸序列
比对完全相同 , 这说明表达的融合蛋白为 Pj
1.0102。
图 5　重组 Pj 1.0102 蛋白的Western blot鉴定
Fig.5 　 Identification of recombinant protein Pj 1.0102 by
Western blot analysis
Note:Lane 1.Pj 1.0102 protein;Lane M.Protein marker.
图 6　Pj 1.0102 融合蛋白的 N 端 1～ 6个氨基酸序列测序图
Fig.6　Result of N-terminal amino acid sequencing of protein Pj 1.0102
·729·林德球等　欧蓍草花粉主要过敏原 Par j 1的重组表达及鉴定　第 8期
3　讨论
欧蓍草花粉是原产于欧洲地中海地区的主要过
敏原 ,由该花粉引起的过敏反应病人约有 1 亿人
群[ 8] ,早在 1998年就有研究报道指出 ,这种花粉已
不仅仅局限于地中海地区 ,已在欧洲中部和东部的
温带气候区 ,澳大利亚和加利福尼亚等地区广泛分
布[ 11] ,随着全球气候的不断升高及工业化的发展 ,
花粉种子的全球性散播速度不断加快 ,其分布地区
也越来越普遍 ,欧蓍草在我国西北部已广泛分布 ,我
们要做好预防该花粉引起的过敏反应的充足准备 。
国外研究报道欧蓍草花粉粗提液能够引起人微血管
内皮细胞 E-选择素 ,VCAM-1(血管细胞粘附分子 1),
IL-8等介质产生 ,能够直接影响调节炎症反应关键
功能的内皮细胞 ,其花粉蛋白对肺微血管内皮细胞
的刺激 ,可以引起细胞形态学的修饰 ,肌动蛋白细胞
支架的变化 ,同时增加细胞内皮细胞的通透性[ 12] 。
可见对该花粉从细胞学角度阐明参与炎症反应的介
质 ,开发药物选择性阻断一些炎症介质的产生也是
治疗该过敏反应的一条有效途径。Par j 1和 Par j 2
是该花粉中的两个主要过敏原 ,而 Par j 1.0101 、Par j
1.0102 、Par j 1.0201是Par j 1的同种形(isoform),序
列比对显示前二者的序列同源性为98%,而Par j 1.
0201和 Par j 1.0101 之间的同源性为 89%, 通过
MEGA3.1和 CLUSTALX1.83 软件对 Par j的亚型进
行聚类分析 ,Par j 1.0102是优先聚类的主要代表性
过敏原 ,Par j 1.0101作为 Par j 1的一个主要亚型 ,
国外研究较多 ,Par j 1.0102作为其中的一个主要过
敏原 ,国内外研究较少 ,基于它们序列的高度同源
性 ,我们拟对 Par j 1.0102进行深入研究 ,首先对 Par
j 1.0102进行原核表达 ,但是外源基因在大肠杆菌
中表达也存在困难。密码子优化成为近些年来避免
异源基因表达困难所考虑的因素 ,对密码子进行优
化 ,从密码子使用偏好性 ,mRNA 的二级结构 ,GC 含
量等因素对密码子进行优化[ 13 , 14] 。之后分别从诱
导浓度 ,温度及诱导时间 3方面对蛋白表达量进行
优化 ,最终确定在 30℃下加入终浓度为 1.0 mmol/L
的 IPTG ,诱导 4小时 ,蛋白表达量最高 。我们首次
在国内获得该蛋白 ,并纯化出高纯度的蛋白 ,将为临
床上应用该疫苗奠定基础 。国内此前尚未见该花粉
的研究报道 ,基于该花粉引起的过敏反应人群的比
例越来越大 ,我们的后续实验可通过分析该过敏原
的抗原表位[ 15] ,并进行相应的低过敏原性改造 ,为
低过敏性蛋白疫苗的生产奠定基础[ 16] 。
4　参考文献
1　Duro G , Colombo P , Assunta Costa M et al.Isolation and characterization
of two cDNA clones coding for isoforms of the Parietaria judaica major al-
lergen Par j 1.0101[ J] .Int Arch Allergy Immunol , 1997;112(4):348-
355.
2　Barranca M , Fontana S , Taverna S et al.Proteomic analysis of Parietaria
judaica pollen and allergen profi ling by an immunoproteomic approach
[ J] .Biotechnol Lett , 2009;32(4):565-570.
3　Bonura A , Amoroso S , Locorotondo G et al.Hypoallergenic variants of the
Parietaria judaica major al lergen Par j 1:a member of the non-specific
lipid transfer protein plant fami ly[ J] .Int Arch Allergy Immunol , 2001;
126(1):32-40.
4　Jato V , Rodriguez-Rajo F J , Gonzalez-Parrado Z et al.Detection of air-
borne Par j 1 and Par j 2 allergens in relation to Urticaceae pollen counts
in different bioclimatic areas[ J] .AnnAllergy Asthma Immunol , 2010;105
(1):50-56.
5　Asturias J A ,Gomez-Bayon N , Eseverri J L et al.Par j 1 and Par j 2 , the
major allergens from Parietaria judaica pol len, have similar immunoglobu-
lin E epitopes[ J] .Clin Exp Allergy , 2003;33(4):518-524.
6　陶爱林 ,邹泽红 ,赖　荷 et al.主要过敏原的物种分布及逐步聚
类分析[ J] .中华微生物学和免疫学杂志 , 2007;27(5):451-456.
7　Gonzalez-Rioja R , Asturias J A ,Martinez A et al.Par j 1 and Par j 2 , the
two major allergens in Parietaria judaica , bind preferentially to monoacy-
lated negative lipids[ J] .FEBS J , 2009;276(6):1762-1775.
8　Colombo P , Bonura A , Costa M et al.The allergens of Parietaria[ J] .Int
Arch Allergy Immunol ,2003;130(3):173-179.
9　Salcedo G , Sanchez Monge R , Diaz Perales A et al.Plant non-specific
lipid transfer proteins as food and pollen allergens[ J] .Clinical &Experi-
mental Allergy , 2004;34(9):1336-1341.
10　Nakamura Y , Gojobori T , Ikemura T.Codon usage tabulated from inter-
national DNA sequence databases:status for the year 2000[ J] .Nucleic
acids research ,2000;28(1):292-292.
11　Colombo P , Kennedy D , Ramsdale T et al.Identif ication of an immun-
odominant IgE epitope of the Parietaria judaica major allergen[ J] .J Im-
munol , 1998;160(6):2780-2785.
12　Taverna S , Flugy A , Colomba P et al.Effects of Parietaria judaica pollen
extract on human microvascular endothelial cells[ J] .Biochemical and
Biophysical Research Communications ,2008;372(4):644-649.
13　曹　红 , 仇　燕 ,王　刚.外源基因在大肠杆菌中表达的优化
[ J] .河北师范大学学报:自然科学版 , 2004;28(1):82-85.
14　吴宪明 ,吴松锋 ,任大明 et al.密码子偏性的分析方法及相关研
究进展[ J] .HEREDITAS(Beijing), 2007;29(4):420-426.
15　徐　军 , 陈荣昌 , 钟南山.SARS 的临床免疫[ J] .中国免疫学杂
志 , 2003;19(6):370-371.
16　冉　波 ,邵明玉 ,张培因 et al.O 型口蹄疫病毒 VP1 表位重组蛋
白疫苗的构建 ,表达和纯化[ J] .免疫学杂志 , 2006;22(3):265-
268.
[收稿 2011-03-21　修回 2011-05-13]
(编辑　张晓舟)
·730· 中国免疫学杂志 2011年第 27卷